正交試驗與單因子雙重試驗法優(yōu)化玉米PCR反應(yīng)體系

江常勝，朱洪海，鐘永麗，劉明曉，東 方

（中禾生物種業(yè)集團有限公司，廣東 深圳 518000）

玉米（Zea mays L.）屬禾本科一年生高大草本植物，又名苞米、玉蜀黍和包谷等，是世界三大糧食作物之一。玉米起源于美洲大陸，自古以來，人們通過人工馴化，雜交育種及現(xiàn)代生物學的方式對玉米品種不斷進行改良，玉米逐漸形成了適宜生產(chǎn)需求的品種體系，其栽種范圍也遍布全球各地。玉米是重要的農(nóng)業(yè)作物，可作為糧食，同時也可做飼料加工，供畜牧業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)使用[1]，并且玉米在工業(yè)、醫(yī)學等各個領(lǐng)域都有用途。因此，對玉米品種的改良一直是育種家們關(guān)注的問題。

分子育種就是在傳統(tǒng)育種的基礎(chǔ)之上，結(jié)合分子生物技術(shù)發(fā)展起來的一種現(xiàn)代育種方法。PCR（Polymerase Chain Reaction）技術(shù)是分子育種中一項重要的技術(shù)手段[2]，其對分子育種工作有著極大的幫助作用。PCR（Polymerase Chain Reaction）又稱聚合酶鏈式反應(yīng)，是指在DNA聚合酶催化作用下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點，通過變性、退火和延伸等步驟，體外復制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA的過程[3]。其原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列2端互補的寡核苷酸引物。PCR技術(shù)在基因分離克隆、序列分析、基因表達調(diào)控和基因多態(tài)性研究等許多方面有極其重要的作用[4]。目前，PCR技術(shù)在分子育種中被廣泛應(yīng)用，且相關(guān)方法和技術(shù)已經(jīng)相當成熟。但基于不同基因組，不同研究方向的PCR應(yīng)用仍需根據(jù)實際情況進行摸索，才能探索出適用于不同研究需要的最佳PCR反應(yīng)體系。所以，在課題試驗中，先建立起一種優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系很有必要。本研究是在玉米抗絲黑穗病品種改良的研究課題中，探索適用于試驗材料基因組的PCR最佳反應(yīng)體系。采用正交試驗與單因子雙重試驗法對PCR反應(yīng)條件中主要因子（引物用量、模板DNA、模板DNA質(zhì)量濃度和退火溫度）進行優(yōu)化分析，探索出了一套穩(wěn)定性強、重復性好、擴增質(zhì)量高且適用于大批量玉米種質(zhì)材料PCR分析的優(yōu)化反應(yīng)體系，獲得了能夠滿足后續(xù)科研工作的DNA擴增產(chǎn)物。

1 材料與方法

1.1 供試材料、試劑與儀器

1.1.1 供試材料

本試驗所用玉米材料均來自深圳市大鵬新區(qū)華大基因試驗基地，為抗絲黑穗病品種改良試驗Q41的回交二代。在Q41的回交二代群體中預(yù)選6株材料（①-1、①-5、②-2、③-6、③-7和③-8）提取DNA，在其中選取DNA質(zhì)量較好的4株材料做試驗材料。

1.1.2 主要試劑與儀器

試劑：CTAB提取液、三氯甲烷、異戊醇、乙醇、2×Easy－TaqRPCR SuperMix、ddH2O、瓊脂和1×TAE電泳緩沖液。

儀器：TC1000-G PCR儀、低速離心機、高速冷凍離心機、B-500超微量分光光度計、震蕩研磨儀、UVP紫外凝膠成像系統(tǒng)、生物保存冰箱、移液槍、水平電泳儀和制冰機等。

1.2 試驗設(shè)計與方法

1.2.1 模板DNA的提取

本次試驗的材料均在試驗田現(xiàn)場采取，取用玉米葉片幼嫩部位，用剪刀剪下后編號放入塑封袋，置于冰盒（冰盒提前放置冰和生物冰袋）冷凍保存，樣品帶回實驗室后如果不能立即進行DNA提取操作，則保存于-80℃冰箱內(nèi)，用時取出。DNA提取采用改良CTAB快速提取法，具體方法如下：①用打孔器在葉片上取下3片大小均一的葉片組織，裝入預(yù)先做好編號的2 mL離心管中（離心管置于冰上），每個離心管中放入直徑3 mm的鋼珠2粒[5]，在通風櫥內(nèi)加入600 μL的CTAB提取液，蓋緊蓋子。②將離心管對稱放入研磨儀支架孔中，蓋上上蓋并旋緊螺母，在40 Hz頻率下震蕩研磨75 s，輕輕顛倒離心管將研磨物混勻，重復1次。③取出離心管（研磨物呈勻漿狀），于通風櫥中加入600 μL的三氯甲烷∶異戊醇（24∶1），混勻[5]，室溫靜置10min。④12000r/min離心10 min，用移液槍將上清轉(zhuǎn)移至1.5 mL預(yù)先做好編號的離心管（注意不要吸到中間層），加等體積無水乙醇，沉淀DNA[6]。⑤12 000 r/min離心5 min，棄上清，加75%乙醇洗滌。12 000 r/min離心2 min，棄上清，離心管管口朝下放置，室溫晾干沉淀，加50 μLddH2O溶解DNA，低溫保存[7]。

1.2.2 模板DNA質(zhì)量檢測

用超微量分光光度計對DNA純度和質(zhì)量濃度進行檢測；制作瓊脂糖凝膠，模板DNA的電泳結(jié)果如圖1所示。

圖1 模板DNA的電泳結(jié)果

對DNA紫外分光光度和瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果分析：1、3、4、5這4個泳道的DNA樣品條帶較為清晰，且無雜帶、拖帶現(xiàn)象。結(jié)合超微量紫外分光光度計的檢測，①-1、②-2、③-6和③-7這4個DNA樣品雜質(zhì)少，質(zhì)量較高，能滿足試驗需求，所以最終確定以①-1、②-2、③-6和③-7這4個DNA樣品為后續(xù)試驗材料。

1.2.3 PCR反應(yīng)體系試驗設(shè)計

采用L1（643）正交試驗設(shè)計，對影響PCR反應(yīng)的3個因子：引物用量、模板DNA和模板質(zhì)量濃度進行3因素4水平篩選，各組分的因素水平見表1。反應(yīng)體系總體積為10 μL，其中含5 μL2×EasyTaqRPCR SuperMix（含EasyTaqRDNA Polymerase、dNTPs）、引物和1 μL模板DNA，其他各組分按照表2加入，不足體積以ddH2O補足[8]。

表1 正交試驗設(shè)計因素及其水平

表2 L1（643）正交試驗?設(shè)計表

1.2.4 PCR擴增程序及擴增產(chǎn)物的檢測

PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s；56℃退火30 s；72℃延伸2 min；32個循環(huán)；72℃延伸10 min，12℃保存[9]。

按照正交試驗表配置反應(yīng)體系，配置好后的體系分裝于PCR八連管中，蓋好PCR八連管上蓋，放入設(shè)置好擴增程序的PCR儀中進行擴增，擴增結(jié)束后，取出擴增產(chǎn)物低溫保存?zhèn)溆?。制?%的瓊脂糖凝膠，加入染液。待凝膠凝固后放入電泳槽[4]，取5 μL擴增產(chǎn)物點樣電泳。電泳30～40 min后取出凝膠在UVP紫外凝膠成像系統(tǒng)上觀測并拍照。

1.2.5 退火溫度試驗優(yōu)化

采用最優(yōu)體系對退火溫度進行梯度試驗。溫度取值在50.0～65.0℃范圍內(nèi)，在PCR儀上進行設(shè)置，設(shè)置好后PCR儀自動生成8個梯度溫度（T1～T8），分別為50.0℃、52.0℃、54.9℃、56.6℃、58.3℃、60.0℃、63.0℃和65.0℃。擴增程序的預(yù)變性、變性、延伸的溫度與時間及循環(huán)數(shù)與正交試驗設(shè)計的設(shè)定相同。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR正交試驗設(shè)計結(jié)果的直觀分析

玉米PCR體系優(yōu)化正交試驗設(shè)計的結(jié)果如圖2所示，根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳圖中譜帶強弱及清晰度進行分析，條帶分析按照條帶強且清晰、無拖帶、雜帶少或無為指標[10-11，5]。因正交試驗設(shè)計具有均衡分散的特點，PCR反應(yīng)體系中各個試驗組分的組合彼此不同，因此擴增結(jié)果具有明顯的差異。從圖中可以看出，1、2、9、13、14、15號組合條帶微弱模糊；3、4、7、10、11、12號組合條帶明顯，且無拖帶現(xiàn)象，其中4號組合條帶最亮，效果最好；5、6、8、16號組合有條帶產(chǎn)生，但亮度一般，說明擴增效果也一般。綜上所述，4號組合的擴增結(jié)果最好，即4號組合的模板DNA質(zhì)量濃度與引物用量為最優(yōu)選。因此，本次試驗結(jié)果認為10 μL的PCR的最優(yōu)反應(yīng)體系條件組合應(yīng)為引物0.25 μL、模板質(zhì)量濃度40 ng/μL。

圖2 玉米PCR體系優(yōu)化正交試驗設(shè)計結(jié)果

2.2 退火溫度試驗優(yōu)化結(jié)果分析

采用最優(yōu)組合對退火溫度的優(yōu)化試驗結(jié)果如圖3所示，根據(jù)直觀觀察發(fā)現(xiàn)，各個溫度梯度條件下均可擴增出條帶，但不同溫度梯度的PCR擴增結(jié)果存在差異。結(jié)果表明：退火溫度的高低直接影響到引物與模板DNA的特異性結(jié)合和擴增條帶的樣式，擴增結(jié)果隨溫度梯度變化差異顯著。在T1（50.0℃）溫度條件下，觀察不到明顯條帶；在T2～T5（52.0～58.3℃）溫度條件下，均有條帶產(chǎn)生，但條帶亮度呈現(xiàn)先亮后弱的趨勢，其中在溫度為T4（56.6℃）時條帶最為清晰明亮，說明此溫度下擴增效果最好；在溫度條件為T6～T8（60.0～65.0℃）時，擴增條帶極其微弱，基本無法觀察，說明超過60.0℃的退火溫度并不適合玉米PCR反應(yīng)體系。綜上所述，在50.0～65.0℃退火溫度范圍內(nèi)，最適于玉米PCR反應(yīng)體系的退火溫度為56.6℃。

圖3 最優(yōu)組合下退火溫度優(yōu)化試驗結(jié)果

3 討論

實踐表明，PCR反應(yīng)容易受到各種因素的影響[12]，擴增條件的變化對PCR的擴增結(jié)果影響較大，并且直接影響到PCR分析的準確性和可靠性。PCR譜帶的準確性與穩(wěn)定性是應(yīng)用PCR技術(shù)進行遺傳多樣性分析的前提條件[13]。因此，為了獲得準確而穩(wěn)定的PCR譜帶，在對不同物種甚至同一物種不同種質(zhì)材料之間進行PCR分析之前，消耗適當?shù)臅r間與精力尋求最適宜的PCR擴增條件十分必要。

為了解決準確性與穩(wěn)定性的問題，絕大部分研究者均是在對大批量樣品進行PCR擴增之前，先采用單因子雙重試驗法對PCR試驗條件進行優(yōu)化[14]。但是，單因子雙重試驗法并沒有考慮到各種影響因子之間可能存在的交互作用。而且，在進行優(yōu)化試驗的過程中，前一個供試因素在一定水平范圍內(nèi)擴增出來的條帶數(shù)和清晰度有可能完全一致[7]，在選擇該因素的某一水平作為后續(xù)供試因素之優(yōu)化試驗的條件時，就可能存在一定的主觀性。因此，本次試驗在方法上采用正交試驗的方法，先探索出最佳的引物－模板體系，然后結(jié)合單因子雙重試驗方法，進而篩選出最佳退火溫度。

試驗中發(fā)現(xiàn)玉米的PCR擴增譜帶出現(xiàn)了引物二聚體，引物二聚體的出現(xiàn)在PCR中是必然的，只是或多或少的問題，其最主要還是受引物設(shè)計本身的影響。因此，優(yōu)化引物設(shè)計可大大降低引物二聚體現(xiàn)象出現(xiàn)的概率[15]。其次，在PCR體系配置過程中，體系在室溫條件下放置過久也會導致引物二聚體的出現(xiàn)，所以，PCR體系的配置應(yīng)在冰上進行。作為試驗操作者，也要提高操作熟練度。

4 結(jié)論

本次試驗以4個玉米材料基因組DNA為模板，先采用正交試驗設(shè)計的方法，對引物用量、模板DNA質(zhì)量濃度進行優(yōu)化[16]，對正交試驗設(shè)16個組合的PCR擴增結(jié)果進行分析，確定了最佳的引物用量與模板DNA質(zhì)量濃度，篩選出一種適用性較廣且擴增結(jié)果優(yōu)良穩(wěn)定的10 μL的PCR反應(yīng)體系：5 μL2×EasyTaqRPCR Super－Mix（含EasyTaqRDNA Polymerase、dNTPs）、引物0.25 μL和1 μL40 ng/μL模板DNA，體系其余部分以ddH2O補足。隨后，采用單因子雙重試驗法，在50.0～65.0℃范圍內(nèi)探索退火溫度條件，以最佳體系對退火溫度進行優(yōu)化，最終確定了玉米PCR反應(yīng)的最佳退火溫度為56.6℃。

在玉米分子育種的過程中，選擇一種合適的PCR反應(yīng)體系尤為重要。由于育種材料群體數(shù)量較大，而且不同的基因組之間反應(yīng)體系往往也存在著差異[17]，所以構(gòu)建一種適用性廣、擴增結(jié)果優(yōu)良且穩(wěn)定的PCR反應(yīng)體系是進行后續(xù)育種工作的前提。本次試驗成功探索出了玉米抗絲黑穗病品種改良回交群體的PCR最佳反應(yīng)體系，且在后續(xù)的育種工作中，采用這種PCR反應(yīng)體系的效果甚好。本次試驗所建立的PCR反應(yīng)穩(wěn)定體系為玉米品種鑒定、分子育種、遺傳作圖和遺傳多樣性研究等奠定了基礎(chǔ)。