四神丸對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠IL-6/STAT3信號通路及Th1/Th2免疫軸平衡的影響

王盈蘊，王燕，朱向東，李潔，梁永林*

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅蘭州 730000；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏銀川 750004）

0 引言

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerativecolitis，UC）是一種以結(jié)腸粘膜慢性特發(fā)性炎癥為特征的炎癥性腸病（inflammatoryboweldisease，IBD），病位起始端在直腸，并會延伸，末端可至結(jié)腸近端[1]。腹瀉、腹痛、大便里急后重并出現(xiàn)黏液膿血便等是UC的典型表現(xiàn)[2]?，F(xiàn)今，UC具體的發(fā)病機制尚不清楚，但已證實與免疫反應(yīng)缺陷、腸道菌群改變、遺傳易感性和環(huán)境因素等有關(guān)[3]。UC臨床常用的治療藥物包括氨基水楊酸、硫唑嘌呤和皮質(zhì)類固醇等[4,5]，但這些藥物往往會導(dǎo)致不同的副作用，如出現(xiàn)腎毒性，在長期治療期間降低了患者的生活質(zhì)量[6,7]。在此背景下，中醫(yī)藥在UC治療中的作用受到廣泛關(guān)注。四神丸最早記載于《陳氏小兒痘疹方論》中，由補骨脂、吳茱萸、肉豆蔻、五味子，加生姜、大棗組成[8]。越來越多的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)表明[9]，四神丸治療IBD療效良好，204例IBD患者總有效率可達到75.98%。本實驗旨在探討在脾腎陽虛型UC大鼠模型中四神丸對白介素（IL）-6/信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）信號通路及輔助性T細胞（Th）1/Th2免疫軸平衡的影響。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級SD大鼠120只，雌雄各半，平均體質(zhì)量(200±20)g，購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實驗動物中心，動物合格證號與許可證號分別為SCXK（甘）2020-0001、SYXK（甘）2020-0009。大鼠飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心的SPF級屏障實驗室中，溫度為(23±2)℃，相對濕度(55±5)%，噪聲＜50dB。

1.2 藥品與試劑

四神丸飲片（補骨脂、吳茱萸、肉豆蔻、五味子、生姜、大棗生藥量比例為4∶1∶2∶2∶2∶2）及番瀉葉飲片均購自于蘭州惠仁堂大藥房，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)楊扶德教授鑒定為正品。美沙拉秦緩釋顆粒（上海愛的發(fā)制藥有限公司，規(guī)格0.5g/袋，批號200707，國藥準(zhǔn)字H20143164）。氫化可的松注射液（國藥集團容生制藥有限公司，規(guī)格2mL：10mg，批號2008202，國藥準(zhǔn)字H20023069）；二硝基苯磺酸鹽（DNBS）（德國Sigma公司，批號STBH1899）；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號G1080）；鼠IL-6 酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒，鼠IL-10 ELISA試劑盒（江蘇菲亞公司，批號分別為2105R81，2105R84）；STAT3抗體，TGF-β抗體，PPARγ抗體（英國Abcam公司，批號分別為ab68153，ab215715，ab209350）；p-STAT3抗體（美國CST公司，批號9145S）；CD3抗體（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號E-ABF1228S）；CD4抗體，IFN-γ抗體，IL-4抗體（美國Biolegend公司，批號分別為201505，507809，511905）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，qPCR試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司，批號分別為：H1125080，H4104620）；兔SP試劑盒（中杉金橋公司，批號SP-9001)。

1.3 儀器

IX51型顯微鏡（日本Olympus公司）；RM2245型切片機（德國LEICA公司）；Arcadia H型包埋機（德國LEICA公司）；C1000熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）；IMARKMini Protean酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）。

2 實驗方法

2.1 造模與給藥

將所有大鼠隨機分為空白組，模型組，四神丸低、中、高劑量組及美沙拉秦組，每組10只。采用病證結(jié)合法[10]，將大鼠進行番瀉葉灌胃（10mL/kg），配合氫化可的松皮下注射（15mg/kg），1次/d，連續(xù)21d。21天后，禁食不禁水24小時，腹腔注射2%戊巴比妥鈉（0.2 mL/100g）進行麻醉。將DNBS/乙醇溶液（100 mg/kgDNBS+1mL/kg50%乙醇）快速注入至肛門內(nèi)8cm的深度，再注入約0.4mL的空氣，捏緊肛門，將大鼠倒立1min，防止藥液流出。造模成功后，根據(jù)人和大鼠的體表面積換算給藥劑量，四神丸低、中、高劑量組灌胃量分別為含生藥量6、12、24 g/kg，美沙拉秦組為0.36g/kg，灌胃體積為1mL/100g[11]?？瞻捉M和模型組灌服等體積蒸餾水。各組灌胃1次/d，連續(xù)21d。

2.2 標(biāo)本采集

末次給藥后，用2%戊巴比妥鈉進行腹腔注射麻醉，取血后頸椎脫臼法處死大鼠。留取結(jié)腸組織，一部分結(jié)腸固定在4%的多聚甲醛中，用于HE染色和免疫組化檢測；一部分結(jié)腸組織用生理鹽水浸泡并立即用于流式細胞術(shù)檢測；一部分組織置于凍存管中在-80℃冰箱放置，用于RT-PCR檢測。

2.3 HE染色觀察結(jié)腸組織病理學(xué)變化

將固定在4%多聚甲醛中的結(jié)腸組織取出，進行沖洗，乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，染色，顯微鏡下拍照觀察結(jié)腸組織變化。

2.4 流式細胞術(shù)檢測大鼠結(jié)腸組織中Th1細胞及Th2細胞比例

將結(jié)腸組織磨碎，制備單細胞懸液，放入離心機中離心，加入PBS液重懸。選擇適量CD3抗體和IFN-γ抗體（Th1細胞）及適量CD4和IL-4抗體（Th2細胞），加入免疫細胞活化試劑刺激細胞，加入細胞固定破膜液，染色，設(shè)置同型對照實驗，新鮮標(biāo)本盡快用流式細胞儀上機檢測。

2.5 ELISA檢測大鼠血清中IL-6、IL-10因子的含量

使用ELISA檢測血清IL-6、IL-10水平，全部操作按照試劑盒說明完成。

2.6 免疫組化法檢測STAT3、p-STAT3、TGF-β1、PPARγ蛋白表達

取結(jié)腸組織切片，常規(guī)脫蠟及水化后，PBS清洗，用檸檬酸鈉熱修復(fù)兩次，加入3%的過氧化氫孵育，滴加第一抗體（1∶200），濕盒4℃冰箱過夜后，加入相應(yīng)二抗，室溫孵育，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，返藍，中性樹脂封片。運用使用Pannoramicviewer及Quant center軟件進行觀察及分析。

2.7 RT-PCR法檢測STAT3、TGF-β1、PPARγmRNA基因表達

取結(jié)腸組織勻漿后提取總RNA，并按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行后續(xù)操作，運用RTPCR儀進行檢測，使用2-ΔΔCT方法計算RNA相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物名稱及序列表

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法

全部資料用SPSS23.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以（±s）表示，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)性和方差齊性，組間比較用單因素方差分析。方差齊時組間比較采用LSD檢驗方法，方差不齊時選用Tamhane'sT2檢驗方法。

3 結(jié)果

3.1 結(jié)腸組織病理學(xué)改變

空白組中結(jié)腸組織染色均勻，結(jié)構(gòu)清晰可見，腸粘膜排列整齊，腺體分布均勻。與空白組比較，模型組結(jié)腸損傷嚴(yán)重，腸粘膜消失，腺體結(jié)構(gòu)破壞，可見大量的炎性細胞。與模型組比較，四神丸組及美沙拉秦組結(jié)腸損傷程度、腸粘膜及腺體結(jié)構(gòu)破壞程度呈劑量依賴性減輕，炎性細胞呈劑量依賴性減少，其中高劑量組和美沙拉秦組效果最好。見圖1。

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)（×40，×100）

3.2 大鼠結(jié)腸組織中Th1細胞及Th2細胞的比例

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織中Th1細胞比例顯著升高（P ＜0.01）；Th2細胞比例顯著降低（P ＜0.01）。與模型組比較，各治療組大鼠結(jié)腸組織中Th1細胞比例顯著降低（P ＜0.05，P ＜0.0 1）；四神丸中、高劑量組及美沙拉秦組大鼠結(jié)腸組織中Th2細胞比例顯著升高（P ＜0.01）。四神丸高劑量組與美沙拉秦組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖2-1，2-2，表2。

表2 信息文四摘神丸對UC 大鼠結(jié)腸組織中Th1和Th2細胞比例變化的影響（ ±s，n=6）

表2 信息文四摘神丸對UC 大鼠結(jié)腸組織中Th1和Th2細胞比例變化的影響（ ±s，n=6）

注：與空白組比較：★P＜0.05，★★P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01；與美沙拉秦組比較：◆◆P＜0.01，K.空白組 M.模型組 D.四神丸低劑量組 Z.四神丸中劑量組 G.四神丸高劑量組 Y.美沙拉秦組

續(xù)型電子期刊期刊之一組別Th1（%）Th2（%）空白組1.08±0.363.46±0.18模型組8.24±0.17**0.96±0.19**四神丸低劑量組6.79±1.04**#◆◆1.12±0.15**◆◆四神丸中劑量組4.99±0.7**##◆◆1.97±0.15**##◆◆四神丸高劑量組2.91±0.63**##2.95±0.27*##美沙拉秦組2.13±0.34##3.07±0.34##· 中國學(xué)術(shù)期刊綜合評價數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計源期刊據(jù)庫收錄期刊情況

圖2 -2四神丸對UC大鼠結(jié)腸組織中Th2細胞的比例的影響

圖2 -1四神丸對UC大鼠結(jié)腸組織中Th1細胞的比例的影響

3.3 大鼠血清中IL-6、IL-10含量的比較

與空白組比較，模型組大鼠血清中IL-6含量顯著升高（P ＜0.01）；IL-10含量顯著降低（P ＜0.01）。與模型組比較，各治療組大鼠血清中IL-6含量顯著降低（P ＜0.01），四神丸高劑量組及美沙拉秦組血清中IL-10含量顯著增加（P ＜0.01），且呈劑量依賴性改變，其中以四神丸高劑量組及美沙拉秦組最為顯著，兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表3。

表3 四神丸對UC 大鼠血清中IL-6、IL-10因子水平的影響（ ±s，n=6）

注：與空白組比較：★P＜0.05，★★P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01；與美沙拉秦組比較：◆◆P＜0.01

組別IL-6ng/LIL-10 ng/L空白組55.62±9.302233.01±40.71模型組219.12±13.85**24.81±13.9**四神丸低劑量組181.3±11.12**##◆◆30.87±45.04**◆◆四神丸中劑量組147.11±8.11**##◆◆46.93±75.51**◆◆四神丸高劑量組101.68±13.87**##121..95±28.89**##美沙拉秦組88.86±19.32**##134.67±43.25**##

3.4 結(jié)腸組織中STAT3、p-STAT3、TGF-β1、PPARγ蛋白表達的變化

與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織中S T A T 3、p-S T A T 3 蛋白表達顯著升高（P ＜0.01）；TGF-β1、PPARγ蛋白表達顯著降低（P ＜0.0 1）。與模型組比較，各治療組STAT3、p-STAT3蛋白表達顯著降低（P ＜0.0 1），四神丸組呈劑量依賴性降低；TGF-β1、PPARγ蛋白表達顯著升高（P ＜0.05，P ＜0.01），四神丸組呈劑量依賴性升高。其中，以四神丸高劑量組與美沙拉秦組最為顯著，兩組中STAT3、TGF-β1、PPARγ蛋白表達無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖3，表4。

表4 各組大鼠結(jié)腸組織STAT3、p-STAT3、TGF-β1、PPARγ蛋白表達的影響（±s）

表4 各組大鼠結(jié)腸組織STAT3、p-STAT3、TGF-β1、PPARγ蛋白表達的影響（±s）

注：與空白組比較：★P＜0.05，★★P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01；與美沙拉秦組比較：◆◆P＜0.01

STAT3p-STAT3TGF-β1PPARγ空白組1.00±0.151.00±0.161.00±0.091.00±0.08模型組 5.87±0.48**10.95±0.90**0.17±0.02**0.13±0.02**四神丸低劑量組 4.69±0.03**##◆◆8.53±0.92**##◆◆0.28±0.02**#◆◆0.29±0.05**#◆◆四神丸中劑量組 3.40±0.42**##◆◆6.75±0.70**##◆◆0.36±0.02**##◆◆0.43±0.07**##◆◆四神丸高劑量組2.03±0.27**##4.62±0.57**##◆◆0.75±0.09**##0.64±0.07**##美沙拉秦組2.03±0.18**##2.70±0.48**##0.77±0.07**##0.69±0.06**##

圖3 各組大鼠結(jié)腸組織中相關(guān)蛋白的表達情況（×200）

3.5 結(jié)腸組織中STAT3、TGF-β、PPARγ mRNA相對表達量的變化

與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織中S T A T 3m R N A 的表達量顯著升高（P ＜0.01），TGF-β1、PPARγmRNA的表達量顯著降低（P ＜0.0 1）。與模型組比較，各治療組大鼠結(jié)腸組織中STAT3mRNA的表達量顯著降低（P ＜0.05，P ＜0.01）；四神丸中、高劑量組和美沙拉秦組大鼠結(jié)腸組織中TGF-β1mRNA的表達量顯著降低（P ＜0.05，P ＜0.01）；四神丸高劑量組和美沙拉秦組中PPARγmRNA的表達量顯著升高（P ＜0.01）。四神丸高劑量組與美沙拉秦組之間的基因表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表5。

表5 四神丸對UC大鼠結(jié)腸組織中STAT3、TGF-β1、PPARγ基因表達的影響（±s，n=6）

表5 四神丸對UC大鼠結(jié)腸組織中STAT3、TGF-β1、PPARγ基因表達的影響（±s，n=6）

注：與空白組比較：★P＜0.05，★★P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01；與美沙拉秦組比較：◆P＜0.05，◆◆P＜0.01

組別STAT3TGF-β1PPARγ空白組1.00±0.001.00±0.001.00±0.00模型組1.99±0.07** 0.35±0.04**0.48±0.07**四神丸低劑量組1.83±0.11**#◆◆0.47±0.07**◆0.51±0.09**◆◆四神丸中劑量組1.59±0.08**##◆0.59±0.20*#◆0.57±0.03**◆四神丸高劑量組1.41±0.05**##0.76±0.14*#0.73±0.07**##美沙拉秦組1.37±0.03**##0.79±0.07*##0.76±0.02**##

4 討論

CD4+T細胞作為免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分，包括調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）和輔助性T細胞（Th）亞群[12]。Th1/Th2免疫軸控制著炎癥和免疫耐受之間的微妙平衡，是維持腸道免疫穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵因素，在病理狀態(tài)下，Th1/Th2免疫軸會向Th1方向傾斜從而導(dǎo)致炎癥的發(fā)生，這與UC的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)[13,14]。Th1主要分泌干擾素γ（IFN-γ）等，促進細胞毒性T淋巴細胞的活化以及和局部炎癥有關(guān)的細胞免疫[15]。而Th2主要分泌IL-4、IL-10和IL-13等，刺激B細胞增殖并產(chǎn)生免疫球蛋白，與體液免疫有關(guān)[16]。結(jié)合病理切片、流式細胞術(shù)及ELISA結(jié)果發(fā)現(xiàn)四神丸可以減輕結(jié)腸組織炎性細胞的浸潤程度，對結(jié)腸黏膜組織有一定的修復(fù)作用，還可增加Th2細胞在CD4+T細胞中的比例，同時降低Th1細胞比例，糾正Th1/Th2免疫軸失衡。

UC發(fā)生發(fā)展的潛在病理機制為信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）介導(dǎo)的免疫功能下降和炎癥浸潤，STAT3激活導(dǎo)致促炎細胞因子和抗炎細胞因子分泌失衡，進一步加速炎癥的發(fā)展[17]。STAT3在維持腸粘膜屏障中起關(guān)鍵作用，是結(jié)腸炎發(fā)病機制的重要轉(zhuǎn)錄因子，IL-6可激活STAT3使其磷酸化從而參與到炎癥反應(yīng)中[18-19]。轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）是重要的抗炎細胞因子，影響腸上皮細胞的穩(wěn)態(tài)，主要通過下調(diào)免疫反應(yīng)來抑制炎癥的發(fā)生[20]。TGF-β在UC患者中代償性上調(diào)，發(fā)揮炎癥抑制的作用，并有助于誘導(dǎo)免疫耐受[21]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）是一種核受體，在維持腸道免疫平衡、抗炎等方面發(fā)揮重要作用，UC患者存在不同程度的PPARγ表達障礙[22]。有研究發(fā)現(xiàn)[23]，IL-6促進STAT-3活化，而STAT-3下游分子miR-155靶向作用的PPARγ表達降低。PPARγ在結(jié)腸中的表達僅次于在脂肪組織中表達，其作為一種重要的抗炎介質(zhì)，激活后可以保護小鼠免于DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎，相反PPARγ的表達被抑制會增加結(jié)腸炎的易感性[22,24]。研究發(fā)現(xiàn)[25,26]，PPARγ的激活可以改善炎癥狀態(tài)下受損的腸道屏障功能，有效促進腸道受損的組織修復(fù)。

本實驗研究結(jié)果顯示，經(jīng)四神丸干預(yù)后，STAT3蛋白及mRNA相對表達量逐漸下降，p-STAT3蛋白表達量逐漸下降，TGF-β1和PPARγ蛋白及mRNA相對表達量逐漸增加，同時IL-6水平降低，STAT3蛋白可能通過IL-6/STAT3途徑參與UC的發(fā)病。四神丸對治療UC大鼠具有積極的作用，其上調(diào)了大鼠血清中炎性抑制因子IL-10水平及結(jié)腸組織TGF-β1、PPARγ的表達；下調(diào)了大鼠血清中炎癥因子IL-6水平及結(jié)腸組織STAT3的表達；同時下調(diào)了Th1細胞占比，上調(diào)了Th2細胞占比。綜上所述，四神丸對改善脾腎陽虛型UC大鼠模型結(jié)腸炎癥程度有積極作用，其機制可能是通過抑制IL-6/STAT3信號通路及糾正Th1/Th2免疫軸失衡，進而降低腸道感染及炎癥。