干姜炮制火候數(shù)學(xué)模型的建立及驗(yàn)證研究

周逸群，胡斯佳，鄒會(huì)品，伍夢(mèng)玲，賀福元，石繼連*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.中藥成藥性與制劑制備湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥超分子機(jī)理與數(shù)理特征化實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

中藥材多以自然界的植物、動(dòng)物和礦物經(jīng)炮制成中藥飲片后入藥，所含化學(xué)成分復(fù)雜，其有效成分群的存在狀態(tài)直接制約了其藥性與臨床功效。 加熱是中藥炮制的最重要手段之一，炮制火候的大小對(duì)中藥的藥性和功效具有顯著影響，輕則改變化學(xué)成分群含量，影響藥效的強(qiáng)弱；重則改變成分群的構(gòu)成比或種類(lèi)，以至改變藥性和產(chǎn)生新功效[1]。 因此，中藥炮制的本質(zhì)就是在外界高溫、高濕條件下，加輔料或不加輔料促使中藥材發(fā)生物理化學(xué)變化的中藥制藥技術(shù)[2]。 在不同的炮制條件下，藥材成分產(chǎn)生物理化學(xué)反應(yīng)，包括結(jié)合水的逸出、化學(xué)鍵的斷裂、脫水、炭化及成分降解和新生等。

按照中醫(yī)藥界傳統(tǒng)觀點(diǎn)，火候是指“火力的大小和時(shí)間的長(zhǎng)短”。 歷代醫(yī)藥學(xué)家多從飲片的形態(tài)、色澤、質(zhì)地及氣味等方面[3]，憑傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)描述炮制的火候，具有明顯的主觀性和隨意性，很難做到標(biāo)準(zhǔn)化和客觀化，導(dǎo)致炮制品的質(zhì)量很難穩(wěn)定，其有效性和安全性也難以得到保證?，F(xiàn)代學(xué)者多數(shù)認(rèn)為，火候是指藥物加熱炮制時(shí)火力大小的運(yùn)用、加熱時(shí)間的長(zhǎng)短及藥物在受熱過(guò)程中內(nèi)外出現(xiàn)的變化特征的綜合概括，其本質(zhì)上是達(dá)到一定溫度條件下的炮制時(shí)間的累與積效應(yīng)[4]。 從化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)角度，火候則是在一定反應(yīng)平衡常數(shù)條件下，中藥成分含量動(dòng)力學(xué)曲線隨時(shí)間變化的積分。 該過(guò)程可采用化學(xué)動(dòng)力學(xué)進(jìn)Arrhenius 公式關(guān)聯(lián)。 因此，通過(guò)測(cè)定任一溫度點(diǎn)的平衡常數(shù)并與動(dòng)力學(xué)關(guān)聯(lián)，就能建立任一溫度任一時(shí)間單位中藥材成分隨時(shí)間的定量變化關(guān)系式，若定義此關(guān)系式對(duì)溫度與時(shí)間變量的二階偏導(dǎo)數(shù)，則可表征溫度與時(shí)間對(duì)中藥材成分的影響程度，從而獲得中藥炮制的火候定量數(shù)學(xué)表達(dá)式，實(shí)現(xiàn)中藥炮制火候由定性描述向定量控制質(zhì)量轉(zhuǎn)變。

干姜為姜科植物姜Zingiber officinale Rosc.的干燥根莖[5]，是一種常見(jiàn)的藥食兩用中藥，采用不同的火力可以將其炮制成炮姜和姜炭使用。 雖然干姜及其炮制品均能溫中散寒，但臨床使用各有側(cè)重點(diǎn)：干姜辛熱，長(zhǎng)于溫里，又回陽(yáng)通脈，可用于治療亡陽(yáng)證；炮姜長(zhǎng)于溫經(jīng)止血，可用于治療中焦及下焦虛寒性出血，產(chǎn)后血虛；而姜炭則偏于止血，可用于各種虛寒性出血，尤其出血較急、出血量較多者[6]。 研究發(fā)現(xiàn)，干姜、炮姜、姜炭的主要活性成分為揮發(fā)油，且炮制火候可以顯著改變其揮發(fā)油成分類(lèi)型和含量[7-9]，從而影響藥效。 本實(shí)驗(yàn)以干姜不同火候炮制品揮發(fā)油中均含有的成分乙酸香葉酯的含量為參考建立數(shù)學(xué)模型，為探討中藥炮制火候的科學(xué)內(nèi)涵及炮制機(jī)理提供一種新方法，并為創(chuàng)立中藥炮制火候的通用方法奠定基礎(chǔ)。

1 數(shù)學(xué)模型建立的基本原理

中藥炮制的過(guò)程實(shí)質(zhì)上是對(duì)中藥有效成分的理化性質(zhì)產(chǎn)生影響的過(guò)程，包括熱力學(xué)與動(dòng)力學(xué)兩方面的作用。 首先應(yīng)考慮炮制品反應(yīng)是需要加熱還是需要吸熱，應(yīng)當(dāng)加熱到滿足活化能的需要時(shí)的溫度（T）要求進(jìn)行反應(yīng)，這是由熱力學(xué)決定、由Arrhenius公式定量表征，并反應(yīng)到化學(xué)反應(yīng)的平衡常數(shù)（K）和指前因子（A）上。 在某一溫度下，反應(yīng)的強(qiáng)度由化學(xué)反應(yīng)速度與時(shí)間決定，由化學(xué)動(dòng)力學(xué)定量表征。因此，中藥炮制時(shí)的火力大小可通過(guò)改變分子的活化能（E）與溫度（T）的關(guān)系影響反應(yīng)平衡常數(shù)，而炮制的時(shí)間長(zhǎng)短（t）通過(guò)影響成分動(dòng)力學(xué)量變（M）表達(dá)。炮制火候的數(shù)理本質(zhì)是：達(dá)到一定溫度條件下，炮制時(shí)間累積對(duì)藥物成分質(zhì)量變化的累積[1]。 從化學(xué)動(dòng)力學(xué)來(lái)說(shuō)，即基于一定反應(yīng)平衡常數(shù)條件下，藥物含量的動(dòng)力學(xué)曲線隨時(shí)間變化的微分，因此可借鑒制劑的穩(wěn)定性研究思路進(jìn)行建模研究。 本文僅探求恒溫條件下的炮制火候數(shù)學(xué)模型，詳細(xì)建模過(guò)程由賀福元教授完成。

根據(jù)化學(xué)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)原理，可采用Arrhenius 公式與動(dòng)力學(xué)方程來(lái)表示成分的穩(wěn)定性，即公式（1）（2）（3）：

公式（1）和（2）中，K 為單成分反應(yīng)的平衡常數(shù)，E 為單成分反應(yīng)的活化能，R 為氣體常數(shù)，T 為絕對(duì)溫度，A 為Arrhenius 頻率因子，M 為單成分量，±表示炮制過(guò)程使成分量的增加或降低，n 為每個(gè)成分化學(xué)反應(yīng)的級(jí)數(shù)。

根據(jù)火候的傳統(tǒng)定義，火候的本質(zhì)可定義為在單位溫度下、單位時(shí)間內(nèi)，物質(zhì)質(zhì)量的變量程度，即：

公式（3）中，H 為火候，t 為加熱時(shí)間，T 為加熱溫度（絕對(duì)溫度）。

由公式（2）可得公式（4）：

在大部分炮制溫度條件下，中藥中的化學(xué)成分多符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)變化規(guī)律，此時(shí)n 取1，則由公式（4）可得公式（5）：

如為零級(jí)，此時(shí)n 取0，公式（4）變?yōu)楣剑?）：

公式（5）（6）是中藥單成分炮制火候的定量依據(jù)，其結(jié)果代表溫度對(duì)某一藥物質(zhì)量改變的影響程度，其值越大，說(shuō)明溫度對(duì)其成分質(zhì)量改變?cè)矫黠@，火候越近。 由于不同物質(zhì)發(fā)生化學(xué)變化的活化能與頻率因子不同，因此不同中藥炮制達(dá)到最優(yōu)療效的火候不同。 根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，由藥效學(xué)求得炮制品的最佳成分量，計(jì)算出與原飲片的改變量ΔX＝Mt－M0。確定了加熱炮制操作時(shí)間t，則由式（7）求得恒溫操作的溫度T。

確定了操作的溫度T，按式（8）可求出變溫的操作時(shí)間t：

式（7）、式（8）即中藥成分炮制火候的定量表征基礎(chǔ)數(shù)學(xué)模型。

2 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

干姜購(gòu)于湖南衡岳中藥飲片有限公司，產(chǎn)地湖南，生產(chǎn)批號(hào)190112903，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)石繼連教授鑒定為姜科植物姜Zingiber officinale Rosc.的干燥根莖。

202-3AB 型電熱恒溫干燥箱、98-1-B 型電子控溫電熱套均購(gòu)自天津市泰斯特儀器有限公司；400Y 型多功能粉碎機(jī)（永康市鉑歐五金制品有限公司）；CP-114 型電子天平（奧豪斯儀器上海有限公司）；EKUP-II-20T 型超純水機(jī)（長(zhǎng)沙市科臨電子科技有限公司）；GCMS-QP2010 型氣質(zhì)聯(lián)用儀（日本島津公司）；BCD-671WDEMU1 型冰箱（青島海爾股份有限公司）。

甲醇（分析純，批號(hào)：20201127，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；正己烷（分析純，批號(hào)：190104，西隴科學(xué)股份有限公司）；乙酸香葉酯對(duì)照品（純度≥98%，批號(hào)：20181409，四川省維克奇生物科技有限公司）。

3 方法與結(jié)果

3.1 干姜不同火候炮制品的制備

依據(jù)傳統(tǒng)炮制方法對(duì)干姜各種炮制品的溫度和時(shí)間的要求以及化學(xué)動(dòng)力學(xué)原理，經(jīng)預(yù)試確定了加熱溫度和時(shí)間的范圍。溫度分別設(shè)為200、220、240 ℃，每一溫度的加熱時(shí)間設(shè)為10、15、20、25、30 min。 實(shí)驗(yàn)將凈制后的干姜分為15 份，每份稱(chēng)取360 g，按表1 方案炮制姜不同火候炮制品。 將稱(chēng)取后的干姜放進(jìn)已調(diào)至相應(yīng)溫度的烘箱中，烘烤至所需時(shí)間后取出置干燥器中冷卻，待冷至室溫后裝入密封袋保存。

表1 姜不同炮制品火候方案表

3.2 揮發(fā)油中乙酸香葉酯的含量測(cè)定

3.2.1 色譜、質(zhì)譜條件 色譜柱：DB-5（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣為氦氣（99.999%）；載氣流速為1.0 mL·min-1；分流進(jìn)樣（分流比為50∶1）；進(jìn)樣口溫度250 ℃；柱溫采取程序升溫：起始柱溫為70 ℃，保持1 min，以4 ℃·min-1速率升至150 ℃，保持3.5 min，再以6 ℃·min-1速率升至156 ℃，保持1 min，再以3 ℃·min-1速率升至180 ℃，再以5 ℃·min-1速率升至240 ℃，保持10 min，進(jìn)樣量1 μL。

質(zhì)譜條件：電離方式為電子轟擊離子源（EI）；電子轟擊能量為70 eV；離子源溫度為230 ℃；質(zhì)量掃描范圍為35～550 amu； 數(shù)據(jù)采集掃描模式為全掃描；溶劑延遲3 min。

3.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取對(duì)照品乙酸香葉酯5.0 mg，置于100 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到濃度為0.05 mg·mL-1的乙酸香葉酯對(duì)照品溶液，用0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，留取續(xù)濾液，備用。

3.2.3 供試品溶液的制備 取“3.1”項(xiàng)下的干姜不同火候的炮制品，打粉，取過(guò)2 號(hào)篩粉末，精密稱(chēng)定70 g，分別置于1000 mL 圓底燒瓶中，加水700 mL、沸石數(shù)粒，并混合振搖，根據(jù)水蒸氣蒸餾法安裝實(shí)驗(yàn)裝置，用電熱套加熱并保持微沸約5 h，收集揮發(fā)油提取器上層油狀液體，得干姜不同火候的炮制品揮發(fā)油樣品。取揮發(fā)油50 μL，加正己烷稀釋至1 mL，用0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，留取續(xù)濾液，備用。

3.2.4 方法學(xué)考察 （1） 精密度試驗(yàn) 精密吸取“3.2.2”項(xiàng)下乙酸香葉酯的對(duì)照品溶液，按“3.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次并測(cè)定，得到乙酸香葉酯的色譜峰面積，計(jì)算得其峰面積RSD 為0.97%，此結(jié)果表明精密度良好。

（2）穩(wěn)定性試驗(yàn) 取上述同一供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12、24 h 按“3.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄乙酸香葉酯的色譜峰面積，計(jì)算得其平均峰面積為4 237 113，RSD 為2.17%。 結(jié)果顯示供試品溶液在24 h 內(nèi)性質(zhì)較穩(wěn)定。

（3）重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取同一批次干姜生品各70 g，共6 份，分別按“3.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。 分別按“3.2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，得到乙酸香葉酯的色譜峰面積，計(jì)算得其平均峰面積為2 741 837，RSD 為0.97%，結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。

3.2.5 含量測(cè)定 分別精密稱(chēng)取“3.1”項(xiàng)下姜不同火候炮制品70 g，各3 份，按“3.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液各20 μL 進(jìn)樣，按照“3.2.1”項(xiàng)下的色譜、質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定，采用峰面積歸一化法計(jì)算乙酸香葉酯的相對(duì)含量。詳見(jiàn)表2。

表2 姜的不同火候炮制品中乙酸香葉酯相對(duì)百分含量的測(cè)定結(jié)果（n=3）

由表2 可知，總體上姜炮制品的乙酸香葉酯相對(duì)含量隨火候的增加而減少。 具體來(lái)說(shuō)，J2 和J3 系列火候炮制品的乙酸香葉酯的相對(duì)含量先隨炮制火候的增加而降低，J2 系列火候炮制品的相對(duì)含量在20 min 處達(dá)到低點(diǎn)，而J3 系列火候炮制品的相對(duì)含量在25 min 處達(dá)到最低點(diǎn)，為0.46%。 此后J2 和J3 系列火候炮制品的乙酸香葉酯的相對(duì)含量各隨炮制火候的增加而增加，其中J2 系列火候炮制品的的相對(duì)含量在25～30 min 隨炮制火候的增加而降低，最低點(diǎn)為0.82%。而加熱起點(diǎn)溫度相對(duì)較低的J1系列火候的炮制品的乙酸香葉酯含量隨炮制火候的增加而降低。 在各炮制品中，火候最低的J1-1 的乙酸香葉酯含量為25.46%，J1-1 也是含乙酸香葉酯最高的炮制品。

3.3 炮制火候的數(shù)學(xué)表征參數(shù)測(cè)定

3.3.1 炮制火候的數(shù)學(xué)表征 按照表2 的測(cè)定結(jié)果，根據(jù)公式（1）計(jì)算乙酸香葉酯的平衡常數(shù)K，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 姜不同火候炮制品中乙酸香葉酯的反應(yīng)平衡常數(shù)K 值

由表3 和公式（1）可求得：姜炮制品中乙酸香葉酯的活化能E=12 027.86，A乙酸香葉酯＝0.002 491。故由火候公式式（5）表征乙酸香葉酯的炮制火候與溫度量變的數(shù)學(xué)公式為：

將乙酸香葉酯的活化能E=12 027.86，A乙酸香葉酯＝0.002 491 及R＝8.314 J/(K·mol)分別代入式（7）得乙酸香葉酯的質(zhì)量與溫度量變的數(shù)學(xué)公式為：

3.3.2 火候的數(shù)學(xué)表征驗(yàn)證 將表3 的溫度T、時(shí)間t 分別代入公式（8）和公式（9）中，求得姜不同火候炮制品中乙酸香葉酯的相對(duì)含量的驗(yàn)證值，驗(yàn)證所建立的單成分火候數(shù)學(xué)表征公式。 詳見(jiàn)表4。

運(yùn)用SPSS 19.0 軟件，將表4 中各不同時(shí)間點(diǎn)的驗(yàn)證值和測(cè)定值進(jìn)行配對(duì)t 檢驗(yàn)。結(jié)果可得：對(duì)于乙酸香葉酯t＝1.237，自由度為11，t＜t0.05（11），P=0.242＞0.05。 此結(jié)果說(shuō)明乙酸香葉酯的驗(yàn)證值與測(cè)定值無(wú)顯著性差異，即其驗(yàn)證值與測(cè)定值沒(méi)有差別。 以上即可證明所建立的數(shù)學(xué)模型，即公式（9）和公式（10），能夠較好地表征姜中乙酸香葉酯的相對(duì)含量隨不同加熱炮制火候變化而變化的數(shù)量關(guān)系。

4 討論

對(duì)中藥炮制火候的要求，其本質(zhì)就是對(duì)中藥炮制品質(zhì)量的即時(shí)判斷標(biāo)準(zhǔn)。 傳統(tǒng)的中藥炮制火候描述方法，例如，藥物炒至“深黃”“焦黃”“發(fā)泡”“鼓起”“卷曲”“無(wú)溏心”“酥脆”，煮至“口嘗略有麻舌感”等等[10-13]，多為飲片的形、色、氣、味等感官指標(biāo)，通過(guò)眼看、鼻聞、口嘗及手試等方式來(lái)控制，在很大程度上依靠操作者的感觀能力、經(jīng)驗(yàn)積累。由于判斷標(biāo)準(zhǔn)不可避免的人為主觀因素，這些傳統(tǒng)火候標(biāo)準(zhǔn)具有明顯的主觀性和隨意性，中藥炮制品的質(zhì)量難以得到保證。因此，如何以現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)控制傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)描述中的火候標(biāo)準(zhǔn)，是現(xiàn)代中藥炮制行業(yè)亟需解決的關(guān)鍵問(wèn)題和難點(diǎn)問(wèn)題之一。

目前，國(guó)內(nèi)專(zhuān)家多利用現(xiàn)代儀器將炮制品的顏色和氣味的信息參數(shù)化[14-16]，建立了相關(guān)數(shù)據(jù)參數(shù)或數(shù)學(xué)預(yù)測(cè)模型。 這些探索研究均以?xún)x器替代人工評(píng)判炮制品的顏色和氣味，減少了操作者帶來(lái)的誤差，使之有了一個(gè)相對(duì)統(tǒng)一和穩(wěn)定的判斷標(biāo)準(zhǔn)，在一定程度上對(duì)中藥炮制的火候判斷具有積極意義。 但仍多限于中藥炮制品的靜態(tài)表觀顏色和氣味來(lái)評(píng)判火候標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)炮制過(guò)程中中藥化學(xué)成分的變化規(guī)律與質(zhì)地、味道等傳統(tǒng)火候判斷指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性體現(xiàn)還不夠全面，所制定的顏色和氣味標(biāo)準(zhǔn)同樣受炮制人員或設(shè)備的變動(dòng)而有較大差異，具有較大的隨意性和主觀性，不能體現(xiàn)火候的科學(xué)內(nèi)涵，火候標(biāo)準(zhǔn)仍未能科學(xué)量化。

表4 姜不同火候炮制品中乙酸香葉酯相對(duì)百分含量的測(cè)定及驗(yàn)證結(jié)果

干姜及其炮制品的揮發(fā)油化學(xué)成分組成復(fù)雜，且隨炮制火候的改變而千變?nèi)f化，目前的研究主要針對(duì)干姜不同炮制品的揮發(fā)油含量進(jìn)行簡(jiǎn)單的比較分析，尚未見(jiàn)炮制火候?qū)ζ涑煞肿兓挠绊懽鲃?dòng)態(tài)的、系統(tǒng)的研究，炮制火候?qū)Ω山谥瞥善渌谥破返奈镔|(zhì)基礎(chǔ)遷移規(guī)律尚未清楚。 炮制是否得當(dāng)決定了中藥臨床使用的安全性與有效性[17-19]，只有對(duì)不同炮制火候，對(duì)藥物化學(xué)成分以及藥理作用的影響進(jìn)行充分研究，才能弄清其炮制的機(jī)理。 故可在本實(shí)驗(yàn)的研究基礎(chǔ)上，再結(jié)合藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)果，找出“火候-有效成分-藥效”之間的關(guān)系，即可找出最佳的炮制火候條件。 以可控可標(biāo)準(zhǔn)化的加熱溫度和時(shí)間對(duì)中藥炮制的工藝進(jìn)行規(guī)范化，也可使炮制品的質(zhì)量得到最佳的保障，為全面探討中藥的炮制原理、優(yōu)化中藥炮制的工藝以及制定科學(xué)的中藥炮制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)。