紅毛丹基因組中MITEs轉(zhuǎn)座子的鑒定與演化分析

馬譽(yù)生，張文萍，明瑞光

（1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)海峽聯(lián)合研究院基因組與生物技術(shù)中心，福州 350002；3.伊利諾伊大學(xué)厄巴納香檳分校植物生物學(xué)系，美國(guó) 伊利諾伊州厄巴納 61801）

轉(zhuǎn)座子（transposon）是動(dòng)植物基因組的重要組成成分[1]，是基因組演化過(guò)程中不可忽視的一部分[2]，它們可以通過(guò)復(fù)制或移位從基因組的一個(gè)位點(diǎn)轉(zhuǎn)移至另一個(gè)位點(diǎn)[3]，從而造成基因組重排，并對(duì)基因組大小、染色體結(jié)構(gòu)和附近基因的表達(dá)水平等有著不同程度的影響[4]。轉(zhuǎn)座子的含量和種類(lèi)在不同的生物基因組中存在較大的差異，根據(jù)其轉(zhuǎn)座的不同機(jī)制，大致可分為ClassⅠ和ClassⅡ兩大類(lèi)[5]。ClassⅠ型轉(zhuǎn)座子以RNA為中間媒介進(jìn)行轉(zhuǎn)座，可以自身合成逆轉(zhuǎn)錄酶然后將其本身反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以“復(fù)制-粘貼”的形式整合到另一個(gè)位點(diǎn)，由于其逆轉(zhuǎn)錄的特性又被稱(chēng)為逆轉(zhuǎn)座子（retrotransposon）[6]。ClassⅡ型轉(zhuǎn)座子以DNA為中間媒介進(jìn)行轉(zhuǎn)座，與ClassⅠ型不同的是此類(lèi)轉(zhuǎn)座子在轉(zhuǎn)座酶的作用下從原位點(diǎn)直接切除并重新整合至新位點(diǎn)，以“剪切-粘貼”的形式進(jìn)行轉(zhuǎn)座，因此也被稱(chēng)為DNA轉(zhuǎn)座子（DNA transposon）[7]。

微型反向重復(fù)轉(zhuǎn)座元件MITEs屬于ClassⅡ型DNA轉(zhuǎn)座子中的TIR類(lèi)轉(zhuǎn)座子，不具備編碼轉(zhuǎn)座酶的能力，屬于非自主型轉(zhuǎn)座元件（non-autonomous transposable elements）[5]。此類(lèi)基因組元件首先在植物中發(fā)現(xiàn)[8]，并在后續(xù)的研究中發(fā)現(xiàn)廣泛存在于各種生物體基因組中，包括脊椎動(dòng)物[9]，無(wú)脊椎動(dòng)物[10]，真菌[11]以及病毒[12]。通常MITEs轉(zhuǎn)座子具有以下典型特征：①轉(zhuǎn)座子兩端為末端反向互補(bǔ)的重復(fù)序列（terminal inverted repeat,TIR）；②在轉(zhuǎn)座子TIR外兩側(cè)為具有正向重復(fù)的靶位點(diǎn)重復(fù)序列（target site duplication,TSD）；③中間為無(wú)編碼能力的序列，該序列中AT含量較高，有形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的趨勢(shì)；④完整片段長(zhǎng)度較短，一般在50～800 bp之間[13]。MITEs轉(zhuǎn)座子通過(guò)借助與其TIR序列高度相似的對(duì)應(yīng)自主轉(zhuǎn)座子編碼的轉(zhuǎn)座酶進(jìn)行轉(zhuǎn)座，但其拷貝數(shù)通常高于其對(duì)應(yīng)的自主轉(zhuǎn)座子[5]。

MITEs轉(zhuǎn)座子在植物基因組中的頻繁轉(zhuǎn)座以及高拷貝數(shù)等特性對(duì)其宿主基因組結(jié)構(gòu)多樣性（如等位基因多態(tài)性）有著至關(guān)重要的影響，甚至影響宿主相關(guān)基因的表達(dá)從而影響表型[14]。這種現(xiàn)象在桑葚（Morus notabilis）[15]、葡萄（Vitis viniferaL.）[16]、胡蘿卜（Daucus carota）[17]和小麥（Triticum-Aegilopsgroup）[18]等多種植物基因組中都有報(bào)道，說(shuō)明了MITEs的存在及轉(zhuǎn)座活動(dòng)對(duì)宿主影響的普遍性。植物MITEs轉(zhuǎn)座子數(shù)據(jù)庫(kù)P-MITE于2014年建立并投入使用[19]，該數(shù)據(jù)庫(kù)整理了一些植物基因組中MITEs轉(zhuǎn)座子的初步鑒定和分類(lèi)結(jié)果，是植物基因組MITEs研究過(guò)程中一個(gè)良好的參考平臺(tái)，由該數(shù)據(jù)庫(kù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表1）可知，總體上MITEs轉(zhuǎn)座子在各植物基因組中具有較高的拷貝數(shù)和含量。

表1 MITEs轉(zhuǎn)座子在植物基因組中的含量[19]Table 1 MITEs content in plant genomes[19]

紅毛丹（Nephelium lappaceumLinn）屬于無(wú)患子科熱帶水果，其果肉、種子和樹(shù)干等都具有很高的應(yīng)用價(jià)值，如果肉可做成果醬，樹(shù)干可用于建筑材料，種仁油可制成肥皂和蠟燭，因此具有極大的商業(yè)價(jià)值[20]。紅毛丹高質(zhì)量基因組的公布，為紅毛丹功能基因組學(xué)及基因組演化方面的研究提供了良好的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)[21]，而轉(zhuǎn)座子存在于幾乎所有的真核生物基因組中，并對(duì)其宿主基因組演化、基因表達(dá)調(diào)控及表型可塑性有著不可忽視的影響[13,22-23]，在紅毛丹中還沒(méi)有對(duì)MITEs轉(zhuǎn)座子進(jìn)行過(guò)系統(tǒng)的鑒定和分析，由此本研究利用紅毛丹全基因組數(shù)據(jù)來(lái)鑒定、分類(lèi)并注釋紅毛丹基因組中的MITEs轉(zhuǎn)座子，以期完善紅毛丹基因組的注釋并促進(jìn)其轉(zhuǎn)座子的研究，為紅毛丹基因組演化和相關(guān)基因功能方面的分析提供關(guān)鍵的數(shù)據(jù)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 紅毛丹基因組中MITEs轉(zhuǎn)座子的鑒定與注釋

本實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)完成紅毛丹基因組組裝及相關(guān)基因注釋[21]，選用MITE-Tracker軟件[24]對(duì)紅毛丹基因組中的MITEs轉(zhuǎn)座子進(jìn)行搜尋，設(shè)置參數(shù)為‘-tsd_min_len 2-tsd_max_len 10-mite_min_len 50-mite_max_len 650’，MITE-Tracker對(duì)基因組中具有MITEs轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)且滿(mǎn)足參數(shù)條件的序列提取出來(lái)并聚類(lèi)為不同的家族，由于目前沒(méi)有軟件可以精確辨認(rèn)所有MITEs轉(zhuǎn)座子的邊界，因此后續(xù)需要提取出每個(gè)家族成員的序列，對(duì)每個(gè)家族運(yùn)用MUSCLE-3.7[25]軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，對(duì)邊界有缺失的序列擴(kuò)展前后50 bp，再提取出對(duì)應(yīng)的序列重新進(jìn)行多序列比對(duì)，運(yùn)用BioEdit-7.0.9.0[26]軟件對(duì)所得的各家族序列TIR末端進(jìn)行人工矯正，并按照所總結(jié)的MITEs轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)匯總表對(duì)各個(gè)家族進(jìn)行超家族分類(lèi)注釋?zhuān)ū?），最后運(yùn)用卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)深度學(xué)習(xí)軟件DeepTE[27]對(duì)注釋結(jié)果及MITEs序列進(jìn)行修改驗(yàn)證。運(yùn)用DAMBE-7軟件[28]計(jì)算每個(gè)MITEs超家族的一致序列（consensus sequence）。完成轉(zhuǎn)座子注釋后，計(jì)算鑒定出的MITEs序列中腺嘌呤脫氧核糖核酸和胸腺嘧啶脫氧核糖核酸（A和T）的比例，并統(tǒng)計(jì)每個(gè)超家族在紅毛丹基因組中所占的比例。

表2 MITEs轉(zhuǎn)座子超家族分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Classification criteria for MITEs superfamilies

1.2 MITEs轉(zhuǎn)座子各家族進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

對(duì)各家族的一致序列進(jìn)行多序列比對(duì)后，利用MEGA-X[29]軟件構(gòu)建各個(gè)家族代表序列的neighbor-joining進(jìn)化樹(shù)，校驗(yàn)Bootstrap參數(shù)設(shè)置為1 000次，用iTOL（https://itol.embl.de/）在線(xiàn)軟件對(duì)進(jìn)化樹(shù)運(yùn)行結(jié)果進(jìn)行注釋及可視化。

1.3 MITEs轉(zhuǎn)座子插入時(shí)間的估算

選取K2P模型（Kimura 2 parameter distances）計(jì)算每個(gè)MITEs拷貝的插入時(shí)間[30]，從而了解MITEs轉(zhuǎn)座子在紅毛丹基因組中的擴(kuò)增情況。首先使用R語(yǔ)言程序包ape（http://ape-package.ird.fr/），結(jié)合公式K=-1/2ln(1-2p-q)-1/4ln(1-2q)（q代表顛換位點(diǎn)所占比例，p代表轉(zhuǎn)換位點(diǎn)所占比例）計(jì)算每個(gè)MITEs完整拷貝與相應(yīng)超家族一致序列（假定祖先序列）之間的遺傳距離，然后運(yùn)用公式T=K/2r（K為完整拷貝MITEs序列與一致序列之間的遺傳距離，r為核苷酸位點(diǎn)替換速率）[31]計(jì)算每個(gè)轉(zhuǎn)座子的插入時(shí)間，在本研究中采用1.38×10-8作為核苷酸位點(diǎn)替換速率。

1.4 MITEs轉(zhuǎn)座子插入位置及密度分布分析

利用軟件MITE-Tracker所產(chǎn)生的MITEs轉(zhuǎn)座子注釋文件，結(jié)合紅毛丹基因組注釋文件中各元素的長(zhǎng)度、位置和正反鏈等信息，統(tǒng)計(jì)每個(gè)轉(zhuǎn)座子在基因組中的位置，主要對(duì)以下位置的插入進(jìn)行統(tǒng)計(jì)：基因5′端（5 kb以?xún)?nèi)）、基因3′端（5 kb以?xún)?nèi)）和基因（內(nèi)含子和外顯子），若MITEs序列任意位點(diǎn)的坐標(biāo)在上述區(qū)域坐標(biāo)之內(nèi)，則統(tǒng)計(jì)一次插入，最后將所有轉(zhuǎn)座子的插入位置信息及插入次數(shù)進(jìn)行整合。獲得紅毛丹基因和MITEs轉(zhuǎn)座子在基因組中的坐標(biāo)信息后，利用R語(yǔ)言程序包gtrellis（https://www.statmethods.net/advgraphs/trellis.html）繪制基因和轉(zhuǎn)座子在紅毛丹各染色體上的密度分布圖，通過(guò)比較分析MITEs轉(zhuǎn)座子在紅毛丹染色體上的插入分布模式。

1.5 MITEs轉(zhuǎn)座子在基因附近的插入偏好性分析

提取紅毛丹基因組注釋文件中每個(gè)基因的坐標(biāo)和距離紅毛丹基因5′端和3′端5 kb以?xún)?nèi)的MITEs的相關(guān)注釋信息，分別劃分為10個(gè)區(qū)段（每個(gè)區(qū)段長(zhǎng)500 bp），共計(jì)20個(gè)區(qū)段，按照與基因末端坐標(biāo)由遠(yuǎn)到近的距離依次統(tǒng)計(jì)各區(qū)段中MITEs轉(zhuǎn)座子的插入次數(shù)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化從而分析轉(zhuǎn)座子的分布情況與基因距離之間的關(guān)系。

1.6 MITEs轉(zhuǎn)座子插入的基因功能富集分析

使用R語(yǔ)言程序包ClusterProfile V3.8（https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/clusterProfiler.html）對(duì)MITEs轉(zhuǎn)座子鄰近的基因進(jìn)行GO富集分析，將得到的結(jié)果按分子功能（MF）、生物過(guò)程（BP）和細(xì)胞組成（CC）3部分分類(lèi)，取最顯著的前20個(gè)term進(jìn)行展示比較，然后對(duì)MITEs轉(zhuǎn)座子鄰近的基因進(jìn)KEGG富集分析，取最顯著的前20個(gè)term進(jìn)行展示比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅毛丹基因組中MITEs轉(zhuǎn)座子的鑒定及分類(lèi)

本研究共鑒定出MITEs轉(zhuǎn)座子完整拷貝588條，全長(zhǎng)325 kb，大約占紅毛丹全基因組總長(zhǎng)（328 Mb）的0.10%，占紅毛丹轉(zhuǎn)座子總長(zhǎng)度（131.95 Mb）的0.25%，與其他植物基因組中MITEs的占比相比，其含量相對(duì)較低。對(duì)邊界不完整的MITEs拷貝進(jìn)行人工矯正（圖1），根據(jù)MITEs轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)匯總表的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)軟件MITE-Traker所生成的所有家族進(jìn)行分類(lèi)。經(jīng)反復(fù)比對(duì)及RepeatMasker中重復(fù)序列數(shù)據(jù)庫(kù)和DeepTE軟件訓(xùn)練模型進(jìn)行深度學(xué)習(xí)驗(yàn)證，得到紅毛丹基因組中MITEs轉(zhuǎn)座子的超家族：PIF/Harbinger、Mutator、Ac-mMITE、hAT和Ginger，其余無(wú)法分類(lèi)的轉(zhuǎn)座子歸為Unknown（UN）。各個(gè)超家族在紅毛丹基因組MITEs轉(zhuǎn)座子總量中所占的比例差異較大（表3），這可能與不同MITEs轉(zhuǎn)座子所對(duì)應(yīng)的自主轉(zhuǎn)座子的拷貝量和活性相關(guān)，其中最大的兩個(gè)超家族為PIF/Harbinger和Mutator，分別有362條和108條完整拷貝，在紅毛丹基因組MITEs中的占比分別為64.87%和19.35%，最小的超家族為Ac-mMITE，只有10條完整拷貝，占比為1.80%。

表3 紅毛丹基因組中MITEs超家族統(tǒng)計(jì)Table 3 Statistics of superfamilies of MITEs in rambutan genome

圖1 MITEs轉(zhuǎn)座子手工矯正TIR序列對(duì)比圖Figure 1 Comparison plots for correction of MITEs TIR sequence

2.2 紅毛丹基因組中MITEs轉(zhuǎn)座子的AT含量

紅毛丹基因組中MITEs在總體上AT堿基含量的占比為70.63%，其中AT堿基含量比例最高的超家族為Ac-mMITE（78.22%），其次為PIF/Harbinger超家族（76.00%），因此這兩種超家族結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較低，形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的趨勢(shì)較高（表4），有利于轉(zhuǎn)座活動(dòng)。AT堿基數(shù)含量較低的超家族為Ginger（37.98%），遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于總體水平，因此這類(lèi)超家族形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的趨勢(shì)較低。

表4 紅毛丹基因組中MITEs轉(zhuǎn)座子AT堿基含量統(tǒng)計(jì)Table 4 Statistics on AT bases content of MITEs in rambutan genome

2.3 紅毛丹基因組中MITEs的插入時(shí)間

紅毛丹基因組中MITEs轉(zhuǎn)座子共經(jīng)歷了5次轉(zhuǎn)座“爆發(fā)”（圖2），其中最早的一次“爆發(fā)”大約發(fā)生于17～18百萬(wàn)年之前，規(guī)模最小，參與的超家族僅有hAT和PIF/Harbinger兩種；最近一次的轉(zhuǎn)座“爆發(fā)”則發(fā)生于1～2百萬(wàn)年之前，MITEs插入數(shù)量?jī)H次于規(guī)模最大的一次，有將近80個(gè)MITEs轉(zhuǎn)座子參與其中，包括Ginger、hAT、Mutator和PIF/Harbinger超家族；規(guī)模最大的一次轉(zhuǎn)座“爆發(fā)”發(fā)生于4～5百萬(wàn)年之前，超過(guò)80個(gè)MITEs轉(zhuǎn)座子參與，雖然此次轉(zhuǎn)座“爆發(fā)”事件規(guī)模最大，但參與其中的超家族組成卻較為簡(jiǎn)單，只有Mutator和PIF/Harbinger兩種超家族。值得注意的是，在轉(zhuǎn)座子的各個(gè)插入時(shí)期中幾乎每個(gè)時(shí)期都有超家族PIF/Harbinger的參與，并且在各個(gè)時(shí)期MITEs的含量上幾乎占據(jù)主導(dǎo)地位，而Ac-mMITE只參與到少數(shù)幾個(gè)時(shí)期的轉(zhuǎn)座事件中且所占比例極小，這與前文中對(duì)各個(gè)轉(zhuǎn)座子含量分析的結(jié)果相一致。

圖2 紅毛丹基因組中MITEs轉(zhuǎn)座子插入時(shí)間Figure 2 The insertion time of MITEs in rambutan genome

2.4 紅毛丹基因組MITEs各家族演化樹(shù)分析

在系統(tǒng)發(fā)育演化樹(shù)中（圖3），隸屬于同一個(gè)超家族的各個(gè)亞家族一般具有很近的演化關(guān)系，總體上各家族具有較好的聚類(lèi)效果，這從側(cè)面反映了本研究中所應(yīng)用的MITEs轉(zhuǎn)座子分類(lèi)方法的準(zhǔn)確率較高。從演化樹(shù)的分支數(shù)來(lái)看，PIF/Harbinger超家族的亞家族數(shù)最多，主要分為4個(gè)類(lèi)群，這與該超家族作為轉(zhuǎn)座“爆發(fā)”事件的主要參與者經(jīng)歷了多輪擴(kuò)增有關(guān)，其次為Mutator，主要分為2個(gè)類(lèi)群，亞家族最少的超家族為Ac-mMITE和Ginger，這些結(jié)果也與它們?cè)诩t毛丹基因組中含量的高低順序及轉(zhuǎn)座“爆發(fā)”事件參與度相一致。未被鑒定出的4個(gè)超家族（unknown）中F20、F24、F28和F29分別與PIF/Harbinger、Mutaor、Ginger和hAT超家族具有較近的演化關(guān)系，但由于在基因組演化過(guò)程中這幾個(gè)超家族典型的結(jié)構(gòu)完整性已經(jīng)缺失，無(wú)法根據(jù)其TIR和TSD序列判斷其超家族的類(lèi)型。

圖3 MITEs轉(zhuǎn)座子各家族進(jìn)化樹(shù)Figure 3 Phylogenetic tree of MITEs families

2.5 MITEs轉(zhuǎn)座子插入位置及插入密度分布分析

MITEs轉(zhuǎn)座子在紅毛丹基因組各個(gè)位置上的分布顯示出了較大的差異，在基因5′端（5′-flank）和基因3′端（3′-flank）的插入數(shù)量最多，分別為136個(gè)和137個(gè)，說(shuō)明MITEs轉(zhuǎn)座子的插入主要分布在紅毛丹基因兩端的位置，且兩端插入數(shù)量基本持平（表5）。紅毛丹基因（gene）內(nèi)部插入的MITEs總數(shù)為35個(gè)，其中插入內(nèi)含子（intron）的MITEs數(shù)為35個(gè)，插入外顯子（exon）的MITEs數(shù)為2個(gè)，其中有2個(gè)MITEs轉(zhuǎn)座子插入?yún)^(qū)域橫跨相鄰的外顯子和內(nèi)含子區(qū)段。分析紅毛丹基因組中MITEs轉(zhuǎn)座子和基因的分布密度（圖4），發(fā)現(xiàn)MITEs轉(zhuǎn)座子在紅毛丹各條染色體上的總體插入比較分散，每條染色體上都有一定數(shù)量的插入，但是密度相對(duì)較低。MITEs轉(zhuǎn)座子在基因分布較多的區(qū)域密度相對(duì)較高，說(shuō)明在紅毛丹基因組中該類(lèi)轉(zhuǎn)座子具有插入到基因密度較高區(qū)域的趨勢(shì)。

表5 紅毛丹基因組中MITEs轉(zhuǎn)座子插入分布Table 5 Insertion distribution of MITEs in rambutan genome

圖4 基因和MITEs轉(zhuǎn)座子插入密度分布的比較Figure 4 Comparison of density distribution between genes and MITEs

2.6 MITEs轉(zhuǎn)座子在基因附近插入偏好性分析

由紅毛丹基因組中MITEs轉(zhuǎn)座子在基因附近插入位置的分布（圖5）可知，MITEs轉(zhuǎn)座子在基因兩端分布較多。在距離紅毛丹基因5′端5 kb范圍內(nèi)，-500～0區(qū)段MITEs轉(zhuǎn)座子插入次數(shù)只有12次，隨著與基因的距離越來(lái)越遠(yuǎn)，在-2 000～-1 501區(qū)段插入次數(shù)達(dá)到峰值，有34次轉(zhuǎn)座子的插入，隨后隨著距離增加插入次數(shù)逐漸減少。在距離紅毛丹基因3′端5 kb范圍內(nèi)，0～500區(qū)段MITEs轉(zhuǎn)座子插入次數(shù)為0，隨著與基因距離越來(lái)越遠(yuǎn)次數(shù)逐漸增加，在3 501～4 000區(qū)段MITEs插入次數(shù)達(dá)到峰值，有27次轉(zhuǎn)座子的插入，隨后插入數(shù)逐漸減少。綜上，在基因兩側(cè)5 kb范圍以?xún)?nèi)，MITEs轉(zhuǎn)座子插入偏好的情況為，距離基因兩側(cè)最近的區(qū)段，MITEs轉(zhuǎn)座子的插入數(shù)最少，隨著距離增加在某一區(qū)段MITEs轉(zhuǎn)座子的插入偏好會(huì)達(dá)到峰值，然后又繼續(xù)減少，在總體趨勢(shì)上呈現(xiàn)出5 kb以?xún)?nèi)從離基因較遠(yuǎn)的某一點(diǎn)開(kāi)始，距離基因越近，MITEs插入偏好性越低的分布模式，說(shuō)明距離基因較近的區(qū)域，MITEs的轉(zhuǎn)座活動(dòng)受到了明顯的抑制。

圖5 MITEs轉(zhuǎn)座子在基因附近的分布情況Figure 5 Distribution of MITEs near the genes

2.7 MITEs轉(zhuǎn)座子關(guān)聯(lián)基因的功能富集分析

在MITEs插入到內(nèi)部的基因中，有4個(gè)含有GO編號(hào)（圖6），基因編號(hào)（表6）分別為：Nl01g01800、Nl01g10720、Nl01g15070和Nl10g00860，這些基因主要參與硫代葡萄糖苷的代謝及生物合成過(guò)程（GO:0019757和GO:0019758）、葡糖異硫氰酸鹽的代謝及生物合成過(guò)程（GO:0019760和GO:0019761）和S-糖苷的代謝及生物合成過(guò)程（GO:0016143和GO:0016144）。分子功能方面，這些基因與各種蛋白復(fù)合物的結(jié)合相關(guān)（GO:0005488、GO:0005515、GO:0008017、GO:0008092、GO:0015631、GO:0032403、GO:0044877和GO:0051011），其次為酶活性功能相關(guān)基因（GO:0003824、GO:0016853、GO:0016866和GO:0050486），而這些功能對(duì)于相關(guān)活性物質(zhì)的代謝及生物合成過(guò)程至關(guān)重要。在KEGG富集結(jié)果中（圖6），這些基因（表6）主要富集在次級(jí)代謝物生物合成、角質(zhì)、軟木脂蠟質(zhì)的生物合成、N端多糖的生物合成和硫代葡萄糖苷的生物合成等方面，這些代謝相關(guān)通路與上述GO生物過(guò)程和分子功能富集結(jié)果基本一致。

圖6 MITEs轉(zhuǎn)座子插入內(nèi)部基因功能富集分析結(jié)果Figure 6 Gene functional enrichment of inside inserted gene

在MITEs插入到5′端5kb范圍內(nèi)的基因中，有2個(gè)含有GO編號(hào)（圖7），基因編號(hào)（表6）分別為：N101g14070和N101g01800，這些基因主要參與生物 體 生 殖（GO:0000003、GO:0022414和 GO:0044702）及發(fā)育（GO:0032502、GO:0044767、GO:0009790和GO:0010154等）的相關(guān)過(guò)程。分子功能方面，這些基因與各種復(fù)合物的結(jié)合相關(guān)（GO:0000166、GO:0005515、GO:0005524和 GO:0008092等），這些功能是生物體生殖發(fā)育過(guò)程中必不可少的關(guān)鍵要素。在KEGG富集結(jié)果中（圖7），這些基因（表6）主要富集在次級(jí)代謝物的生物合成、類(lèi)苯基丙烷的生物合成、氮代謝和氨基酸的生物合成等方面，是生物生殖和發(fā)育過(guò)程中必不可少的環(huán)節(jié)。

表6 MITEs關(guān)聯(lián)基因NR注釋結(jié)果Table 6 NR annotation of MITEs inserted genes

圖7 MITEs轉(zhuǎn)座子插入5'端側(cè)翼區(qū)的基因功能富集分析結(jié)果Figure 7 Gene functional enrichment of 5'-flank inserted gene

3 討論

轉(zhuǎn)座子最初由巴巴拉·邁克林托克于20世紀(jì)40年代在玉米（Zea mays）的第9條染色體中發(fā)現(xiàn)[32]，然而在很長(zhǎng)一段時(shí)間里轉(zhuǎn)座子這類(lèi)重復(fù)序列被認(rèn)為是“垃圾基因”，直到近二十年來(lái)隨著全基因組測(cè)序技術(shù)的蓬勃發(fā)展為各個(gè)物種中轉(zhuǎn)座子的全面鑒定、分類(lèi)及注釋帶來(lái)了先決條件，越來(lái)越多的轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)、功能和應(yīng)用方面的謎題被逐漸揭開(kāi)[33-34]，這時(shí)人們才發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子對(duì)染色體結(jié)構(gòu)[35]、基因組重排[36]、基因組大小[37]、新基因的形成[38]以及基因表達(dá)調(diào)控[39]等方面都有著較為顯著的影響。

本研究中，MITEs屬于非自主型轉(zhuǎn)座子，必須依賴(lài)與其同源的自主轉(zhuǎn)座子編碼的轉(zhuǎn)座酶進(jìn)行移位，再插入到基因組的其他位點(diǎn)，因此自主轉(zhuǎn)座子的活性及編碼序列完整性決定了其同源MITEs轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座效率及拷貝量。由于轉(zhuǎn)座子受到選擇壓力，根據(jù)轉(zhuǎn)座子的發(fā)展史，自主轉(zhuǎn)座元件的活性及結(jié)構(gòu)完整性在基因組演化過(guò)程中可能會(huì)隨著時(shí)間發(fā)生消退，隨后其對(duì)應(yīng)的非自主轉(zhuǎn)座元件拷貝數(shù)也開(kāi)始逐漸減少[40]，紅毛丹中MITEs的含量相對(duì)較低，這可能與其基因組中自主DNA轉(zhuǎn)座子的活性[5]和其在雙子葉基因組三倍化事件之后沒(méi)有再發(fā)生過(guò)另外的全基因組復(fù)制事件有關(guān)[21]。在所有MITEs超家族中，PIF/Harbinger的相對(duì)含量占據(jù)主導(dǎo)地位且在各個(gè)MITEs的轉(zhuǎn)座“爆發(fā)”時(shí)期貢獻(xiàn)度最高，而AcmMITE相對(duì)含量最低且在MITEs的轉(zhuǎn)座“爆發(fā)”的各個(gè)時(shí)期貢獻(xiàn)度最低，因此可以推測(cè)PIF/Harbinger的自主轉(zhuǎn)座子在近期轉(zhuǎn)座子擴(kuò)增的過(guò)程中仍具有較高的活性和結(jié)構(gòu)完整性，而超家族Ac-mMITE的擴(kuò)增活性最低，其大部分同源的自主轉(zhuǎn)座子可能已經(jīng)失去活性及結(jié)構(gòu)完整性。另外，MITEs轉(zhuǎn)座“爆發(fā)”事件在一定程度上可以反映植物基因組演化歷史中的重要事件，并且在宿主基因組可塑性和轉(zhuǎn)錄應(yīng)答的改變上可能有一定的貢獻(xiàn)[41]，比如Chen J.等在水稻的重組近交系中研究由轉(zhuǎn)座元件爆發(fā)所產(chǎn)生的基因組多樣性現(xiàn)象時(shí)發(fā)現(xiàn)Ping/mPing轉(zhuǎn)座子會(huì)影響其宿主基因組的多態(tài)性[35]，說(shuō)明轉(zhuǎn)座子對(duì)基因組的演化具有重要意義。由此可見(jiàn)，MITEs轉(zhuǎn)座子在紅毛丹基因組中的轉(zhuǎn)座活動(dòng)必然會(huì)對(duì)基因組結(jié)構(gòu)和演化活動(dòng)造成一定的影響。

在MITEs插入內(nèi)部的基因功能富集分析中，MITEs插入到某些通路相關(guān)基因的內(nèi)部會(huì)改變?cè)摶虻慕Y(jié)構(gòu)，從而最終影響到通路本身，甚至改變宿主的某些性狀，Wei L.等在水稻的赤霉素及油菜素甾醇合成途徑中發(fā)現(xiàn)，如果該通路的關(guān)鍵基因有MITEs的插入會(huì)影響其旗葉夾角和水稻株高等相關(guān)性狀[42]。在蔬菜和水果中有大量以葡萄糖苷形式存在的非揮發(fā)性風(fēng)味前體物質(zhì)，是蔬菜水果增香的重要大分子[43]，而MITEs轉(zhuǎn)座子在這些化合物通路相關(guān)基因的插入可能會(huì)改變葡萄糖苷、葡糖異硫氰酸鹽和S-糖苷的代謝及生物合成相關(guān)基因的編碼序列，最終對(duì)紅毛丹相關(guān)風(fēng)味等重要農(nóng)藝性狀造成影響。在MITEs插入到5′端基因的功能富集分析中，有兩個(gè)基因主要與生物體的生殖發(fā)育等過(guò)程相關(guān)，而基因5′端是基因順式調(diào)控元件所在的區(qū)域，MITEs轉(zhuǎn)座子在這些區(qū)域的插入可能會(huì)對(duì)紅毛丹生殖發(fā)育相關(guān)的表型造成影響，如Y.Lee等在玉米中研究一種轉(zhuǎn)座子監(jiān)督機(jī)制保護(hù)雄性玉米植株生育能力的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座活動(dòng)會(huì)增加基因組的不穩(wěn)定性，從而可能產(chǎn)生雄性不育的表型[44]。在MITEs插入位置分析中，插入到基因內(nèi)部的MITEs比例很低，其中大多數(shù)MITEs插入到了內(nèi)含子當(dāng)中，會(huì)在被插入基因的結(jié)構(gòu)上產(chǎn)生一定程度的改變，甚至影響可變剪切，少數(shù)MITEs插入到了外顯子中，在這些基因的功能方面可能會(huì)造成直接影響。

MITEs在紅毛丹基因組中插入密度與基因分布密度具有較高的相關(guān)性，而且大量MITEs插入到了紅毛丹基因的5′端和3′端附近，這種大量在基因附近的轉(zhuǎn)座活動(dòng)可能會(huì)在基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的水平上對(duì)基因功能產(chǎn)生影響，最終可能改變宿主表型，產(chǎn)生表型可塑性的改變，如E.Butelli等在血橙的表型研究中發(fā)現(xiàn)當(dāng)Copia-like反轉(zhuǎn)座子插入Ruby基因編碼區(qū)上游并受到一定寒冷誘導(dǎo)時(shí)，會(huì)使其產(chǎn)生紅色果肉的表型[45]。同樣，紅毛丹中MITEs轉(zhuǎn)座子在這些區(qū)域的轉(zhuǎn)座事件可能在轉(zhuǎn)錄和后轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)其基因的表達(dá)調(diào)控有一定的影響，至于影響水平的高低，是否會(huì)改變相關(guān)的性狀，需要后續(xù)對(duì)其進(jìn)行更加詳細(xì)的分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，Chen L.等學(xué)者在菠蘿基因組及其馴化過(guò)程的研究中發(fā)現(xiàn)，MITEs轉(zhuǎn)座子在菠蘿基因附近的插入位置具有高度多樣性，推測(cè)這一現(xiàn)象在菠蘿馴化過(guò)程中可能會(huì)通過(guò)體細(xì)胞突變作為菠蘿新性狀形成的主要來(lái)源之一[46]。隨著越來(lái)越多MITEs轉(zhuǎn)座子的鑒定及相關(guān)分析的細(xì)化，MITEs在其宿主基因組的演化及相關(guān)性狀的多樣性上所扮演的角色會(huì)逐漸明朗，對(duì)這些信息及相關(guān)效應(yīng)的充分利用可以為其宿主基因組演化及性狀改良等方面的研究帶來(lái)更多的途徑。