溫陽(yáng)振衰顆粒對(duì)TGF-β1 誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化狀態(tài)下ERK/STAT3 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響

林湘東，向 茗，陳新宇*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷學(xué)教研室，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

慢性腎衰竭是各種慢性腎臟疾病持續(xù)進(jìn)展的共同結(jié)局，以代謝產(chǎn)物潴留，水、電解質(zhì)及酸堿代謝失衡和全身各系統(tǒng)癥狀為臨床表現(xiàn)，死亡率高，是全世界主要的公共衛(wèi)生問題，嚴(yán)重危害人類健康及生命[1]。腎間質(zhì)纖維化（renal interstitial fibrosis, RIF）是終末期腎臟病最具特征性的表現(xiàn)，是慢性腎臟疾病腎小管間質(zhì)損傷中許多獨(dú)立和重疊的細(xì)胞和分子途徑的最終常見病理改變，與腎衰竭的進(jìn)展密切相關(guān)。 研究證實(shí)，腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（epithelial mesenchymal transition, EMT） 是RIF 發(fā)展過程的第一階段，是RIF 形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[2]。腎小管EMT受不同生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、激素和細(xì)胞外信號(hào)的調(diào)節(jié)，細(xì)胞因子在RIF 的形成中起重要作用[3]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1, TGFβ1）是促進(jìn)腎纖維化的關(guān)鍵細(xì)胞因子，目前用于建立EMT 細(xì)胞模型，其有調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分泌和遷移等多種生物學(xué)功能[4]。 研究表明，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase, ERK）與腎小管EMT 密切相關(guān)，活化的ERK 可激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transduction and activator of transcription 3, STAT3），參與TGF-β1介導(dǎo)的腎小管EMT 發(fā)生[5-6]。 溫陽(yáng)振衰顆粒是陳新宇教授創(chuàng)制的經(jīng)典方，臨床用于治療慢性腎衰竭療效顯著[7]。 據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)通過體外培養(yǎng)觀察TGF-β1介導(dǎo)的腎小管EMT 狀態(tài)下ERK/STAT3 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的表達(dá)及溫陽(yáng)振衰顆粒對(duì)其的干預(yù)作用，以期探討溫陽(yáng)振衰顆粒治療慢性腎衰竭的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 藥物 溫陽(yáng)振衰顆粒(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室，批號(hào)：201709，8 g/包)，用蒸餾水將溫陽(yáng)振衰顆粒1.44 g·（kg·d）-1配成6 mL 溶液給大鼠灌胃，每日灌胃2 次，每次3 mL，連續(xù)給藥7 d；安博維[厄貝沙坦片，賽諾菲（杭州）制藥有限公司，批號(hào)：BHG0990，規(guī)格150 mg/片]，用蒸餾水將厄貝沙坦150 mg·（kg·d）-1配成6 mL 溶液給大鼠灌胃，每日灌胃2 次，每次3 mL，連續(xù)給藥7 d。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD 大鼠30 只，體質(zhì)量（200±20） g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(湘)2016－0002。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 HK-2 細(xì)胞（批號(hào)：CRL-1070)購(gòu)于中南大學(xué)湘雅中心實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫(kù)。

1.1.4 主要試劑 TGF-β1（英國(guó)Abcam 公司，批號(hào)：9016）；U0126（美國(guó)APExBio 公司，批號(hào)：U120）；E-cadherin 抗 體（批 號(hào)：00018701）、Vimentin 抗 體（批 號(hào)：00090339）、ERK 抗 體（批 號(hào)：00096552）、STAT3 抗體（批號(hào)：10000862）均購(gòu)自美國(guó)Protein tech 公司；α-SMA（武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)：186841）；p-ERK 抗體（北京博奧森生物技術(shù)公司，批號(hào)：192581）；p-STAT3 抗體（美國(guó)CST公司，批號(hào)：20）。

1.1.5 主要儀器 超凈工作臺(tái)（北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司，型號(hào)：YT-CJ-2NB）；搖床（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司，型號(hào)：TS-92）；臺(tái)式冷凍離心機(jī)（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：TGL-18R）；電泳儀（美國(guó)Bio-rad 公司，型號(hào)：164-5050）；電泳槽（型號(hào)：DYCZ-24EN）、轉(zhuǎn)膜儀（型號(hào)：DYCZ-40A）均購(gòu)自北京六一生物科技有限公司；精密pH計(jì)（上海雷磁儀器廠，型號(hào)：E-201-C）；電子天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：FA-N）；普通冰箱（合肥榮事達(dá)電子電器集團(tuán)有限公司，型號(hào)：BCD-245F）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 含藥血清制備 分別用蒸餾水將溫陽(yáng)振衰顆粒1.44 g·（kg·d）-1、厄貝沙坦150 mg·（kg·d）-1配成6 mL溶液。 取SD 大鼠30 只，隨機(jī)分成溫陽(yáng)振衰顆粒組、厄貝沙坦片組、正常血清組，各10 只。 正常血清組每日予以蒸餾水6 mL/只，溫陽(yáng)振衰顆粒組每日予以溫陽(yáng)振衰顆粒溶液6 mL/只，厄貝沙坦片組予以厄貝沙坦片溶液6 mL/只，每日灌胃2 次，每次3 mL，連續(xù)給藥7 d，第7 天給藥后2 h 進(jìn)行麻醉，腹主動(dòng)脈取血。室溫靜置1 h，離心、過濾、分裝。-20 ℃保存?zhèn)溆肹8]。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 將HK-2 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基中，待細(xì)胞融合率達(dá)80%左右，進(jìn)行消化傳代；待細(xì)胞培養(yǎng)到6瓶時(shí)，消化鋪板，鋪2 個(gè)6 孔板，共12 個(gè)孔，每孔約5×104個(gè)細(xì)胞。藥物處理前一天晚上，換無血清DMEM/F12 培養(yǎng)基，饑餓處理12 h。 然后將細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組、TGF-β1 組、TGF-β1+空白血清組、TGF-β1+溫陽(yáng)振衰顆粒組（10%含藥血清）、TGF-β1+U0126 組（MEK1/2 抑制劑）、TGF-β1+厄貝沙坦組。 空白對(duì)照組為無血清DMEM/F12 培養(yǎng)液；TGF-β1 組在無血清DMEM/F12 培養(yǎng)液中加入10 μL TGF-β1（濃度為10 ng/mL）；TGF-β1+空白血清組在無血清DMEM/F12 培養(yǎng)液中加入10 μL TGF-β1（濃度為10 ng/mL）及10%空白血清；TGF-β1+溫陽(yáng)振衰顆粒組在無血清DMEM/F12 培養(yǎng)液中加入10 μL TGF-β1（濃度為10 ng/mL）及10%溫陽(yáng)振衰顆粒含藥血清；TGF-β1+U0126 組在無血清DMEM/F12 培養(yǎng)液中使用1 μM（母液1∶10 000用）U0126處理1 h，換液去除U0126 后再加入10 μL TGF-β1（濃度為10 ng/mL）；TGF-β1+厄貝沙坦組在10%厄貝沙坦血清DMEM/F12 培養(yǎng)液中加入10 μL TGFβ1（濃度為10 ng/mL）。 各組處理時(shí)間均為24 h。

1.2.3 各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 上述各組細(xì)胞處理時(shí)間結(jié)束后于倒置顯微鏡下觀察HK-2 細(xì)胞的形態(tài)改變。

1.2.4 各組細(xì)胞E-cadherin、Vimentin、α-SMA、ERK1/2、p-ERK1/2、STAT3、p-STAT3 蛋 白 表 達(dá) 的 檢 測(cè)采用Western blot 法檢測(cè)，準(zhǔn)備電泳樣品，取每個(gè)樣品總蛋白50～100 μg，計(jì)算各個(gè)樣品所需取樣量，并與5×loading buffer 混勻，沸水煮5 min，放入冰盒中速冷。上樣變性蛋白，開始電泳。電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜，接通電源，轉(zhuǎn)膜300 mA，Vimentin 約75 min，E-cadherin 約2.5 h，α-SMA、ERK1/2、p-ERK1/2 約1 h，p-STAT3、STAT3 約110 min。 轉(zhuǎn)膜完畢后，加入一抗，4 ℃過夜。加入二抗孵育90 min。TBST 沖洗15 min×3次。 ECL 顯色曝光，分析結(jié)果。

1.2.5 各組細(xì)胞E-cadherin、Vimentin、α-SMA、ERK1、ERK2、STAT3 mRNA 表達(dá)的檢測(cè) 采用RT-qPCR法檢測(cè)，TRIZOL 提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，SYBR 法進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系為30 μL[Template（反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物）2 μL，Primer F（10 μM）0.5 μL，Primer R（10 μM）0.5 μL，PCR H2O 12 μL，2X SYBGREEN PCR Master Mix 15 μL]。 反應(yīng)條件為：95 ℃10 min，95 ℃15 s，60 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)。 擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后讀取Ct 值，以β-actin 為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法計(jì)算各目的基因相對(duì)含量，重復(fù)3 次實(shí)驗(yàn)。 引物設(shè)計(jì)見表1。

表1 RT-qPCR 法引物設(shè)計(jì)

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料表示為“±s”；首先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，當(dāng)方差齊時(shí)，使用Independent-samples T 檢驗(yàn)比較兩組之間的平均值，方差不齊時(shí)，采取秩和檢驗(yàn)；多組均數(shù)比較，采用Q 檢驗(yàn)進(jìn)行方差分析，并使用One-Way ANOVA ISD 方法比較平均值，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HK-2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

空白對(duì)照組中HK-2 細(xì)胞形態(tài)清楚，呈鵝卵石樣，細(xì)胞銜接緊密，貼壁良好，少見漂浮細(xì)胞。 而在給予TGF-β1 和TGF-β1+空白血清刺激24 h 后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，呈長(zhǎng)梭形或形態(tài)多樣無規(guī)則，細(xì)胞排列稀疏，類似成纖維細(xì)胞形態(tài)，生長(zhǎng)緩慢，貼壁差，多見漂浮細(xì)胞。 與TGF-β1 組和TGF-β1+空白血清組比較，TGF-β1+溫陽(yáng)振衰顆粒組、TGFβ1+U0126 組和TGF-β1+厄貝沙坦組細(xì)胞形態(tài)顯著改善，大部分仍保持鵝卵石樣，貼壁尚可，漂浮細(xì)胞明顯減少。 詳見圖1。

2.2 各組E-cadherin、Vimentin、α-SMA 蛋白表達(dá)水平比較

與空白對(duì)照組比較，TGF-β1 組和TGF-β1+空白血清組E-cadherin 蛋白表達(dá)下調(diào)，Vimentin、α-SMA 蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）；TGF-β1 組與TGF-β1+空白血清組E-cadherin、Vimentin、α-SMA 蛋白表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與TGF-β1 組和TGF-β1+空白血清組比較，TGF-β1+溫陽(yáng)振衰顆粒組、TGF-β1+U0126 組和TGF-β1+厄貝沙坦組Ecadherin 蛋白表達(dá)上調(diào)，Vimentin、α-SMA 蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）；TGF-β1+溫陽(yáng)振衰顆粒組、TGF-β1+U0126 組和TGF-β1+厄貝沙坦組E-cadherin、Vimentin、α-SMA 蛋白表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 詳見圖2、表2。

圖1 各組HK-2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)（光鏡，×100）

圖2 各組E-cadherin、Vimentin、α-SMA 蛋白電泳圖

2.3 各組E-cadherin、Vimentin、α-SMA mRNA 表達(dá)水平比較

與空白對(duì)照組比較，TGF-β1 組和TGF-β1+空白血清組E-cadherin mRNA 表達(dá)下調(diào)，Vimentin、α-SMA mRNA 表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）；TGF-β1 組與TGFβ1+空白血清組比較，E-cadherin、Vimentin、α-SMA mRNA 表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與TGF-β1組和TGF-β1+空白血清組比較，TGF-β1+溫陽(yáng)振衰顆粒組、TGF-β1+U0126 組和TGF-β1+厄貝沙坦組E-cadherin mRNA 表達(dá)上調(diào)，Vimentin、α-SMA mRNA 表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）；TGF-β1+溫陽(yáng)振衰顆粒組、TGF-β1+U0126 組和TGF-β1+厄貝沙坦組E-cadherin、Vimentin、α-SMA mRNA 表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 詳見表3。

表2 各組E-cadherin、Vimentin、α-SMA 蛋白水平的表達(dá)（±s，n=5）

表2 各組E-cadherin、Vimentin、α-SMA 蛋白水平的表達(dá)（±s，n=5）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05；與TGF-β1 組比較，#P＜0.05；與TGFβ1+空白血清組比較，＆P＜0.05。

組別空白對(duì)照組TGF-β1 組TGF-β1+空白血清組TGF-β1+溫陽(yáng)振衰顆粒組TGF-β1+U0126 組TGF-β1+厄貝沙坦組E-cadherin 0.31±0.04 0.12±0.03*0.11±0.05*0.24±0.06#＆0.23±0.04#＆0.26±0.08#＆Vimentin 0.09±0.02 0.29±0.08*0.31±0.07*0.16±0.04#＆0.15±0.04#＆0.14±0.05#＆α-SMA 0.10±0.03 0.28±0.05*0.30±0.09*0.17±0.07#＆0.15±0.06#＆0.17±0.04#＆

表3 各組E-cadherin、Vimentin、α-SMA mRNA 的表達(dá)（±s，n=5）

表3 各組E-cadherin、Vimentin、α-SMA mRNA 的表達(dá)（±s，n=5）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05；與TGF-β1 組比較，#P＜0.05；與TGF-β1+空白血清組比較，＆P＜0.05。

組別空白對(duì)照組TGF-β1 組TGF-β1+空白血清組TGF-β1+溫陽(yáng)振衰顆粒組TGF-β1+U0126 組TGF-β1+厄貝沙坦組E-cadherin 1 0.53±0.12*0.51±0.04*0.86±0.13#＆0.85±0.14#＆0.87±0.11#＆Vimentin 1 1.97±0.36*2.03±0.41*1.22±0.06#＆1.19±0.08#＆1.17±0.06#＆α-SMA 1 1.98±0.05*1.99±0.18*1.19±0.31#＆1.15±0.30#＆1.18±0.30#＆

2.4 各組ERK1/2、p-ERK1/2、STAT3、p-STAT3 蛋白表達(dá)水平比較

與空白對(duì)照組比較，其余各組ERK1/2、STAT3蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），TGF-β1 組和TGF-β1+空白血清組p-ERK1/2、p-STAT3 表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05）；TGF-β1 組與TGF-β1+空白血清組比較，ERK1/2、p-ERK1/2、STAT3、p-STAT3 蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與TGF-β1 組和TGF-β1+空白血清組比較，TGF-β1+溫陽(yáng)振衰顆粒組、TGF-β1+U0126 組和TGF-β1+厄貝沙坦組p-ERK1/2、p-STAT3 蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）；TGF-β1+溫陽(yáng)振衰顆粒組、TGF-β1+U0126 組和TGF-β1+厄貝 沙 坦 組ERK1/2、p-ERK1/2、STAT3、p-STAT3 蛋白表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 詳見圖3、表4。

圖3 各組ERK1/2、p-ERK1/2、STAT3、p-STAT3蛋白電泳圖

表4 各組ERK1/2、p-ERK1/2、STAT3、p-STAT3蛋白的表達(dá)（±s，n=5）

表4 各組ERK1/2、p-ERK1/2、STAT3、p-STAT3蛋白的表達(dá)（±s，n=5）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05；與TGF-β1 組比較，#P＜0.05；與TGFβ1+空白血清組比較，＆P＜0.05。

組別空白對(duì)照組TGF-β1 組TGF-β1+空白血清組TGF-β1+溫陽(yáng)振衰顆粒組TGF-β1+U0126 組TGF-β1+厄貝沙坦組ERK1/2 0.31±0.08 0.32±0.05 0.29±0.06 0.32±0.09 0.30±0.07 0.30±0.05 p-ERK1/2 0.08±0.02 0.20±0.04*0.19±0.05*0.11±0.06#＆0.10±0.05#＆0.12±0.04#＆STAT3 0.36±0.06 0.34±0.05 0.35±0.07 0.34±0.06 0.36±0.07 0.35±0.09 p-STAT3 0.07±0.03 0.26±0.04*0.27±0.07*0.18±0.03#＆0.18±0.04#＆0.17±0.03#＆

2.5 各組ERK1/2、STAT3 mRNA 表達(dá)水平比較

與空白對(duì)照組比較，其余各組ERK1/2、STAT3 mRNA 表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 詳見表5。

表5 各組ERK1/2、STAT3 mRNA 表達(dá)水平（±s，n=5）

表5 各組ERK1/2、STAT3 mRNA 表達(dá)水平（±s，n=5）

組別空白對(duì)照組TGF-β1 組TGF-β1+空白血清組TGF-β1+溫陽(yáng)振衰顆粒組TGF-β1+U0126 組TGF-β1+厄貝沙坦組ERK1/2 1 1.07±0.23 1.08±0.25 1.10±0.24 1.09±0.26 1.08±0.34 STAT3 1 1.08±0.31 1.10±0.37 1.06±0.23 1.10±0.36 1.09±0.24

3 討論

腎間質(zhì)纖維化與腎臟損傷后發(fā)生持續(xù)炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。在炎癥環(huán)境中，腎小管間質(zhì)細(xì)胞被促纖維化細(xì)胞因子激活，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞。肌成纖維細(xì)胞具有活躍的增殖和分泌膠原的能力，也是產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)的主要來源。 當(dāng)腎臟損傷因素不能及時(shí)消除時(shí)，肌成纖維細(xì)胞不斷增殖，細(xì)胞外基質(zhì)持續(xù)產(chǎn)生和堆積，最終導(dǎo)致腎小管萎縮、微血管退化，形成持久性瘢痕，取代正常的腎組織，最終發(fā)展為腎衰竭[9]。腎小管EMT 是肌成纖維細(xì)胞的主要來源，是腎間質(zhì)纖維化形成的重要途徑。 TGF-β1是公認(rèn)的EMT 誘導(dǎo)劑，TGF-β1 結(jié)合相關(guān)受體活化Smad蛋白，進(jìn)而調(diào)節(jié)EMT 相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生[10]。 TGF-β1 誘導(dǎo)的人HK-2 細(xì)胞EMT模型是比較廣泛、易操作和易觀察的細(xì)胞模型[11-12]。正常HK-2 細(xì)胞形態(tài)清楚，呈鵝卵石樣，細(xì)胞銜接緊密，貼壁良好，少見漂浮細(xì)胞。 本實(shí)驗(yàn)研究顯示TGFβ1 組和TGF-β1+空白血清組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，呈長(zhǎng)梭形或形態(tài)多樣無規(guī)則，細(xì)胞排列稀疏，類似成纖維細(xì)胞形態(tài)，生長(zhǎng)緩慢，貼壁差，多見漂浮細(xì)胞；TGF-β1+溫陽(yáng)振衰顆粒組細(xì)胞大部分仍保持鵝卵石樣，貼壁尚可，漂浮細(xì)胞明顯減少，提示HK-2細(xì)胞EMT 模型建模成功，溫陽(yáng)振衰顆?？捎行а泳廐K-2 細(xì)胞EMT 的形態(tài)學(xué)變化。

E-cadherin 是黏蛋白家族中的重要成員，屬于跨膜細(xì)胞-細(xì)胞黏附分子，參與黏附連接的形成，以及其他上皮細(xì)胞連接。 它能建立和維持上皮細(xì)胞的極性，參與跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，具有防止腎纖維化的作用[13]。 Vimentin 主要在內(nèi)皮細(xì)胞等間葉組織中表達(dá)，與維持細(xì)胞和細(xì)胞器形態(tài)、促進(jìn)細(xì)胞黏附及移行、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡及腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移等有關(guān)。 Vimentin被認(rèn)為是腎小管上皮細(xì)胞在向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中的中間產(chǎn)物[14]。 α-SMA 是平滑肌細(xì)胞的標(biāo)志物，并且被認(rèn)為是肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志物。肌成纖維細(xì)胞的數(shù)量和α-SMA 的表達(dá)與腎間質(zhì)纖維化的程度和腎病的進(jìn)展呈正相關(guān)。 α-SMA 表達(dá)越多，腎功能下降越快，預(yù)后越差[15]。 發(fā)生EMT 后，腎小管上皮細(xì)胞將出現(xiàn)E-cadherin 表達(dá)缺失，獲得間質(zhì)細(xì)胞如α-SMA、Vimentin 的特征，并增強(qiáng)細(xì)胞遷移和侵襲能力[16]。 因此，E-cadherin、Vimentin、α-SMA 可作為腎小管發(fā)生EMT 的標(biāo)志物。本實(shí)驗(yàn)研究顯示TGFβ1 組和TGF-β1+空白血清組細(xì)胞中E-cadherin 蛋白和mRNA 表達(dá)下調(diào)，Vimentin、α-SMA 蛋白和mRNA 表達(dá)上調(diào)；TGF-β1+溫陽(yáng)振衰顆粒組細(xì)胞中Ecadherin 蛋白和mRNA 表達(dá)上調(diào)，Vimentin、α-SMA蛋白和mRNA 表達(dá)下調(diào)，提示溫陽(yáng)振衰顆粒能增加E-cadherin 和降低Vimentin、α-SMA，從而延緩HK-2 細(xì)胞EMT。

ERK1/2 是MAPK 家族的重要成員之一，常存在于胞質(zhì)中，可由多種細(xì)胞外刺激物，如生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和G 蛋白偶聯(lián)受體等激活，活化后迅速進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，進(jìn)一步激活C-Jun、NF-κB、C-Fos 和CREB 等轉(zhuǎn)錄因子，影響某些基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。 ERK 信號(hào)通路是多種促增殖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的共同通路。目前，研究表明TGF-β1 通過活化ERK 信號(hào)通路介導(dǎo)腎小管EMT，增加ECM 的分泌，抑制ECM 的降解，促進(jìn)腎纖維化[17]。 例如，在小鼠腎系膜細(xì)胞中，TGF-β1 誘導(dǎo)的CTGF 過表達(dá)可被ERK1/2 抑制劑PD98059 部分抑制，從而發(fā)揮抗腎臟纖維化作用；抑制ERK 的活化可降低α-SMA 和Collagen Ⅲ的表達(dá)，改善腎臟纖維化；在腎小管上皮細(xì)胞中，TGF-β1 誘導(dǎo)的EMT 被Erbin 通過ERK 依賴途徑抑制，證實(shí)了ERK 信號(hào)通路的激活與EMT密切相關(guān)[18-19]。 STAT3 是位于ERK 級(jí)聯(lián)反應(yīng)下游的一類重要的調(diào)控元件，ERK 能特異性磷酸化STAT3 上的727 位色氨酸（serine 727, Ser727），增強(qiáng)STAT3 的轉(zhuǎn)錄活性?，F(xiàn)有研究表明STAT3 是對(duì)炎癥反應(yīng)發(fā)揮重要調(diào)控作用的STAT 分子，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞呼吸、代謝、自噬等病理生理過程[20]。 更重要的是，STAT3 還在腎臟固有細(xì)胞中參與多個(gè)腎臟損傷和修復(fù)的過程[21-22]。在多種模型腎組織中都可觀察到STAT3 途徑活化，例如糖尿病腎病、梗阻性腎病等[23-24]。 有臨床學(xué)者對(duì)糖尿病腎病、IgA 腎病等腎病患者的腎臟進(jìn)行活檢取材檢測(cè)，也發(fā)現(xiàn)STAT3 通路發(fā)生了顯著的磷酸化[25]。 因此，推測(cè)ERK 通過調(diào)控下游元件STAT3參與腎小管EMT 的發(fā)生和進(jìn)展。 本實(shí)驗(yàn)研究顯示TGF-β1 組和TGF-β1+空白血清組細(xì)胞中p-ERK1/2、p-STAT3 蛋白表達(dá)明顯上調(diào)；TGF-β1+溫陽(yáng)振衰顆粒組細(xì)胞中p-ERK1/2、p-STAT3 蛋白表達(dá)下調(diào)，提示溫陽(yáng)振衰顆粒能部分抑制ERK1/2 和STAT3的磷酸化，部分阻斷ERK/STAT3 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，進(jìn)而延緩HK-2 細(xì)胞EMT。

陳新宇教授臨床實(shí)踐三十余年，喜用經(jīng)方治療疑難雜癥，認(rèn)為人體以陽(yáng)氣為本，治療疾病當(dāng)遵從“陽(yáng)主陰從”，針對(duì)慢性腎衰竭，考慮其病位在腎，可累及其他諸多臟腑，其發(fā)病機(jī)制主要是腎陽(yáng)虛損，元?dú)馓潛p，生化無源，濁毒內(nèi)蘊(yùn)，久病則累積其他臟腑而發(fā)生變證，但其本質(zhì)仍是陽(yáng)虛，所以溫陽(yáng)法是陳教授治療慢性腎衰竭的基本法則，其研制的溫陽(yáng)振衰顆粒來源于仲景經(jīng)方，功能扶陽(yáng)、通陽(yáng)、固陽(yáng)，獲得了良好的臨床療效。 溫陽(yáng)振衰顆?；竟π闇仃?yáng)益氣、利水消腫，藥物組成主要有紅參、干姜、甘草、五味子、附片等。 其中，紅參為人參蒸制后曬干，味甘、性溫，既有人參補(bǔ)氣添精之用，又添回陽(yáng)扶正之功。干姜、附片均有回陽(yáng)救逆之效，一守中焦，培補(bǔ)脾胃陽(yáng)氣，一固下元，暖腎陽(yáng)，溫經(jīng)絡(luò)。 二者與甘草相合，恰有四逆湯之意，扶周身元?dú)猓套o(hù)根本。 此外，組方需考慮陰陽(yáng)調(diào)和，故有五味子，酸收內(nèi)斂、固護(hù)五臟精氣，同時(shí)下滋腎陰。 以上各中藥各司其職、相互配合，另有甘草從中斡旋，溫補(bǔ)一身陽(yáng)氣、調(diào)和陰陽(yáng)，可達(dá)補(bǔ)元陽(yáng)、通經(jīng)絡(luò)、消水腫、活瘀血之功。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，溫陽(yáng)振衰顆粒能有效延緩HK-2 細(xì)胞EMT的形態(tài)學(xué)變化，能升高E-cadherin，降低Vimentin、α-SMA，部分抑制ERK1/2 和STAT3 的磷酸化。 據(jù)此推測(cè)，溫陽(yáng)振衰顆?？赡芡ㄟ^下調(diào)ERK1/2 和STAT3蛋白的磷酸化，從而部分阻斷ERK/STAT3 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，對(duì)腎小管EMT 起到延緩作用。