基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和實(shí)驗(yàn)探討丹玄口康治療口腔黏膜下纖維化作用機(jī)制

朱可可，周 蓉，王志豪，譚 勁*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.長沙市婦幼保健院，湖南 長沙 410008）

口腔黏膜下纖維化（oral submucosal fibrosis, OSF）是一種常見的慢性口腔黏膜病，好發(fā)于中國湖南、臺灣，在印度、巴基斯坦、泰國、馬來西亞等國家也有報(bào)道[1-2]，其主要表現(xiàn)為口腔黏膜下固有層的膠原纖維異常沉積和上皮萎縮，從而引起黏膜硬化，形成條索，臨床上主要表現(xiàn)為進(jìn)行性張口受限、長期口腔灼疼和口腔潰瘍等[3]。目前，OSF 的發(fā)病機(jī)制尚不明確，主要與長期咀嚼檳榔、免疫功能失調(diào)等有關(guān)[4]。 OSF的治療主要采用激素類藥物，降低局部組織的免疫炎性反應(yīng)，但長期服用該類藥物，會出現(xiàn)一系列不良反應(yīng)，如庫欣綜合征、高脂血癥、高血壓、高血糖、動脈粥樣硬化等[5-7]。 近年來，本課題組在桃紅四物湯基礎(chǔ)上創(chuàng)制丹玄口康，并觀察其治療OSF 的臨床療效與實(shí)驗(yàn)機(jī)制[8-10]。 丹玄口康由丹參、玄參、當(dāng)歸、紅花、生地黃、白花蛇舌草、黃芪、薄荷配伍而成，能夠理氣活血、化瘀軟堅(jiān)，緩解患者張口受限和口腔黏膜疼痛的癥狀，同時(shí)較少出現(xiàn)藥物的不良反應(yīng)。 但其在分子水平上的作用機(jī)制，還需進(jìn)一步探索。 因此，本文在分子層面，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討丹玄口康治療OSF 的作用機(jī)制，以期對未來進(jìn)一步的藥理研究提供依據(jù)和參考。

1 方法

1.1 丹玄口康的活性成分篩選

運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform, TCMSP, http://tcmspw.com/tcmsp.php），分別檢索丹玄口康中的丹參、當(dāng)歸、紅花、生地黃、白花蛇舌草、玄參、黃芪和薄荷，收集其化學(xué)成分信息,以口服生物利用度（oral bioavailability, OB）≥30%和類藥性（drug-likeness, DL）≥0.18 作為藥物活性成分的篩選標(biāo)準(zhǔn)。 得到結(jié)果為丹玄口康的活性成分。

1.2 丹玄口康作用靶點(diǎn)的預(yù)測

運(yùn)用TCMSP 數(shù)據(jù)庫和UniProt 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/），對丹玄口康活性成分進(jìn)行靶基因的預(yù)測，預(yù)測條件限定為靶點(diǎn)人源性，將所有預(yù)測的靶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)換，得到基因標(biāo)準(zhǔn)化名字。得到結(jié)果為丹玄口康作用靶基因的標(biāo)準(zhǔn)化名字。

1.3 OSF 的治療靶點(diǎn)預(yù)測

運(yùn)用GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）和OMIM 數(shù)據(jù)庫（https://omim.org/），以關(guān)鍵詞“oral submucosal fibrosis”對疾病相關(guān)靶點(diǎn)分別進(jìn)行檢索，檢索結(jié)果匯總后去除重復(fù)基因。 得到結(jié)果為OSF 的潛在治療靶點(diǎn)。

1.4 構(gòu)建“丹玄口康的活性成分-OSF 的作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

將上述結(jié)果導(dǎo)入R 語言（V 3.7.0）中，繪制藥物和疾病的韋恩圖，并得到藥物調(diào)控疾病靶基因的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)。 將上述結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 軟件（V 3.8.0）中，進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，繪制“丹玄口康的活性成分-OSF 的作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。其中，外圍橢圓形代表丹玄口康的有效活性成分，中間的三角形代表OSF 的關(guān)鍵靶基因，網(wǎng)絡(luò)中有聯(lián)系的節(jié)點(diǎn)通過連線鏈接。

1.5 作用靶點(diǎn)的功能和通路的生物信息學(xué)分析

將“1.4”項(xiàng)中獲得的靶基因數(shù)據(jù)導(dǎo)入David 數(shù)據(jù)庫（DAVID，https：//david.ncifcrf.gov），物種限定“Homo sapiens”，對靶基因進(jìn)行GO 生物過程和KEGG 通路生物信息學(xué)分析，篩選P＜0.05 結(jié)果并保存。 列出排名前60 的GO 富集結(jié)果，圓圈大小代表基因數(shù)目，參與該生物學(xué)進(jìn)程靶基因的數(shù)目越多，圓圈直徑越大；圓圈的顏色從藍(lán)色到紅色代表P 值逐漸變小，P 值越小， 說明參與該生物學(xué)進(jìn)程的靶基因富集程度越高。 列出排名前20 的KEGG 信號通路，圓圈大小代表基因數(shù)目，參與該信號通路靶基因的數(shù)目越多，圓圈直徑越大；圓圈的顏色從藍(lán)色到紅色代表P 值逐漸變小，P 值越小，說明參與該信號通路的靶基因富集程度越高。

1.6 動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.6.1 實(shí)驗(yàn)動物及藥物 選取8 周齡雄性SD 大鼠50 只，體質(zhì)量（235±15) g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，動物許可證號SCXK（湘）2019-0004。 于湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF 級動物房飼養(yǎng)，溫度（24±2) ℃，相對濕度為50%～60%，清潔飲水，自由攝食，24 h 光暗循環(huán)條件下飼養(yǎng)。 嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)動物福利倫理原則，并經(jīng)本單位實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審查，倫理審批編號為LLBH-202103100002。

丹玄口康所用藥物為顆粒劑，經(jīng)廣東三九制藥有限公司生產(chǎn)，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供。 具體組方如下：丹參10 g，玄參10 g，當(dāng)歸10 g，紅花5 g，生地黃10 g，白花蛇舌草10 g，黃芪10 g，薄荷10 g。

1.6.2 主要試劑及儀器 氫溴酸檳榔堿（德斯特生物公司，批號：300-08-03），HE 染色套裝（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號：G1003），中性樹膠（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：10004160），病理切片機(jī)（德國萊卡，型號：RM2016），正置顯微鏡（日本尼康，型號：Nikon Eclipse E100），熒光定量PCR 儀（賽默飛世爾科技有限公司，型號：QuantStudio 7 Flex）。

1.6.3 實(shí)驗(yàn)分組、 模型制備和給藥 將造模大鼠分別放入麻醉造模裝置中，待大鼠吸入異氟烷麻醉后，用止血鉗和鑷子張開大鼠口腔，充分暴露頰黏膜，注意從口角伸入皮膚褶襞與頰黏膜相接處進(jìn)針入黏膜下，朝內(nèi)推進(jìn)0.5 cm 后，注入10 mg/mL 檳榔堿0.2 mL（2 d/次）；注射后再用自制刷蘸檳榔堿在頰黏膜處刷20 次（1 d/次，上下左右各20 次），之后禁食、禁水2 h[11]。 連續(xù)8 周后，檢查大鼠口腔情況：張口明顯受限，頰黏膜蒼白，捫之發(fā)硬，黏膜下有條索物形成，符合OSF 臨床表現(xiàn)。造模期間無大鼠死亡。隨機(jī)將造模成功大鼠分為正常對照組、模型組、丹玄口康低劑量組、丹玄口康中劑量組、丹玄口康高劑量組，每組10 只。 正常對照組10 只大鼠不予處理，正常飼養(yǎng)。 模型組大鼠在正常飼養(yǎng)基礎(chǔ)上，予以等量生理鹽水灌胃；丹玄口康低、中、高劑量組大鼠，在正常飼養(yǎng)基礎(chǔ)上予以低、中、高濃度丹玄口康灌胃。

丹玄口康低、中、高劑量組以組方4、8、12 mL/kg（按照體表面積藥物劑量換算公式計(jì)算, 分別相當(dāng)于70 kg 成人劑量的1、2、3 倍）[11]灌胃8 周，模型組以等量生理鹽水灌胃，1 次/d。 末次給藥后，使用過量水合氯醛將大鼠處死，取大鼠口腔頰黏膜組織，部分固定于10%甲醛中，部分凍存于-80 ℃冰箱。

1.6.4 口腔黏膜組織病理切片 將標(biāo)本石蠟包埋后切片，依次將切片放入二甲苯Ⅰ20 min、二甲苯Ⅱ20 min、無水乙醇Ⅰ5 min、無水乙醇Ⅱ5 min、75%乙醇5 min，自來水洗；切片入蘇木素染液染3～5 min，自來水洗，分化液分化，自來水洗，返藍(lán)液返藍(lán)，流水沖洗；伊紅染色：切片依次入85%、95%乙醇脫水各5 min，入伊紅染液中染色5 min；脫水封片：切片依次放入無水乙醇Ⅰ5 min、無水乙醇Ⅱ5 min、無水乙醇Ⅲ5 min、二甲苯Ⅰ5 min、二甲苯Ⅱ5 min透明，中性樹膠封片；顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

1.6.5 q-PCR 檢測口腔黏膜組織中HIF-1α 以Trizol 提取細(xì)胞總RNA，取保存在Trizol 中的組織約0.02 g，加入1 mL Trizol 于勻漿器中充分研磨勻漿，混勻后室裂解5 min；加入200 μL 三氯甲烷，混勻15 s，室溫靜置3 min；以離心半徑8 cm、12 000 r/min、4 ℃下離心15 min；取上層液相，轉(zhuǎn)移至新的RNase-Free 離心管中；加入等體積的異丙醇，混勻，室溫靜置10 min；以離心半徑8 cm、12 000 r/min、4 ℃下離心10 min，去上清，加入1 mL 75%乙醇（無菌DEPC處理水配制）洗滌沉淀；以12 000 r/min、4 ℃下離心3 min，去上清；空氣干燥5～10 min；加入20～30 μL無菌無酶水溶解沉淀；紫外分光光度計(jì)測定濃度，在260 nm 與280 nm 處測其吸光度值，并計(jì)算其濃度、純度；以組織總mRNA 為模板，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，反應(yīng)體系渦旋振蕩混勻，短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底，50 ℃孵育50 min，85 ℃孵育5 min；反應(yīng)結(jié)束后，短暫離心，置于冰上冷卻；以β-actin 作為內(nèi)參基因計(jì)算丹玄口康治療OSF 的關(guān)鍵靶基因HIF-1α 相對表達(dá)量，運(yùn)用primer5 軟件設(shè)計(jì)引物，由北京擎科合成引物；根據(jù)引物的設(shè)計(jì)要求，PCR 擴(kuò)增條件：95 ℃、10 min 預(yù)變性；95 ℃下15 s，60 ℃下20 s，持續(xù)40 個(gè)循環(huán)。 HIF-1α mRNA 以β-actin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt算法計(jì)算HIF-1α mRNA相對表達(dá)水平。 q-PCR 引物序列見表1。

1.7 數(shù)據(jù)分析

表1 q-PCR 引物序列

2 結(jié)果

2.1 丹玄口康的活性成分

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫共收集丹玄口康中化學(xué)成分2456 個(gè)，依據(jù)OB≥30%和DL≥0.18 的篩選標(biāo)準(zhǔn)，去除重復(fù)的有效成分后，結(jié)果為93 個(gè),OB 值排名前10 的活性成分見表2。

表2 丹玄口康OB 前10 位活性成分的基本信息

2.2 共同作用靶點(diǎn)的預(yù)測

運(yùn)用TCMSP 數(shù)據(jù)庫，對丹玄口康所包含的8 味中藥依次進(jìn)行篩選，得到結(jié)果為潛在的治療靶基因，去除重復(fù)靶基因，最后得到的靶基因數(shù)目為260 個(gè)。通過檢索GeneCards 和OMIM 數(shù)據(jù)庫，兩個(gè)數(shù)據(jù)庫相結(jié)合后去除重復(fù)項(xiàng)，得到459 個(gè)OSF 的潛在治療靶基因。 將丹玄口康有效成分的靶點(diǎn)與OSF 的靶點(diǎn)相匹配，得到丹玄口康治療OSF 的關(guān)鍵靶基因48 個(gè)，根據(jù)結(jié)果繪制韋恩圖。 詳見圖1。

2.3 丹玄口康活性成分-OSF 關(guān)鍵靶基因的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析

圖1 丹玄口康和OSF 共同作用靶點(diǎn)的韋恩圖

將丹玄口康有效活性成分和OSF 關(guān)鍵靶基因?qū)隒ytoscape 軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，得到“有效活性成分-關(guān)鍵靶基因”網(wǎng)絡(luò)。 結(jié)果表明，槲皮素、丹參酮ⅡA、阿魏酸、芍藥苷、木犀草素、黃芩素能與5 個(gè)以上的靶點(diǎn)相連接，推測這6 個(gè)成分是丹玄口康中對OSF 起治療作用的主要活性成分；丹玄口康活性成分和OSF 靶基因連線排在前10 位的分別是：EGFR、JUN、HIF-1α、PGR、MMP9、MAPK1、PTGS2、MYC、VEGFA、CASP8。表明這些靶點(diǎn)在OSF 的治療中可能發(fā)揮重要的作用。 詳見圖2。

2.4 GO 生物學(xué)過程的生物信息學(xué)分析

GO 富集分析顯示，丹玄口康治療OSF 的靶基因涉及氧活性反應(yīng)（response to reactive oxygen species）、金屬內(nèi)肽酶活性（metalloendopeptidase activity）、絲氨酸內(nèi)肽酶活性（serine-type endopeptidase activity）、血紅素結(jié)合（heme binding）等多個(gè)生物進(jìn)程，表明丹玄口康通過多生物學(xué)進(jìn)程發(fā)揮治療OSF 的作用。詳見圖3-5。

2.5 KEGG 信號通路的生物信息學(xué)分析

KEGG 信號通路富集結(jié)果顯示，丹玄口康治療OSF 主要涉及的通路如下：腫瘤壞死因子信號通路、IL-17 信號通路、HIF-1 信號通路等多個(gè)通路。 表明丹玄口康活性成分作用的靶基因，分布于不同的信號通路，通過多通路共同作用來發(fā)揮治療OSF 的作用。 詳見圖6。

2.6 丹玄口康對OSF 大鼠口腔黏膜的影響

2.6.1 丹玄口康對OSF 大鼠口腔黏膜的病理改變

通過HE 染色發(fā)現(xiàn)，正常對照組黏膜上皮基本正常，釘突未出現(xiàn)變平或消失；與正常對照組相比，模型組黏膜上皮萎縮、變薄，部分釘突變短甚至消失，黏膜固有層出現(xiàn)大量粉紅色絲狀、網(wǎng)狀膠原纖維沉積，固有層下肌纖維萎縮；丹玄口康低、中、高劑量組HE 染色結(jié)果較為相似，黏膜上皮基本正常，黏膜固有層見少量絲狀膠原纖維沉積，固有層肌纖維基本正常。 詳見圖7。

圖2 丹玄口康的活性成分作用于OSF 關(guān)鍵靶基因的網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 GO 的BP 柱狀圖

2.6.2 丹玄口康對OSF 大鼠HIF-1α 轉(zhuǎn)錄的影響 與正常對照組比較，模型組大鼠口腔黏膜HIF-1α mRNA 表達(dá)水平明顯上升（P＜0.01）。與模型組比較，丹玄口康各劑量組大鼠HIF-1α mRNA 表達(dá)水平明顯下降（P＜0.01），丹玄口康低劑量組和中劑量組相比，HIF-1α mRNA 的表達(dá)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，丹玄口康高劑量組較丹玄口康低、中劑量組HIF-1α mRNA 表達(dá)水平下降（P＞0.05）。 詳見圖8。