新西蘭白兔嚴重凍傷模型實驗觀察

付金鑫， 段 峰， 張金龍， 袁 冰， 張 恒， 閻潔羽， 管 陽， 王 燕，袁 凱， 王茂強

凍傷是人體處于寒冷環(huán)境引起的局部或全身性損傷。目前研究凍傷的動物模型主要有大鼠和兔模型，建模方法包括液氮致凍法、乙醇浸泡冷凍法及模擬高原低氧復合冷凍法［1-3］。凍傷的病理生理學變化過程可分為相互重疊的預凍期、凍融期、血液淤滯期和缺血期［4］。凍傷組織損傷機制主要包括直接損傷和間接損傷［5］，前者指組織凍結直接引起細胞內(nèi)外液冰晶形成，冰晶破壞細胞膜造成細胞死亡，此外細胞外滲透壓增加導致細胞脫水，細胞內(nèi)代謝紊亂，后者指冷凍引起血管強烈收縮、血管內(nèi)皮細胞受損、基底膜通透性增加，血小板聚集、血栓形成、紅細胞外滲、組織水腫，此外內(nèi)皮細胞合成和分泌前列環(huán)素（prostacyclin，PGI2）功能受損。PGI2有抗血小板聚集及舒張血管作用，與血栓素A2（thromboxane A2，TXA2）拮抗處于動態(tài)平衡中，但PGI2釋放減少加速血栓形成，氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡，類似于缺血-再灌注損傷。目前部分研究報道了新西蘭白兔嚴重凍傷模型的病理生理學變化，但缺乏影像學、病理學及PGI2-TXA2、氧化-抗氧化平衡狀態(tài)研究。本研究使用乙醇浸泡冷凍法建立新西蘭白兔嚴重凍傷模型并進行大體、影像學、血液學及病理學實驗觀察。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

取經(jīng)隔離檢疫合格的普通級新西蘭白兔（北京市維通利華實驗動物公司提供）12只，雌雄各半，12～15周齡，體質(zhì)量3.0～4.0 kg。采用單籠飼養(yǎng)，保持安靜環(huán)境，防止動物驚嚇，每日喂食2次（上午9時，下午3時），顆粒飼料供應量為130～150 g，并給予充足的纖維素供應，飲水不限。本實驗已獲解放軍總醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準，整個實驗過程嚴格遵守動物福利倫理3R原則。

1.2 兔嚴重凍傷模型建立及復溫

新西蘭白兔前足充分剃毛，在平第4指骨粗隆處劃一冷凍線，自冷凍線中點上方插入針狀熱電偶監(jiān)測第2、3跖趾關節(jié)交界處組織溫度，將左前肢端浸泡于-20℃95%乙醇中，凍傷至監(jiān)測組織溫度下降至-5℃后再繼續(xù)冷凍7 min即完成左前肢嚴重凍傷模型構建。將嚴重凍傷模型受累肢端置于加有聚維酮碘的37～39℃恒溫循環(huán)水槽中復溫治療25～35 min，復溫終點為肢端變紅或肢端柔軟易彎折。

1.3 兔嚴重凍傷模型實驗觀察

大體觀察：分別于凍傷前、凍傷后復溫前、復溫后即刻，和復溫后6 h、12 h、24 h、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d進行受累肢端外觀觀察及拍照記錄，觀察記錄組織腫脹程度及顏色變化。

血管造影：分別于凍傷前、凍傷后復溫前、復溫后即刻，和復溫后6 h、12 h、24 h、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d進行患肢動脈造影：經(jīng)耳緣靜脈按0.1 mL/kg劑量注射速眠新進行麻醉（麻醉前12 h禁食水），兔仰臥位固定于自制小木板上，剔除右后肢內(nèi)側和腹股溝區(qū)兔毛，常規(guī)消毒、鋪巾，沿右股動脈鞘區(qū)切開皮膚2～3 cm，分離皮下組織，暴露并剪開股動脈鞘，分離出長1.5～2 cm股動脈，遠端用絲線結扎，近端穿絲線并將其稍提緊使股動脈血流暫時阻斷；用眼科鑷夾起股動脈壁外側，眼科剪在股動脈壁內(nèi)側剪一小口，將引導導絲沿破口插入股動脈，順導絲置入4 F動脈鞘，緩慢推入股動脈內(nèi)約2 cm；用絲線將動脈鞘固定于股動脈，拔出導絲及動脈鞘內(nèi)套管，將剪短的4 F導管置入動脈鞘內(nèi)，導入2.2 F微導管；DSA導引將微導管頭端超選擇插管至肱動脈遠端，使用彈力繃帶于股動脈處固定動脈鞘及微導管，防止撕咬及導管移位；經(jīng)動脈推注小劑量硝酸甘油，注入對比劑（速率0.5～1 mL/s，注射壓力200 psi，總量1.5～3 mL）。造影術后連續(xù)5 d肌內(nèi)注射青霉素80萬U。

血常規(guī)、生化、凝血及纖溶活性指標檢測：于凍傷前、復溫后即刻，和復溫后6 h、12 h、24 h、2 d、3 d經(jīng)耳緣靜脈抽取靜脈血3 mL，離心分離血漿（3 000 r/min，15 min），保存于-80℃冰箱，采用全自動分析儀檢測白細胞（WBC）、紅細胞（RBC）、血紅蛋白（HGB）、紅細胞比容（HCT）、血小板（PLT）、丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、血尿素氮（BUN）、血清肌酐（SCr）、凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）、纖維蛋白原（FIB）。

血漿血栓素B2（TXB2）和6-酮-前列腺素F1α（6-keto-PGF1α）檢測：于凍傷前、復溫后即刻、6 h、12 h、24 h、2 d、3 d經(jīng)耳緣靜脈抽取靜脈血1.5 mL，顛倒混勻，分離血漿（4℃，3 500 r/min，15 min），保存于-80℃冰箱，采用TXB2及6-keto-PGF1α放射免疫分析藥盒（北京普爾偉業(yè)生物科技公司）進行檢測。

血漿丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）檢測：于凍傷前、復溫后即刻，和復溫后6 h、12 h、24 h、2 d、3 d經(jīng)耳緣靜脈抽取靜脈血1.5 mL，離心分離血漿（3 000 r/min，15 min），保存于-80℃冰箱。血漿MDA含量通過TBA比色法測定，血漿SOD含量使用黃嘌呤氧化酶法測定。

常規(guī)組織病理學檢查：取材時點為凍傷前、凍傷后即刻、復溫后即刻，和復溫后6 h、12 h、24 h、2 d、3 d、4 d、5 d，切取待檢測組織放入4%甲醛固定48 h以上，組織樣本取材厚3 mm，梯度乙醇脫水70%、80%、95%、100%各30 min，二甲苯2瓶各20 min，石蠟浸蠟兩缸各12 min，包埋，切片4 μm，烤片；二甲苯3瓶脫蠟，每瓶8 min，100%乙醇2瓶，每瓶8 min，90%、80%、60%乙醇每瓶各8 min；蘇木精-伊紅（HE）染色4 min，鹽酸乙醇分化2～3 s，0.5%氨水20 s，上鏡觀察，0.5% HE染色1 min，80%、90%乙醇各分化3～5 s，95%乙醇5 min，100%乙醇3瓶，每瓶5 min，二甲苯2瓶，每瓶5 min；中性樹脂膠封片；顯微鏡觀察并圖像采集分析。

自然預后截肢率統(tǒng)計：采用趾端截肢率和得分法統(tǒng)計計算模型的自然預后截肢率，趾端截肢率＝趾肢指端數(shù)/受累趾端數(shù)，得分法即人為定義各趾端及關節(jié)平面分數(shù)，根據(jù)截趾范圍得出最終截趾分數(shù)，最終截趾分數(shù)＝A、B、C、D四縱向趾端截肢平面的分數(shù)總和［6］。趾端及關節(jié)平面截趾分數(shù)定義圖示見圖1。

圖1 趾端及關節(jié)平面截趾分數(shù)定義圖示

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 大體觀察及血管造影

新西蘭白兔嚴重凍傷模型左前肢在實驗各時間點的大體觀察及血管造影變化情況，見圖2。

圖2 兔嚴重凍傷模型左前肢大體觀察及血管造影變化

2.2 血液學檢測

兔嚴重凍傷模型在實驗各時間點的血液學檢測結果見表1。WBC水平在復溫后即刻～3 d持續(xù)升高，6 h、12 h、24 h、2 d、3 d時較凍傷前基線顯著升高（P＜0.05）；RBC、HGB、HCT變化趨勢基本保持一致，復溫后即刻始升高，12 h達高峰，RBC水平于復溫后12 h明顯高于基線水平（P＜0.05），HGB、HCT水平于6 h、12 h明顯高于基線水平（P＜0.05），24 h恢復基線水平，2 d、3 d下降，RBC水平于3 d明顯低于基線水平（P＜0.05），HGB、HCT水平于2 d、3 d明顯低于基線水平（P＜0.05）；PLT水平于復溫后即刻～2 d下降，24 h達低谷，6 h、12 h、24 h、2 d明顯低于基線水平（P＜0.05），3 d恢復升高。復溫后即刻、6 h、12 h、24 h、2 d、3 d血 清ALT、AST、BUN、SCR值較基線值差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。復溫后即刻～3 d PT水平持續(xù)下降，2 d、3 d較基線顯著降低（P＜0.05）；APTT水平于6 h～3 d持續(xù)降低，24 h、2 d、3 d較基線顯著下降（P＜0.05）；FIB水平于復溫后即刻～3 d持續(xù)升高，12 h、24 h、2 d、3 d較基線顯著升高（P＜0.05）。復溫后即刻～12 h血漿6-keto-PGF1α水平持續(xù)升高，12 h達高峰，復溫后即刻、6 h、12 h、24 h較基線顯著升高（P＜0.05），24 h～3 d開始下降，2 d、3 d較基線顯著下降（P＜0.05）；復溫后即刻～3 d血漿TXB2水平持續(xù)升高，復溫后即刻、6 h、12 h、24 h、2 d、3 d較基線顯著升高（P＜0.05）。復溫后即刻～3 d血漿MDA水平持續(xù)升高，6 h、12 h、24 h、2 d、3 d較基線顯著升高（P＜0.05）；復溫后即刻～24 h血漿SOD水平持續(xù)升高，24 h達高峰，6 h、12 h、24 h較基線顯著升高（P＜0.05），2 d、3 d開始下降，較基線顯著下降（P＜0.05）。

表1 兔嚴重凍傷模型凍傷前后血液學檢測結果 （±s）

表1 兔嚴重凍傷模型凍傷前后血液學檢測結果 （±s）

*與凍傷前相比，P＜0.05

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2.3 組織病理學檢查

兔嚴重凍傷模型凍傷前后左前肢血管病理學變化過程見圖3。

圖3 兔嚴重凍傷模型凍傷前后左前肢血管病理學變化過程

2.4 截肢率

兔嚴重凍傷模型受累趾端160個，最終截趾132個，截趾率為82.5%，得分法結果為（20.6±3.8）分。

3 討論

本研究采用乙醇浸泡冷凍法建立新西蘭白兔嚴重凍傷模型，通過觀察建模前后左前肢大體及血管造影變化發(fā)現(xiàn)，凍傷后微循環(huán)變化可大致分為兩個階段：血管開通階段（復溫后即刻～12 h）和血管閉塞階段（復溫后12 h至截肢）。在血管開通階段，凍傷后肢端皮膚蒼白，肢端血管閉塞，復溫后即刻～12 h皮膚顏色由紫藍色轉為粉紅色，腫脹程度加重，肢端血流逐漸恢復；血管閉塞階段，受累肢端皮膚顏色由粉紅色轉變?yōu)樽纤{色至最后變?yōu)楹谏[脹程度減輕至干癟，肢端血管逐漸閉塞，血流逐漸消失，皮膚顏色紫藍及暗黑區(qū)域可大致對應血管閉塞區(qū)。既往研究發(fā)現(xiàn)，冷凍傷后微循環(huán)變化過程：血流停滯、再通、再次惡化，最終結局為無復流或好轉［7-8］。本研究結果提示，嚴重凍傷后血流變化規(guī)律與上述研究基本一致，初步發(fā)現(xiàn)皮膚顏色與血管閉塞的大致對應關系。

本研究觀察到，兔嚴重凍傷模型復溫后即刻～3 d WBC水平持續(xù)升高，復溫后RBC、HGB、HCT變化趨勢基本保持一致，RBC、HGB、HCT水平于復溫后即刻始升高，12 h達到高峰，24 h恢復凍傷前基線水平，2 d、3 d下降；PLT水平于復溫后即刻～2 d持續(xù)下降，24 h到達低谷，3 d恢復升高。劉志洲等［9］報道，嚴重凍傷后WBC、RBC、HGB、HCT變化趨勢基本保持一致，認為WBC持續(xù)升高主要由寒冷刺激作用及后期無菌性炎癥引起，RBC先期增加主要由于先期組織缺氧引起的代償性增加，后期由于血液稀釋及機械性溶血導致病理性減少，PLT前期由于血栓形成大量消耗而減少，后期由于機體代償性增加。

有研究通過凍傷大鼠凝血系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)，APTT、PT于凍傷后縮短，F(xiàn)IB升高［10］。本研究中APTT、PT水平于復溫后持續(xù)下降，F(xiàn)IB水平于復溫后即刻～3 d持續(xù)升高。凍傷后機體凝血系統(tǒng)發(fā)生紊亂，機體處于高凝狀態(tài)，F(xiàn)IB復溫后持續(xù)升高表明血栓形成。

嚴重冷凍傷可導致血管內(nèi)皮損傷，血管內(nèi)皮細胞生物學功能之一是合成及釋放具有強烈抑制PLT聚集及擴血管作用的PGI2［11-12］。6-keto-PGF1α是PGI2代謝產(chǎn)物，因此血漿6-keto-PGF1α含量變化可反映PGI2變化。本研究中觀察到兔嚴重凍傷模型血漿6-keto-PGF1α水平于復溫后即刻～12 h持續(xù)升高，12 h達高峰，24 h～3 d開始下降。TXA2是一種由PLT合成及釋放的具有強烈PLT聚集及縮血管作用的生物活性物質(zhì)，TXB2是其代謝產(chǎn)物。本研究中觀察到血漿TXB2水平于復溫后即刻～3 d持續(xù)升高。Lorentzen等［12］研究中也出現(xiàn)類似的凍傷后血漿6-keto-PGF1α和TXB2水平變化趨勢，認為前期血漿6-keto-PGF1α水平升高是由于內(nèi)皮細胞受損、細胞膜破裂、大量PGI2釋放入血引起，后期由于內(nèi)皮細胞壞死合成PGI2能力下降，因此導致后期血漿6-keto-PGF1α水平大幅度下降；血漿TXB2水平于復溫后持續(xù)升高可能是由于凍傷后血管內(nèi)皮損傷引起PLT黏附、聚集，PLT進一步釋放促進凝血的生物活性物質(zhì)，進而促進血栓形成。

機體在正常情況下存在氧化與抗氧平衡系統(tǒng)，但本研究發(fā)現(xiàn)兔嚴重凍傷模型血漿反映脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的MDA水平于復溫后即刻～3 d持續(xù)升高，血漿清除氧自由基的SOD水平于復溫后即刻～24 h持續(xù)升高，24 h達高峰，復溫后2 d、3 d較基線顯著下降。這表明凍傷后氧化-抗氧化平衡系統(tǒng)被打破，氧化過程增強，抗氧化能力減弱，因此加重凍傷損害；血漿SOD水平先升高后下降可能是由于前期血漿MDA增加引起的代償性增加，后期過氧化物大量堆積超過機體代償能力，SOD又被大量消耗，進而出現(xiàn)SOD大幅下降至凍傷前。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，新西蘭白兔嚴重凍傷模型左前肢血管于復溫后即刻～24 h大量擴張淤血或充血，未見明顯血栓，復溫后2～5 d可見混合血栓，這與血管造影結果對應一致，進一步證明嚴重凍傷復溫后受累肢端血流停滯-再通-再次惡化-最終無復流或好轉的變化過程。