箬葉抑菌提取物提取工藝優(yōu)化及抑菌活性

劉立萍 徐 鵬 雷小紅 王 寧 楊 兵

箬葉是箬竹植物的葉。中國(guó)箬竹約有20種以上，主要分布在長(zhǎng)江以南地區(qū)[1]，其中闊葉箬竹分布最廣，民間使用也最廣泛[2]。研究[3-4]表明，箬葉具有一定的防腐抑菌功效，是很好的植物源天然防腐抑菌劑來源。

截至目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)箬葉的研究主要關(guān)注其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和元素含量[5-7]，以及揮發(fā)油[8]、總黃酮[9-11]、多糖[12]等活性物質(zhì)的提取、分離與測(cè)試，其提取物中黃酮類、多糖、生物堿等均具有較好的抑菌殺菌作用[9]。李俊超等[13]研究發(fā)現(xiàn)箬竹葉的提取物對(duì)煙草病原真菌鏈格孢菌和煙草疫霉菌菌絲生長(zhǎng)均具有抑制效果。孫克奎[12]研究發(fā)現(xiàn)，箬葉多糖對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌有很強(qiáng)的抑制效果，對(duì)地衣芽孢桿菌也有較明顯的抑制效果。樂薇等[14]和吉瑞冬等[15]研究箬葉總黃酮提取和對(duì)細(xì)菌(金黃色葡萄球菌、大腸桿菌)、真菌(白色念珠菌、釀酒酵母菌、青霉菌)的抑菌作用，發(fā)現(xiàn)箬葉總黃酮對(duì)細(xì)菌的抑制效果大于對(duì)真菌的抑制效果；并且不同提取方法對(duì)箬葉總黃酮的抑菌效果有影響，超聲波法比較適合于箬葉總黃酮的提取。何舟等[16]研究了箬葉水提取物和乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抑菌活性的影響，發(fā)現(xiàn)水提取物比乙醇提取物的抑菌作用強(qiáng)。鄧龍興等[17]用菌絲生長(zhǎng)速率法比較研究了箬竹葉粗提物及其萃取相對(duì)深綠木霉和煙草鏈格孢菌生長(zhǎng)率的影響，發(fā)現(xiàn)正丁醇相對(duì)深綠木霉的抗菌活性最高，乙酸乙酯相對(duì)煙草鏈格孢菌的抗菌活性最高。Sun等[18-19]用95%乙醇對(duì)箬葉抗菌成分進(jìn)行提取和分離，發(fā)現(xiàn)有兩種竹葉提取物具有良好的清除自由基、抗氧化、抗菌、抗病毒、增強(qiáng)免疫力等生物功效；同時(shí)也對(duì)分離得到的化合物進(jìn)行了體外抗菌活性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)芹菜素6-C-α-L-阿拉伯吡喃糖基-8-C-β-D-吡喃葡萄糖苷(5)和芹菜素7-O，8-C-二吡喃葡萄糖苷(6)對(duì)4株細(xì)菌(金黃色葡萄球菌、蘇云金芽孢桿菌、大腸桿菌和青枯假單胞菌)均有抑菌活性。這些研究對(duì)箬葉提取物抑菌活性和提取方法都比較局限，抑菌試驗(yàn)方法均為濾紙片法，指示菌未涵蓋銅綠假單胞菌、痢疾志賀氏菌和傷寒沙門氏菌。研究擬以常見致病菌(痢疾志賀氏菌和沙門氏菌)和腐敗菌(枯草桿菌和銅綠假單胞菌)為試驗(yàn)菌，選擇闊葉箬竹葉為試驗(yàn)材料，研究提取物的抑菌效果，探明箬葉中抑菌成分最佳提取工藝。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

闊葉箬竹的葉：2021年4月15日采自懷化市洪江區(qū)；

枯草芽孢桿菌[Bacillussubtilis，CMCC(B)63501]、銅綠假單胞菌[Pseudomonasaeruginoda(Schroeter)Migula，ATCC9027-1]、痢疾志賀氏菌[Shigelladysenteriae，CMCC(B)51252]和傷寒沙門氏菌[S.typhi，CMCC(B)50071]：-80 ℃保存，中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心；

抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅱ號(hào)(高)：青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；

慶大霉素國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：批號(hào)130326-201716，中國(guó)食品藥品檢定研究院；

乙醇：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

鹽酸、氨水：優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

冰醋酸：分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；

乙酸乙酯：色譜純，天津化學(xué)試劑研究所。

1.2 主要儀器與設(shè)備

中藥材高速粉碎機(jī)：FD-15-T250A型，上海市閔行區(qū)艦艇工貿(mào)有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-52AA型，上海雅榮生化儀器設(shè)備有限公司；

立式滅菌器：LMQ.C-80E型，山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；

Ⅱ級(jí)A2生物安全柜：1374型，賽默飛世爾(蘇州)儀器有限公司；

超低溫冰箱：DW-HL388型，中科美菱低溫科技股份有限公司；

生化培養(yǎng)箱：SPX-150型，上海金慧科電子有限公司；

超聲清洗機(jī)：9960B型，天津科貝爾光電技術(shù)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)系列制備 按文獻(xiàn)[20]的方法配制0.01，0.02，0.03，0.04，0.05 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，用于抑菌試驗(yàn)參比。

1.3.2 試驗(yàn)菌種復(fù)壯和菌懸液制備 按文獻(xiàn)[20]的方法復(fù)壯試驗(yàn)菌，制備約1×107CFU/mL的菌懸液用于抑菌試驗(yàn)。

1.3.3 試驗(yàn)菌平板的制作 在試驗(yàn)中，微生物平板表層均勻平鋪了試驗(yàn)菌的稱為試驗(yàn)菌平板，平板表層為菌層培養(yǎng)基，下層為底層培養(yǎng)基。

取抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅱ號(hào)(高pH) 100 mL于200 mL無菌廣口瓶，置于(46±1) ℃水浴，依次接入1 mL菌懸液，混勻，趁熱取5 mL，迅速平鋪到底層培養(yǎng)基平板，冷卻凝固，即得4種不同試驗(yàn)菌平板，供提取物抑菌試驗(yàn)使用。

1.3.4 箬葉處理 鮮葉洗凈，50～55 ℃烘干，粉碎，過42目篩，密封。

1.3.5 提取物制備

(1) 不同溶劑提取物：分別稱取9份箬葉粉未10 g于250 mL三角瓶中，依次加入100 mL水、乙酸乙酯、鹽酸溶液(pH 4)、乙酸水溶液(pH 4)、氨水溶液(pH 10)、30%(體積分?jǐn)?shù))乙醇、60%(體積分?jǐn)?shù))乙醇、80%(體積分?jǐn)?shù))乙醇和95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇9種提取溶劑，浸泡24 h，再超聲2次，超聲條件為溫度45 ℃，時(shí)間30 min，2次提取液合并，然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(水浴50 ℃)，減壓濃縮至10 mL，每毫升提取液相當(dāng)于1 g干樣。

(2) 不同方法提取物：選擇水、60%(體積分?jǐn)?shù))乙醇、鹽酸水溶液(pH 4)、氨水溶液(pH 10) 4種代表性提取溶劑，稱取12份箬葉粉未，每份10 g，分成4組，每種溶劑按液固比10∶1 (mL/g)，分別用超聲輔助法(40 kHz，400 W，45 ℃，30 min)、回流法(60%乙醇回流溫度80 ℃，其他100 ℃)和浸提法(室溫，24 h) 3種方法進(jìn)行提取，提取2次，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(水浴50 ℃)，減壓濃縮至10 mL。

1.3.6 抑菌試驗(yàn) 以枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、痢疾志賀氏菌和傷寒沙門氏菌4種試驗(yàn)菌為指示菌，總抑菌圈大小為評(píng)價(jià)指標(biāo)，慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)系列為對(duì)照，參照文獻(xiàn)[21]，用牛津杯法開展抑菌試驗(yàn)。按1.3.3方法制備試驗(yàn)菌平板，在平板中均勻放置4個(gè)無菌牛津杯，在牛津杯中加入0.280 mL試液，試液不得溢出，做兩平行，同時(shí)做空白試驗(yàn)，36.5 ℃培養(yǎng)15～16 h，測(cè)定抑菌圈直徑，評(píng)價(jià)抑菌效果。

1.3.7 單因素試驗(yàn) 用水作提取溶劑，選擇超聲條件為頻率40 kHz、功率400 W、溫度45 ℃下，單因素為液固比、超聲次數(shù)和超聲時(shí)間。固定超聲時(shí)間和超聲次數(shù)，研究液固比對(duì)提取物抑菌效果的影響；固定液固比和超聲次數(shù)，研究料超聲時(shí)間對(duì)提取物抑菌效果的影響；固定液固比和超聲時(shí)間，研究超聲次數(shù)對(duì)提取物抑菌效果的影響。試驗(yàn)重復(fù)2次。

1.3.8 最佳提取工藝參數(shù)選擇試驗(yàn) 通過單因素試驗(yàn)結(jié)果分析，選擇3個(gè)合適的因素水平，按L9(33)正交試驗(yàn)，提取箬葉抑菌提取物，制成含生藥1 g/mL的試液，按1.3.6方法用各提取物做抑菌試驗(yàn)，量取抑菌圈直徑，比較抑菌效果，找到最佳提取工藝參數(shù)，獲取最佳提取物。

1.3.9 最佳抑菌提取物與對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)系列抑菌效果的比較 在最佳提取工藝條件下，提取箬葉提取物進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，試驗(yàn)重復(fù)5次，計(jì)算其變動(dòng)范圍，用平均值與慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)系列的抑菌效果作比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 箬葉抑菌提取物提取溶劑和提取方法的篩選

2.1.1 不同提取溶劑箬葉提取物的抑菌情況 用1.3.6抑菌試驗(yàn)方法，對(duì)1.3.5中不同提取溶劑所獲提取物開展抑菌試驗(yàn)，結(jié)果見表1和表2。

表1 不同提取溶劑箬葉提取物的抑菌情況(抑菌圈直徑)?Table 1 Bacteriostasis of extract from Indocalamus leaves with different solvents (diameter of bacteriostatic circle) mm

表2 箬葉不同體積分?jǐn)?shù)乙醇提取物的抑菌情況(抑菌圈直徑)Table 2 Bacteriostasis of different concentrations ethanol extracts from Indocalamus leaves (diameter of bacteriostatic circle) mm

表1和表2結(jié)果顯示，箬葉乙醇提取物的抑菌效果整體較弱，乙酸溶液(pH 4)提取物抑菌效果最好，為81.5 mm,水提取物為66.1 mm，乙酸乙酯提取物為65.4 mm；但是乙酸溶液(pH 4)空白為73.2 mm，乙酸乙酯的空白為34.2 mm，水的空白無抑菌效果，可見，水是最好的提取溶劑。

2.1.2 不同提取方法箬葉提取物的抑菌情況 用水、60%乙醇、pH 4乙酸溶液、pH 10氨水溶液4種代表性提取溶劑分別采用超聲輔助法、回流法和浸提法3種方法進(jìn)行提取，所獲提取物的抑菌效果見表3，慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)系列的抑菌作用見表4。

由表3可知，水超聲提取物的抑菌效果最好，超聲法是最好的提取方法。

由表4可知，慶大霉素對(duì)4種指示菌抑菌作用顯著，標(biāo)準(zhǔn)系列的抑菌效果曲線方程相關(guān)系數(shù)均大于0.95，說明在選定的濃度范圍內(nèi)，其對(duì)各試驗(yàn)菌的抑菌效果與濃度呈正相關(guān)性。

表1和表2結(jié)果表明，水提取物抑菌性能優(yōu)于乙醇提取物，與文獻(xiàn)[16]的研究結(jié)果一致，雖然指示菌不同，但同樣說明箬葉中水溶性抑菌物質(zhì)比醇溶性抑菌物質(zhì)效果好。箬葉中含有豐富的生物活性成分[19]，其中黃酮類、多糖、生物堿等都有著較強(qiáng)的抑菌殺菌作用[17]。生物活性成分化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，極性會(huì)有差異，在水中的溶解性也會(huì)有差異。黃酮類既有溶于水的，也有溶于醇的；多糖類溶于水，但不是真溶液；萜類物質(zhì)極性中等偏小，微溶于水，易溶于醇，但萜苷類易溶于水；酚酸類為水溶性物質(zhì)；生物堿大部分不溶于水，易溶于醇，但由生物堿生成的鹽極易溶于水。箬葉水提取物抑菌活性優(yōu)于乙醇提取物，可能因?yàn)轶枞~中含有多種強(qiáng)極性水溶性活性物質(zhì)或者其他活性成分，含中等偏小極性的活性成分相對(duì)較少，有待進(jìn)一步對(duì)箬葉水提取物化學(xué)成分及其單體開展含量測(cè)定和抑菌活性研究。

2.2 提取抑菌活性物單因素試驗(yàn)

2.2.1 液固比對(duì)箬葉提取物抑菌效果的影響 固定超聲時(shí)間30 min和超聲次數(shù)1次，選擇液固比分別為4∶1，8∶1，10∶1，12∶1，16∶1，20∶1 (mL/g)，提取物抑菌效果見圖1。

由圖1可知，隨著液固比的增加，提取物的抑菌活性迅速增強(qiáng)，當(dāng)液固比增加到12∶1 (mL/g)后，提取物抑菌活性增強(qiáng)緩慢，因?yàn)殡S著提取溶劑用量的增加，抑菌物質(zhì)提取率隨之增加，液固比為12∶1 (mL/g)后，活性物質(zhì)大部分已擴(kuò)散到提取溶劑中，再增加提取溶劑用量，提取物抑菌活性增強(qiáng)緩慢。因此，12∶1 (mL/g)是比較適宜的液固比。

表3 3種提取方法箬葉提取物的抑菌情況(抑菌圈直徑)Table 3 Bacteriostasis of the extracts from Indocalamus leaves by three extraction methods (diameter of bacteriostatic circle) mm

表4 慶大霉素對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)系列對(duì)4種指示菌的抑菌作用(抑菌圈直徑)Table 4 Bacteriostatic effects of gentamicin standard series on 4 indicator bacteria (diameter of bacteriostatic circle)

圖1 液固比對(duì)箬葉提取物抑菌效果的影響Figure 1 Effects of liquid-to-material ratio on bacteriostasis of Indocalamus leaves extract

2.2.2 超聲時(shí)間對(duì)箬葉提取物抑菌效果的影響 固定液固比10∶1 (mL/g)和超聲次數(shù)1次，選擇超聲時(shí)間分別為15，25，35，45，55，65 min，提取物抑菌效果見圖2。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)箬葉提取物抑菌效果的影響Figure 2 Effects of ultrasonic time on bacteriostasis of Indocalamus leaves extract

由圖2可知，總體上隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，提取物抑菌活性增強(qiáng)，當(dāng)超聲時(shí)間增加到45 min后，提取物抑菌活性趨于平穩(wěn)，說明隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)抑菌物質(zhì)逐漸溶出。從45 min增加到55 min，提取物對(duì)痢疾志賀氏菌和銅綠假單胞菌活性有所下降，可能由于受熱時(shí)間延長(zhǎng)，個(gè)別成分變化所致；也可能是試驗(yàn)誤差所致。從15 min增加到25 min，提取物對(duì)痢疾志賀氏菌活性有所下降，因試驗(yàn)誤差所致。所以，提取時(shí)間選擇45 min左右比較合適。

2.2.3 超聲次數(shù)對(duì)箬葉提取物抑菌效果的影響 固定液固比10∶1 (mL/g)和超聲時(shí)間30 min，選擇超聲次數(shù)分別為1，2，3，4，5，6次，提取物抑菌效果見圖3。

由圖3可知，總體上隨著超聲次數(shù)的增加，提取物的抑菌活性不斷增強(qiáng)，當(dāng)超聲次數(shù)增加到3次后，提取物抑菌活性趨于平穩(wěn)，說明此時(shí)抑菌物質(zhì)提取比較充分。但提取物對(duì)痢疾志賀氏菌和銅綠假單胞菌活性有所下降，超聲次數(shù)增加到5，提取物對(duì)傷寒沙門氏菌的活性才有所下降，可能由于超聲次數(shù)增加，受熱時(shí)間也增加，個(gè)別成分被破壞所致，也可能是試驗(yàn)誤差所至。為節(jié)約能源，選擇超聲3次比較理想。

圖3 超聲次數(shù)對(duì)箬葉提取物抑菌效果的影響Figure 3 Effects of ultrasonic number of times on bacteriostasis of Indocalamus leaves extract

2.3 最佳提取工藝參數(shù)

以水為提取溶劑，選擇表5的因素和水平，按照 L9(33) 開展正交試驗(yàn)，制備箬葉提取物，用1.3.6方法開展抑菌試驗(yàn)，分析各條件下所獲提取物的抑菌效果，結(jié)果分析見表6和表7。

由表6可知，影響抑菌物質(zhì)提取效果因素的主次順序?yàn)槌暣螖?shù)>料液比>超聲時(shí)間，最佳提取工藝為固液比16∶1 (mL/g)，超聲次數(shù)4次，超聲時(shí)間55 min。由表7可知，超聲次數(shù)是重要的影響因素。

2.4 最佳提取物與對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)系列的抑菌情況比較

按最佳工藝參數(shù)，提取箬葉中最佳提取物，用1.3.6方法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，共試驗(yàn)5次，同時(shí)與對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)系列抑菌效果進(jìn)行比較，結(jié)果見表8。

表8結(jié)果顯示，最佳提取物對(duì)枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、痢疾志賀氏菌和傷寒沙門氏菌的抑菌圈直徑分別為(16.9±1.54)，(23.8±1.80)，(22.3±1.41)，(17.9±1.13) mm，平均總抑菌圈為80.9 mm，平均抑菌效果相當(dāng)于0.01，>0.05，>0.05，0.03 mg/mL慶大霉素，說明對(duì)4種試驗(yàn)菌的抑菌效果顯著，可作為食品添加劑、化妝品和日用化工原料進(jìn)行開發(fā)和利用，同時(shí)，比較表6，參數(shù)A3B2C1條件下的總抑菌圈與此結(jié)果相差不大。

表5 正交試驗(yàn)的因素和水平Table 5 Factors and levels of the orthogonal test

表6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Orthogonal experimental design and results

表7 正交試驗(yàn)方差分析Table 7 Results of variance analysis of orthogonal test

表8 最佳提取物抑菌試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 8 Statistical analysis of the results of bacteriostatic test of the best extract (n=5)

3 結(jié)論

箬葉抑菌物最佳提取工藝條件為：以水為提取溶劑，采用超聲輔助提取方法，提取參數(shù)為液固比16∶1 (mL/g)，超聲4次，時(shí)間55 min。該工藝條件簡(jiǎn)單易行，環(huán)境友好，無污染；所獲取的提取物對(duì)銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌兩種典型腐敗菌，傷寒沙門氏菌和痢疾志賀氏菌兩種常見致病菌的抑菌效果顯著；從節(jié)約能源和提高工作效率考慮，建議實(shí)際工作中使用工藝參數(shù)液固比16∶1 (mL/g)，超聲3次，時(shí)間35 min。另外，目前對(duì)箬葉水提物的研究嚴(yán)重不足，應(yīng)加強(qiáng)其中未知抑菌成分分析，開展廣普抑菌試驗(yàn)，多方面開展活性穩(wěn)定性研究，開發(fā)更多相關(guān)產(chǎn)品。