十棗湯凝膠膏劑處方藥味提取工藝優(yōu)化研究

黃 群，劉蔚雯，陳 丹

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122）

十棗湯是張仲景治療水飲、峻下逐水的代表方，主要由芫花、大戟、甘遂組成，配以10 枚大棗，方中芫花、大戟、甘遂為君藥，大棗為佐藥。大戟、甘遂、芫花3 味藥配伍用于攻逐水飲，因藥力過于峻猛，易傷脾胃，故用大棗相輔［1-2］，臨床上多用于治療胸腔積液和肝硬化腹水等疾病，功效甚佳，但內(nèi)服易傷脾胃。近年來，十棗湯外用貼敷劑在臨床上的應(yīng)用越來越廣泛［3-6］，多將十棗湯作為基礎(chǔ)方加減調(diào)配，飲片研磨成粉，用醋調(diào)成糊狀敷于患處。但該法需臨用前調(diào)制生藥，貼敷時(shí)黏性差、易污染衣物、易染菌。為改善患者臨床用藥的依從性，降低胃腸道的不良反應(yīng)，增加載藥量，提高治療效果，課題組將十棗湯改劑，研制經(jīng)皮給藥制劑十棗湯凝膠膏劑，外用貼敷于腧穴或患處。十棗湯中大戟、甘遂瀉水逐飲、消腫散結(jié)的主要藥效成分大戟二烯醇為三萜類化合物［7-9］，芫花的主要藥效成分芫花素為黃酮類化合物［10］。因此，本實(shí)驗(yàn)以芫花中芫花素、甘遂和大戟中大戟二烯醇含量結(jié)合得膏率作為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)十棗湯凝膠膏劑的處方藥味芫花、大戟及甘遂的提取工藝開展優(yōu)化研究，采用L9（34）正交試驗(yàn)法，考察提取溶劑、提取次數(shù)、提取時(shí)間及料液比4 個(gè)因素對(duì)提取工藝的影響，篩選適用于十棗湯凝膠膏劑處方藥味的最佳提取工藝，為后續(xù)凝膠膏劑的制備奠定原料基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-20AT 液相色譜儀、SPD-M20A 二極管陣列檢測(cè)器、CTO-20A 柱溫箱（日本島津公司）；NewclassicMF 十萬(wàn)分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；FA604N 型電子天平（上海精天電子儀器有限公司）；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國(guó)華電器有限公司）；KQ-500E 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；超純水儀（美國(guó)Millipore 公司）。

1.2 試藥 芫花飲片（產(chǎn)地安徽，批號(hào)：20190901）、甘遂飲片（產(chǎn)地安徽，批號(hào)：20190602）、京大戟飲片（產(chǎn)地江蘇，批號(hào)：20190901）均購(gòu)自安徽亳州藥材市場(chǎng)，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室車蘇容副教授鑒定，均符合2020 年版《中華人民共和國(guó)藥典（一部）》規(guī)定；大戟二烯醇對(duì)照品（成都普思生物科技股份有限公司，批號(hào)：PS010984，純度＞98%）；芫花素對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：R13A8F33981，純度＞98%）；甲醇（色譜純，批號(hào)：20200217）、乙腈（色譜純，批號(hào)：20200303）均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲酸（色譜純，上海麥克林生化有限公司，批號(hào)：64-18-6）；水為超純水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 十棗湯處方藥味的提取制備及得膏率計(jì)算 按處方量稱取芫花粗粉（過2 號(hào)篩）、甘遂中粉（過4 號(hào)篩）、京大戟中粉（過4 號(hào)篩）各等量，每份6 g，混勻，按照設(shè)定的提取次數(shù)、料液比、乙醇濃度、提取時(shí)間，加入適量提取溶劑乙醇，先浸泡0.5 h，再于80 ℃水浴中回流提取一定時(shí)間，提取2 次；合并各次提取濾液，將所得濾液減壓濃縮，至恒重，得十棗湯提取液浸膏。將十棗湯提取液浸膏置于105 ℃干燥箱中干燥3 h，再移至干燥器中冷卻0.5 h，快速精密稱定干膏重量，按2020 年版《中華人民共和國(guó)藥典（四部）》［11］中“0831”項(xiàng)下干燥失重法測(cè)定得膏率。

得膏率＝干膏質(zhì)量/飲片質(zhì)量×100%

2.2 提取液中多指標(biāo)成分的含量測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取芫花素對(duì)照品0.58 mg 置于10 mL 量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，制成濃度為0.058 mg/mL 的芫花素對(duì)照品溶液，備用。精密稱取大戟二烯醇對(duì)照品1.5 mg 置于10 mL 量瓶中，加入甲醇溶解并用甲醇稀釋至刻度，制成濃度為0.150 mg/mL 的大戟二烯醇對(duì)照品溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取按“2.1”項(xiàng)下制得的十棗湯提取液浸膏約1.00 g，置于25 mL 量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 精密稱取缺芫花處方藥味，按照“2.1”與“2.2.2”項(xiàng)下同法操作，制備缺芫花陰性對(duì)照溶液；精密稱取缺大戟和甘遂處方藥味，按照“2.1”與“2.2.2”項(xiàng)下同法操作，制備缺大戟和甘遂陰性對(duì)照溶液。

2.2.4 芫花素色譜條件 Dimonsil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇∶0.8 %冰醋酸＝65∶35；流速 1 mL/min；柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)338 nm。

2.2.5 大戟二烯醇色譜條件 Neptune C8色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈∶0.1 %甲酸＝86∶14；流速 1 mL/min；柱溫為30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。

2.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及線性關(guān)系的考察 分別精密吸取芫花素對(duì)照品溶液4、6、8、10、12、15 μL，按“2.2.4”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以芫花素色譜峰的峰面積（Y1）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（X1）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明：芫花素在0.058～2.900 μg 濃度范圍呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y1＝6.886 0×106X1＋1.080 4×105（r＝0.999 9）。分別精密吸取大戟二烯醇對(duì)照品溶液8、10、12、14、16、18 μL，按“2.2.5”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以大戟二烯醇色譜峰的峰面積（Y2）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（X2）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明：大戟二烯醇在0.150～7.500 μg 濃度范圍呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y2＝2.133 5×105X2－7.616 6×10（3r＝0.999 9）。

2.2.7 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取芫花素對(duì)照品溶液、供試品溶液和缺芫花陰性對(duì)照溶液各10 μL，按“2.2.4”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果見圖1。分別精密吸取大戟二烯醇對(duì)照品溶液、供試品溶液和缺大戟和甘遂陰性對(duì)照溶液各10 μL，按“2.2.5”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果見圖2。結(jié)果表明：陰性對(duì)照無干擾，方法專屬性良好。

圖1 十棗湯提取液中芫花素的高效液相色譜圖

圖2 十棗湯提取液中大戟二烯醇的高效液相色譜圖

2.2.8 精密度試驗(yàn) 精密吸取芫花素對(duì)照品溶液，按“2.2.4”項(xiàng)下色譜條件，分別連續(xù)進(jìn)樣10 μL 測(cè)定6 次，計(jì)算得芫花素峰面積的RSD 為0.312 %；精密吸取大戟二烯醇對(duì)照品溶液，按“2.2.5”項(xiàng)下色譜條件，分別連續(xù)進(jìn)樣10 μL 測(cè)定6 次，計(jì)算得大戟二烯醇峰面積的RSD 為1.04%。結(jié)果表明：儀器精密度良好。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 分別平行制備6 份供試品溶液，分別按照“2.2.4”與“2.2.5”項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣供試品溶液、對(duì)照品溶液各10 μL 測(cè)定，計(jì)算。結(jié)果表明：芫花素含量的RSD 值為0.518%，大戟二烯醇含量的RSD值為3.492%，說明方法重復(fù)性良好。

2.2.10 穩(wěn)定性性試驗(yàn) 取供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12 h 按照“2.2.4”與“2.2.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μL 測(cè)定，計(jì)算。結(jié)果表明：芫花素含量的RSD 值為0.31%，大戟二烯醇含量的RSD 值為1.81%，說明供試品溶液12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.11 加樣回收率試驗(yàn) 分別精密稱取6 份十棗湯提取液浸膏約0.50g，分別加入芫花素對(duì)照品溶液1 mL（濃度0.177 6 mg/mL）、大戟二烯醇對(duì)照品溶液3 mL（濃度0.152 0 mg/mL），制備供試品溶液，分別按照“2.2.4”與“2.2.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μL測(cè)定，計(jì)算。結(jié)果表明：芫花素平均回收率為96.73%，RSD 為 1.37%（n＝6）；大戟二烯醇平均回收率為99.03%，RSD為2.67%（n＝6），說明方法準(zhǔn)確度較高。

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化十棗湯提取工藝

2.3.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)和單因素試驗(yàn)考察結(jié)果，提取溫度為80 ℃時(shí)提取效率較高，提取溶劑乙醇的濃度（A）、料液比（B）、提取時(shí)間（C）、提取次數(shù)（D）4 個(gè)因素為提取工藝的主要影響因素，故實(shí)驗(yàn)采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)因素選取3 個(gè)水平，以提取液中芫花素和大戟二烯醇含量結(jié)合得膏率作為綜合考察指標(biāo)，優(yōu)選最佳十棗湯提取工藝。正交試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

2.3.2 正交實(shí)驗(yàn)樣品的制備 按處方量分別稱取芫花、甘遂、大戟各2 g，共9 份，分別按“2.1”項(xiàng)下同法提取十棗湯凝膠膏劑處方藥味，并制成提取液浸膏；分別按“2.2”項(xiàng)下HPLC 法測(cè)定芫花素和大戟二烯醇的含量。綜合評(píng)分（Y）＝Y(jié)1＋Y2＋Y3，其中設(shè)定權(quán)重計(jì)算Y1＝（20/最大得膏率）×得膏率（X1），Y2＝（40/最大大戟二烯醇含量）×大戟二烯醇含量（X2），Y3＝（40/最大芫花素含量）×芫花素含量（X3）。結(jié)果見表2、表3。

表2 十棗湯提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

2.3.3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析 表2 直觀分析結(jié)果顯示：4 個(gè)因素對(duì)十棗湯提取結(jié)果影響大小依次為：A＞B＞C＞D，即乙醇濃度＞料液比＞提取時(shí)間＞提取次數(shù)，且 A1＞A2＞A3，B1＞B2＞B3，C3＞C2＞C1，D2＞D3＞D1，故最佳提取工藝是A1B1C3D2。表3 方差分析結(jié)果表明：因素A 乙醇濃度對(duì)芫花素和大戟二烯醇含量有顯著性影響（F＝51.34，P＜0.05），料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），因此，優(yōu)化篩選的提取工藝為A1B1C3D2。綜合考慮提取效率、降低成本等因素，確定最佳提取工藝為：取處方藥味飲片適量，按料液比1∶6，用85%乙醇為溶劑，浸泡0.5 h，于80 ℃下回流提取2 次，提取時(shí)間每次1.0 h，提取液壓榨過濾，合并2 次濾液，減壓濃縮，制成浸膏。

2.3.4 提取工藝驗(yàn)證 分別稱取處方量的飲片各3 份，平行試驗(yàn)3 批，按照正交試驗(yàn)優(yōu)選的最佳工藝提取，即按料液比1∶6，加85%乙醇提取溶劑，浸泡0.5 h 后，80 ℃回流提取 2 次，每次 1.0 h，過濾，濃縮，制成浸膏。精密稱取浸膏，每批分別按“2.3.2”項(xiàng)下同法平行測(cè)定3 次，計(jì)算得膏率、提取液中芫花素及大戟二烯醇含量，按“2.3.2”項(xiàng)下公式計(jì)算綜合評(píng)分。最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明：該提取工藝綜合評(píng)分在95.89～99.10 分，RSD＝1.82%～2.43%，說明優(yōu)化的最佳提取工藝穩(wěn)定、可行，適用于十棗湯凝膠膏劑處方藥味的提取。結(jié)果見表4。

表4 最佳提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

3.1 提取溶劑及提取方法的選擇 十棗湯處方藥味芫花含有以芫花素為代表的黃酮類化合物，難溶于水，易溶于甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑中，大戟和甘遂主要含有以大戟二烯醇為代表的萜類化合物，難溶于水，易溶于甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑，故基于主要有效成分的溶解特性及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇價(jià)廉易得且相對(duì)安全的乙醇為提取溶劑。預(yù)實(shí)驗(yàn)曾比較了超聲提取與傳統(tǒng)的加熱回流提取法，后者提取液的主要有效成分含量更高，相對(duì)提取效率較高，在中藥材提取中應(yīng)用也較多，故選用乙醇為溶劑、加熱回流提取十棗湯中的有效成分。

3.2 正交試驗(yàn)評(píng)價(jià)指標(biāo)的選擇 經(jīng)典名方十棗湯方中芫花、大戟、甘遂均為君藥。2020 年版《中華人民共和國(guó)藥典（一部）》規(guī)定芫花項(xiàng)下含量測(cè)定成分為芫花素，京大戟和甘遂項(xiàng)下含量測(cè)定成分為大戟二烯醇［12］，故實(shí)驗(yàn)采用HPLC 法測(cè)定十棗湯凝膠膏劑處方藥味提取液中芫花素及大戟二烯醇的含量作為提取效率評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)權(quán)重各占40%。此外，考慮到中藥提取液濃縮至浸膏對(duì)提取效率也具有一定的意義，提取得膏率可以反映中藥提取是否完全，與制劑質(zhì)量有密切關(guān)系，故將得膏率權(quán)重設(shè)為20%。實(shí)驗(yàn)通過芫花素、大戟二烯醇含量結(jié)合得膏率作為正交試驗(yàn)的綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，較為全面地考察優(yōu)化提取工藝，確保十棗湯凝膠膏劑原料的質(zhì)量［13］。

3.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，飲片經(jīng)浸泡后提取效率較佳，浸泡0.5 h 和1 h 提取效率無差異，故選擇浸泡0.5 h 后提取。單因素試驗(yàn)曾分別考察了不同濃度乙醇提取溶劑、提取次數(shù)、不同料液比、提取時(shí)間、提取溫度等對(duì)提取效率的影響，結(jié)果表明提取溫度80 ℃時(shí)綜合分值最佳；而乙醇濃度、料液比、提取次數(shù)、提取時(shí)間是提取效率的較重要的影響因素，故實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以這4 個(gè)因素為變量，開展四因素三水平正交試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化提取工藝。結(jié)果顯示：十棗湯凝膠膏劑處方藥味飲片最佳提取工藝為取處方飲片適量，以85%乙醇按料液比1∶6，浸泡 0.5 h 后，于 80 ℃下回流提取 2 次，每次1.0 h，提取液過濾、濃縮制成浸膏。經(jīng)工藝驗(yàn)證，優(yōu)化的提取工藝操作簡(jiǎn)單，方法穩(wěn)定可行，適用于十棗湯凝膠膏劑處方藥味的提取，并為后續(xù)十棗湯凝膠膏劑的原料生產(chǎn)奠定了可靠的基礎(chǔ)。