葡萄蒸餾酒香氣成分頂空固相微萃取條件優(yōu)化

孫麗君，劉建學(xué),2,3*，韓四海,2,3，李佩艷,2,3，郭金英,2,3，羅登林,2,3

1(河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽，471023)2(河南省食品原料工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽，471023) 3(食品加工與安全國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，河南 洛陽，471023)

葡萄蒸餾酒是在20世紀(jì)末21世紀(jì)初新興的一種飲料酒[1]，是以葡萄為主要原料，經(jīng)發(fā)酵、蒸餾、勾兌而成的，它與世界六大蒸餾酒之一的白蘭地的區(qū)別在于沒有經(jīng)過橡木桶的貯藏陳釀，大大縮短了生產(chǎn)處理周期，最大程度的保留了釀造葡萄原有的香氣特點(diǎn)[2]，且價(jià)格適中，近年來深受消費(fèi)者喜愛。

香氣是反映葡萄蒸餾酒品質(zhì)的重要指標(biāo)[3]，也是影響人們選擇購買的主要因素。香氣成分的分析主要包括香氣成分的提取濃縮和分離檢測。GC-MS以其可以準(zhǔn)確、快速的定性、定量分析的特性已經(jīng)成為分析酒精飲料揮發(fā)性物質(zhì)最常見的方法[4]。無論使用多么先進(jìn)的分析方法，將香氣物質(zhì)濃縮富集提取出來是獲得理想分析結(jié)果的前提[5]，固相微萃取技術(shù)是一種無溶劑萃取技術(shù)[6]，與液-液萃取等傳統(tǒng)技術(shù)相比，快速簡便，低成本，自動(dòng)化且與多種分析系統(tǒng)兼容[7]。頂空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction，HS-SPME)作為固相微萃取的一種，在揮發(fā)性成分提取中更具有明顯的優(yōu)勢[8]，此外，通過將最少量、不需要的分子引入分析系統(tǒng)，可以使色譜柱獲得更長的壽命[9-10]。本文采取HS-SPME與GC-MS結(jié)合對葡萄蒸餾酒中的香氣成分進(jìn)行提取與分析，為了能獲得更好的萃取效果，對影響HS-SPME萃取效果的各因素進(jìn)行優(yōu)化。

近年來，對葡萄蒸餾酒的相關(guān)研究多集中在其發(fā)酵過程控制[11-12]、生產(chǎn)工藝優(yōu)化[13]和不同葡萄品種蒸餾酒香氣成分分析[14-15]，而對于香氣成分萃取條件優(yōu)化的研究較少，為更好地分析葡萄蒸餾酒中的揮發(fā)性香氣成分，本文對影響HS-SPME萃取效果的條件進(jìn)行優(yōu)化，確定了葡萄蒸餾酒香氣成分萃取的較優(yōu)條件，以期為葡萄蒸餾酒的揮發(fā)性香氣成分研究提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

酒樣(52°)，九朝雅宴葡萄蒸餾酒；2-辛醇(色譜純)，上海麥克林生化科技有限公司；NaCl(分析純)，天津化學(xué)試劑一廠；頂空瓶(20 mL)，北京博賽德科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

TSQ9000氣相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，賽默飛世爾科技公司；萃取手柄、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取纖維(1 cm)，美國Supelco公司；ZNCL-TS磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 氣相色譜及質(zhì)譜條件

色譜柱：AT.LZP-930白酒分析專用柱(30 m×0.32 mm，1 μm)；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；升溫程序：35 ℃ 保持5 min，然后以3 ℃/min升至60 ℃，再以2 ℃/min 升至135 ℃，最后以4 ℃/min升至220 ℃；載氣(He)流速2.0 mL/min，壓力30 kPa；不分流。

EI離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度230 ℃；離子源溫度240 ℃；采用全掃描模式，掃描的質(zhì)荷比范圍是35～600。

1.2.2 頂空固相微萃取條件

首先，由于三相纖維包含了不同性質(zhì)的萃取涂層，對酯類、醇類等多種化合物(C3～C20)具有足夠的提取能力[16]，所以選定萃取纖維為50/30 μm DVB/CAR/PDMS；在20 mL的鉗口瓶中加入稀釋到一定濃度的葡萄蒸餾酒8 mL、NaCl和磁力轉(zhuǎn)子，密封小瓶，在轉(zhuǎn)速為400 r/min下預(yù)熱平衡一段時(shí)間，插入萃取纖維進(jìn)行頂空吸附一定時(shí)間，最后將其插入GC進(jìn)樣口解析。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

以組分分離所得的色譜峰的總峰面積和峰個(gè)數(shù)為參考指標(biāo)，選取萃取溫度(20、30、40、50、60 ℃)、解析時(shí)間(2、4、6、8、10 min)、平衡時(shí)間(0、5、10、15、20 min)、萃取時(shí)間(10、20、30、40、50 min)、NaCl添加量(0、0.1、0.2、0.3、0.4 g/mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(5%、10%、15%、20%、25%)進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果并考慮到萃取纖維的使用壽命及前處理時(shí)間，確定解析和平衡時(shí)間，在此基礎(chǔ)上以各組分色譜圖的總峰面積(Y1)和峰個(gè)數(shù)(Y2)為響應(yīng)值，對萃取溫度(A)、萃取時(shí)間(B)、NaCl添加量(C)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(D) 4個(gè)單因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

1.2.5 定性與定量分析

定性分析方法：將樣品的質(zhì)譜圖與賽默飛mainlib譜庫中的標(biāo)準(zhǔn)譜圖進(jìn)行對比定性，保留匹配度>800的化合物。保留指數(shù)(retention index, RI)采用一系列正構(gòu)烷烴C7～C40計(jì)算，具體計(jì)算方法[17]如公式(1)所示：

(1)

式中：RIx，待分析化合物的保留指數(shù)；n，正構(gòu)烷烴碳原子數(shù)；tx，待分析化合物的保留時(shí)間，min；tn，碳數(shù)為n的正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間，min；tn+1，碳數(shù)為n+1的正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間，min。

定量分析方法：選用內(nèi)標(biāo)半定量法，通過內(nèi)標(biāo)物的峰面積與樣品中各組分的峰面積比值，計(jì)算各化合物的相對濃度，濃度計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

式中：C1，待測化合物的質(zhì)量濃度，μg/mL；f，相對校正因子，f=1；A1，待測化合物的峰面積；A0，內(nèi)標(biāo)(2-辛醇)的峰面積；C0，加入內(nèi)標(biāo)(2-辛醇)的質(zhì)量濃度，μg/mL；V0，加入內(nèi)標(biāo)(2-辛醇)的體積，mL；V1，萃取的8 mL稀釋酒樣的體積，mL。

1.3 數(shù)據(jù)分析

按照上述的試驗(yàn)方法進(jìn)行試驗(yàn)，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算峰個(gè)數(shù)和總峰面積，用Excel 2016、SPSS 25進(jìn)行數(shù)據(jù)分析、Origin 2019作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 萃取溫度的選擇

樣品瓶中加入8 mL稀釋至乙醇體積分?jǐn)?shù)為15%的葡萄蒸餾酒、1.6 g NaCl進(jìn)行磁力攪拌，在400 r/min下平衡10 min后插入萃取纖維，頂空萃取30 min，然后解析6 min，在此條件基礎(chǔ)上考察不同萃取溫度(20、30、40、50、60 ℃)對萃取效果的影響；由圖1可知，總峰面積和峰個(gè)數(shù)達(dá)到峰值時(shí)萃取溫度為30 ℃。加熱會(huì)加快樣品分子熱運(yùn)動(dòng)，使得揮發(fā)性香氣成分更好地釋放，從而增加其在頂空部位的濃度，但溫度的升高，會(huì)降低在涂層纖維上的分配系數(shù)，使得揮發(fā)性成分的吸附減少，且溫度過高時(shí)會(huì)使分子質(zhì)量大的難揮發(fā)性成分吸附，分子質(zhì)量小的易揮發(fā)性成分從萃取纖維上解析下來[18]。因此選擇30 ℃進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)。

圖1 萃取溫度對萃取效果的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on extraction efficiency

2.1.2 解析時(shí)間的選擇

吸附到萃取纖維上的香氣成分能否更好地解析到氣相色譜中進(jìn)行分析取決于解析時(shí)間，時(shí)間太短不僅會(huì)解析不充分，還會(huì)造成萃取纖維上較多殘留；時(shí)間過長可能會(huì)減少萃取纖維的使用次數(shù)，所以要確定合適的解析時(shí)間。由圖2可知，解析時(shí)間為2～6 min時(shí)，總峰面積和峰個(gè)數(shù)呈現(xiàn)出快速增加的趨勢，當(dāng)解析時(shí)間為6 min時(shí)，2個(gè)響應(yīng)值均達(dá)到峰值。隨著解析時(shí)間增加，萃取到的揮發(fā)性香氣成分不斷解析下來，但當(dāng)解析時(shí)間>6 min時(shí)，總峰面積和峰個(gè)數(shù)呈現(xiàn)出小幅下降的趨勢。因此，綜合分析，確定解析時(shí)間為6 min。

圖2 解析時(shí)間對萃取效果的影響Fig.2 Effect of desorption time on extraction efficiency

2.1.3 平衡時(shí)間的選擇

在萃取纖維進(jìn)行吸附之前，樣品瓶中液相在30 ℃磁力攪拌條件下平衡一段時(shí)間，揮發(fā)性成分會(huì)在頂空和樣品之間達(dá)到平衡[19]，此時(shí)萃取效果較優(yōu)。由圖3可以看出，平衡時(shí)間為10 min時(shí)，響應(yīng)值達(dá)到極大值，萃取效果較好，兩者之間達(dá)到了平衡。因此，確定平衡時(shí)間為10 min。

圖3 平衡時(shí)間對萃取效果的影響Fig.3 Effect of equilibrium time on extraction efficiency

2.1.4 萃取時(shí)間的選擇

揮發(fā)性成分在萃取纖維上的吸附也是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的過程，是樣品、頂空部分和萃取纖維三者之間的平衡[20]，只有三者達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡時(shí)才有最大吸附量。由圖4可知，萃取時(shí)間為30 min時(shí)，總峰面積和峰個(gè)數(shù)達(dá)到極大值。相對分子質(zhì)量較低的物質(zhì)很容易被萃取吸附到萃取纖維上，反之，相對分子質(zhì)量較大的就很難被萃取，如果萃取時(shí)間過長，大分子物質(zhì)競爭性吸附增加會(huì)造成小分子物質(zhì)解析。萃取時(shí)間為30 min時(shí)，三相之間達(dá)到平衡，所以選擇萃取時(shí)間為30 min進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)。

圖4 萃取時(shí)間對萃取效果的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction efficiency

2.1.5 NaCl添加量的選擇

由圖5可知，當(dāng)NaCl添加量為0.2 g/mL時(shí)，揮發(fā)性成分總峰面積和峰個(gè)數(shù)達(dá)到極大值。加入NaCl會(huì)降低香氣物質(zhì)在液相中的溶解度，更易萃??；并且通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)NaCl添加量為0.2 g/mL時(shí)，溶液并未達(dá)到飽和狀態(tài)，可見并不是NaCl添加量越多越好，當(dāng)繼續(xù)添加NaCl至飽和或過飽和時(shí)，在增加揮發(fā)性成分氣-液分配比的同時(shí)也將影響基質(zhì)黏度，降低其擴(kuò)散速度[21]。因此選擇NaCl添加量0.2 g/mL進(jìn)行后續(xù)條件的優(yōu)化。

圖5 NaCl添加量對萃取效果的影響Fig.5 Effect of NaCl addition on extraction efficiency

2.1.6 乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇

由圖6可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，揮發(fā)性成分的總峰面積和峰個(gè)數(shù)先增加后減少，乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，揮發(fā)性成分總峰面積和峰個(gè)數(shù)達(dá)到極大值。乙醇是酒的主體成分且沸點(diǎn)較低，若不稀釋直接萃取，萃取纖維會(huì)吸附較多的乙醇，對酒中其他揮發(fā)性成分的吸附降低；并且在譜圖分析中，大乙醇峰會(huì)使其他化合物峰后移[4]，影響香氣物質(zhì)的分析。將酒樣進(jìn)行不同濃度的稀釋后，會(huì)縮小提取過程中乙醇與其他香氣成分之間的競爭性吸附差異，但稀釋濃度過大，乙醇與其他香氣成分濃度過低，使總體萃取效果降低，由圖6可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，萃取效果較好。

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)對萃取效果的影響Fig.6 Effect of ethanol volume fraction on extraction efficiency

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

利用Design-Expert.V8.0進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Experimental design and results for response surface analysis

通過對表1結(jié)果進(jìn)行二元多次回歸統(tǒng)計(jì)分析，建立回歸模型，此模型得出葡萄蒸餾酒中香氣成分的總峰面積(Y1)、峰個(gè)數(shù)(Y2)與各變量因素之間的擬合方程為：

Y1=3.449×108+2.897×106A+7.730×106B+2.510×106C+4.828×106D-1.178×106AB-3.242×107AC-2.481×107AD+1.011×105BC+6.771×106BD+6.734×106CD-3.362×107A2-2.737×107B2-4.262×107C2-6.598×107D2

Y2=33.40+0.75A+0.58B+1.25C-0.42D-0.75AB-AC-AD-0.5BD-1.25CD-3.33A2-1.33B2-2.07C2-2.07D2。

為了檢驗(yàn)方程的有效性，對結(jié)果進(jìn)行方差分析(表2)。由表2可知，對于總峰面積和峰個(gè)數(shù)兩個(gè)響應(yīng)值，模型的P值均<0.000 1，說明模型極顯著；模型失擬誤差P值均>0.05，說明模型失擬項(xiàng)不顯著，試驗(yàn)誤差較小。對模型進(jìn)行可信度分析可知，模型響應(yīng)值總峰面積和峰個(gè)數(shù)的決定系數(shù)R2分別為0.989 8、0.926 7，校正后R2分別為0.979 6、0.853 4，表明模型擬合度高；模型的變異系數(shù)均<10%，說明模型對響應(yīng)值的置信度良好，可以較好地反映真實(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。綜上所述，該回歸模型對2個(gè)響應(yīng)值的擬合度較高，能夠較好的反應(yīng)響應(yīng)值與自變量的關(guān)系。

Design-Expert.V8.0軟件對試驗(yàn)的優(yōu)化結(jié)果為萃取溫度30.02 ℃、萃取時(shí)間31.76 min、NaCl添加量0.21 g/mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)10.81%。采用優(yōu)化后的參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，為方便操作將優(yōu)化后的條件適當(dāng)調(diào)整為萃取溫度30 ℃、萃取時(shí)間30 min、NaCl添加量0.20 g/mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)10%，平行試驗(yàn)3次取平均值，測得總峰面積為3.494×108，與模型3.513×108無明顯差異，峰個(gè)數(shù)為34，與模型33相近，說明優(yōu)化后的萃取條件存在可行性。

2.3 葡萄蒸餾酒香氣成分分析結(jié)果

在8 mL稀釋的酒樣中添加50 μL、400 μg/mL的2-辛醇(內(nèi)標(biāo))，使用優(yōu)化后的萃取條件對葡萄蒸餾酒中的香氣成分進(jìn)行檢測，并計(jì)算其保留指數(shù)，具體香氣成分見表3。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過HS-SPME與GC-MS結(jié)合測葡萄蒸餾酒揮發(fā)性成分，對影響萃取效果的因素進(jìn)行了單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化，得到了頂空固相微萃取的較優(yōu)萃取條件：萃取溫度30 ℃、解析時(shí)間6 min、平衡時(shí)間10 min、萃取時(shí)間30 min、NaCl添加量0.20 g/mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)10%。對優(yōu)化后的條件進(jìn)行驗(yàn)證，該條件下進(jìn)行萃取得到總峰面積為3.494×108，峰個(gè)數(shù)為34，表明該萃取條件試驗(yàn)效果好，具有一定的通用性。在優(yōu)化條件下從葡萄蒸餾酒中鑒定出酯類物質(zhì)16種，醇類6種，醛類1種、酚類1種。本研究優(yōu)化的測定方法簡單、快速，在葡萄蒸餾酒及其他酒類香氣成分分析中具有較好的應(yīng)用前景。