沒藥甾酮下調(diào)TLR4/NF-κB通路減輕膿毒癥相關(guān)性腦病神經(jīng)炎癥反應(yīng)機(jī)制探究*

李 探 徐宏彬 張瀟月 邵龍剛 劉克琴

（江蘇省第二中醫(yī)院，江蘇 南京 210000）

膿毒癥相關(guān)性腦?。⊿AE）是膿毒癥嚴(yán)重的中樞神系統(tǒng)并發(fā)癥，目前臨床上缺乏有效的治療手段，其根本原因在于SAE的發(fā)生機(jī)制尚未闡明［1］。炎癥反應(yīng)的失衡是導(dǎo)致膿毒癥多并發(fā)癥、高死亡率的最根本因素，而神經(jīng)炎癥反應(yīng)也是導(dǎo)致SAE發(fā)病的最重要的機(jī)制之一。Toll樣受體4（TLR4）/核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）通路作為經(jīng)典的固有免疫應(yīng)答通路，也是誘導(dǎo)SAE神經(jīng)炎癥反應(yīng)最重要的信號(hào)通路［2-3］。但遺憾的是目前SAE仍缺乏特異性的藥物治療，臨床上仍以積極的液體復(fù)蘇、抗感染、臟器功能保護(hù)等對(duì)癥治療為主，結(jié)果均不理想。

SAE多歸屬于中醫(yī)學(xué)“神昏”范疇，病機(jī)多為熱毒、痰濁、瘀血而致氣機(jī)逆亂，上擾神明，蒙蔽清竅，進(jìn)而令各臟器損傷，治療方藥亦以清熱、滌痰、通腑逐瘀之品為主［4］。乳香-沒藥藥對(duì)作為中藥經(jīng)典的配伍，始見于“乳香止痛散”。《本草綱目》言“乳香活血，沒藥散血，皆能止痛、消腫、生肌，故二藥每每相兼而用”，可協(xié)同互補(bǔ)，增強(qiáng)藥力，為宣通臟腑，流通經(jīng)絡(luò)之要藥，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)常用于抗炎、抗腫瘤、抗氧化、改善認(rèn)知等［5］，以其為基礎(chǔ)的經(jīng)典名方“西黃丸”在乳腺癌、肝癌、肺癌等惡性腫瘤的治療中，因其顯著的抗炎作用取得了顯著療效［6］，這也為乳香-沒藥在SAE中的應(yīng)用提供了強(qiáng)有力的模板和支撐。最新研究報(bào)道，沒藥的主要成分沒藥甾酮（GS）具有顯著的抗炎作用，可通過抑制腦內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞活化以及TLR4、NF-κB、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）等的產(chǎn)生，減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)、改善神經(jīng)功能［7-8］。為研究乳香-沒藥藥對(duì)在SAE中的作用，故我們前期選擇沒藥的主要活性成分GS進(jìn)行了相關(guān)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究。

1 材料與方法

1.1 試藥與儀器

LPS、GS購自美國 Sigma公司（L2630、370690）；CCK-8檢測試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所（CK04）；TLR4、β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白（TRIF）、髓樣分化因子（MyD88）、NF-κB、磷酸化NF-κB（p-NF-κB）抗體購自美國Cell Signaling Technology公司（143585、45965、42835、8242、3033）；TNF-α、IL-1β、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、IL-10 ELISA檢測試劑盒購自美國Abcam公司（ab208348、ab197742、ab215715、ab189392）。多功能酶標(biāo)儀（美國Thermo公司）；DMI 6000B倒置顯微鏡（德國Leica公司）；Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)（美國LI-COR公司）；電泳儀、轉(zhuǎn)膜槽等（美國Bio-BAND公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系BV2細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。用含有10%胎牛血清、100 μmol/L青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液（美國Gibco公司），在5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞長至培養(yǎng)皿底部80%時(shí)，用胰酶消化并接種至孔板中，待細(xì)胞長至孔板底部80%時(shí)，棄去舊培養(yǎng)液，分組加入含不同濃度藥物的完全培養(yǎng)液，分為空白對(duì)照（NC組）、LPS組、LPS+GS組。

1.3 標(biāo)本采集與檢測

1.3.1 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞接種于96孔板中，每孔細(xì)胞量為1×104，每孔液體量為100 μL。首先進(jìn)行給藥濃度梯度測定：LPS處理濃度梯度為0.1、0.3、1、3、10、30 μg/mL，GS處理濃度梯度為0.3、1、3、10、30、100 μg/mL，每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔，處理24 h后，于培養(yǎng)箱中反應(yīng)2 h，用酶標(biāo)儀測450 nm處OD值，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。時(shí)間梯度：LPS+GS聯(lián)合給藥6、12、24、48、72、168 h，加入10%CCK-8試劑，于培養(yǎng)箱中反應(yīng)2 h，用酶標(biāo)儀測450 nm處OD值，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。存活率計(jì)算：存活率（%）=OD實(shí)驗(yàn)組平均值÷OD對(duì)照組平均值×100%。

1.3.2 Western blotting檢測蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞接種于6孔板中，每孔細(xì)胞量為3×105，每孔液體量為3 mL。用LPS單藥（1 μg/mL）、LPS+GS（1 μg/mL+30 μg/mL）處理細(xì)胞，6、12、24 h后提取蛋白。BCA法測定樣品蛋白濃度，上樣量為30 μg。樣品經(jīng)SDSPAGE電泳分離，之后轉(zhuǎn)移至NC膜上，用5%BSA室溫下在搖床上封閉1 h，用封閉液稀釋抗體（β-actin抗體按1∶5 000稀釋，其余一抗按1∶1 000稀釋），一抗4℃孵育過夜，之后用PBST洗膜3次，每次10 min，二抗室溫下避光孵育1 h，PBST洗膜3次，每次10 min，用Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)采集圖片，用Odyssey軟件分析圖像。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果分析：采用Image J圖像分析系統(tǒng)，對(duì)蛋白條帶的相對(duì)灰度進(jìn)行分析，計(jì)算各組的OD值，以目的蛋白與內(nèi)參灰度的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3 ELISA法檢測細(xì)胞因子表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞接種于6孔板中，每孔細(xì)胞量為3×105，每孔液體量為3 mL。用LPS單藥（1 μg/mL）、LPS+GS（1 μg/mL+30 μg/mL）處理細(xì)胞，6、12、24 h后提取蛋白。嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行操作，操作完畢后采用酶標(biāo)儀進(jìn)行做出OD值曲線，讀出相應(yīng)的OD值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Graphpadprism5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及繪圖，計(jì)量資料符合正態(tài)分布者以（）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LPS和GS單獨(dú)及聯(lián)合給藥對(duì)BV2細(xì)胞增殖的影響

見表1，表2，圖1。LPS和GS單獨(dú)給藥24 h，LPS濃度在0～1 μg/mL時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖影響不大，當(dāng)≥3 μg/mL時(shí)細(xì)胞增殖被顯著抑制（P＜0.01），GS在濃度100 μg/mL時(shí)細(xì)胞增殖被顯著抑制（P＜0.01），結(jié)合既往研究報(bào)道，選擇LPS（3 μg/mL）和GS（30 μg/mL）作為聯(lián)合給藥濃度，聯(lián)合給藥后GS能顯著增加細(xì)胞增殖，隨時(shí)間增長無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

表1 LPS和GS單獨(dú)給藥對(duì)BV2細(xì)胞增殖的影響（%，±s）

表1 LPS和GS單獨(dú)給藥對(duì)BV2細(xì)胞增殖的影響（%，±s）

注：與1 μg/mL組比較，*P＜0.01；與30 μg/mL組比較，△P＜0.01。

LPS 0 μg/mL 0.1 μg/mL 0.3 μg/mL 1 μg/mL 3 μg/mL 10 μg/mL 30 μg/mL n 5 5 5 5 5 5 5增殖率100.00±2.06 98.64±1.31 97.44±2.29 93.32±10.29 74.88±14.46*57.26±7.10*48.33±12.01*GS 0 μg/mL 0.3 μg/mL 1 μg/mL 3 μg/mL 10 μg/mL 30 μg/mL 100 μg/mL n 5 5 5 5 5 5 5增殖率100.00±0.44 95.32±1.65 92.09±4.63 94.38±2.18 92.52±1.93 87.35±9.17 51.06±7.72△

表2 LPS和GS聯(lián)合給藥各時(shí)間點(diǎn)BV2細(xì)胞增殖變化（%，±s）

表2 LPS和GS聯(lián)合給藥各時(shí)間點(diǎn)BV2細(xì)胞增殖變化（%，±s）

LPS（3 μg/mL）+GS（30 μg/mL）6 h 12 h 24 h 48 h 72 h 168 h n55 5 5 55增殖率100.00±0.44 95.32±1.66 88.75±9.77 90.51±13.58 87.45±10.64 85.83±13.62

圖1 LPS和GS聯(lián)合給藥對(duì)BV2細(xì)胞增殖影響

2.2 GS對(duì)TLR4/NF-κB通路各關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響

見表3，圖2。與NC組相比，LPS給藥6、12、24 h，TLR4/NF-κB 通路相關(guān)蛋白（TLR4、TRIF、MyD88、NF-κB、p-NF-κB）表達(dá)量顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與LPS組相關(guān)，GS干預(yù)后能在一定程度上下調(diào)其相關(guān)蛋白的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 各組細(xì)胞TLR4/NF-κB通路蛋白表達(dá)量比較（±s）

表3 各組細(xì)胞TLR4/NF-κB通路蛋白表達(dá)量比較（±s）

注：與NC組比較，△P＜0.05；與LPS組比較，*P＜0.05。

組別NC組（n=5）LPS組（n=5）LPS+GS組（n=5）時(shí)間6 h 12 h 24 h 6 h 12 h 24 h 6 h 12 h 24 h TLR4 0.22±0.07 0.28±0.07 0.28±0.07 0.23±0.06 0.45±0.06△0.92±0.06△0.18±0.07 0.18±0.05△*0.38±0.03△*TRIF 0.68±0.15 0.71±0.15 1.06±0.15 0.75±0.12 1.28±0.12△1.75±0.12△0.53±0.10△*0.93±0.12△*0.53±0.10△*MyD88 1.55±0.23 0.65±0.13 0.44±0.08 1.73±0.18 0.96±0.18△0.73±0.18△1.16±0.16△*0.72±0.16*0.34±0.06*NF-κB 1.72±0.15 0.85±0.15 1.42±0.15 2.23±0.19△1.64±0.19△2.23±0.20△1.17±0.17△*1.21±0.15△*1.12±0.17△*p-NF-κB 0.92±0.11 0.82±0.11 1.02±0.11 1.46±0.12△1.26±0.12△1.56±0.12△0.98±0.09*0.91±0.09*0.68±0.09△*

圖2 免疫印跡法檢測TLR4/NF-κB通路各蛋白表達(dá)情況

2.3 GS對(duì)細(xì)胞因子表達(dá)的影響

見表4。與NC組相比，LPS誘導(dǎo)后TNF-α、IL-1β表達(dá)量顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與LPS組相比，GS干預(yù)后能在一定程度上下調(diào)TNF-α、IL-1β表達(dá)，并上調(diào)TGF-β、IL-10的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表4 各組相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)比較（pg/mL，±s）

表4 各組相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)比較（pg/mL，±s）

組別NC組（n=5）LPS組（n=5）LPS+GS組（n=5）時(shí)間6 h 12 h 24 h 6 h 12 h 24 h 6 h 12 h 24 h TNF-α 20.55±3.56 68.34±10.34 64.31±5.28 38.91±6.06△122.62±20.78△159.35±21.05△15.24±3.12*35.36±5.40△*121.81±8.21△*IL-1β 10.56±3.56 28.34±10.55 34.31±5.42 38.90±06.06△72.62±10.78△98.35±21.05△25.20±3.12△*42.36±5.40△*58.81±8.10△*TGF-β 1.45±0.56 3.34±1.34 4.31±1.42 4.96±1.06△3.34±1.34△18.35±2.05△10.21±2.12△*22.36±3.42△*28.81±3.17△*IL-10 3.45±0.56 8.34±1.34 24.31±5.42 8.91±1.06△22.62±3.78△38.35±8.05△15.23±2.12△*42.36±5.44△*58.81±8.28△*

3 討論

膿毒癥相關(guān)性腦病作為膿毒癥嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，因其較高的致死和致殘率備受臨床關(guān)注。雖然目前SAE的發(fā)病機(jī)制仍有諸多不明確之處，但感染所致的炎癥反應(yīng)作為膿毒癥的始發(fā)因素，貫穿著膿毒癥疾病的發(fā)生、發(fā)展過程，同樣神經(jīng)炎癥反應(yīng)也是導(dǎo)致SAE發(fā)病的最重要的機(jī)制之一，積極地干預(yù)炎癥反應(yīng)也是目前治療膿毒癥及其并發(fā)癥的核心［1-2］。TLR4/NF-κB通路作為經(jīng)典的固有免疫應(yīng)答通路，是誘導(dǎo)SAE神經(jīng)炎癥反應(yīng)最重要的信號(hào)通路。雖然目前對(duì)TLR4/NF-κB通路的活化機(jī)制相對(duì)明確，但近期被寄予厚望的TLR4受體結(jié)合的拮抗劑Eritoran（NCT00334828）和小分子TAK-242（NCT00633477）皆在三期臨床宣告了失?。?-10］。因此，積極地深究其機(jī)制和尋找新型、高效的TLR4/NF-κB通路抑制劑具有重要的臨床意義。

傳統(tǒng)中藥乳香-沒藥藥對(duì)具有活血散瘀、宣通臟腑之功效，契合于SAE的病機(jī)——痰濁瘀血，蒙蔽清竅，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)常將其用于抗炎、抗腫瘤、抗氧化、改善認(rèn)知等。膿毒癥發(fā)生后各種因素導(dǎo)致血腦屏障的損傷，使得LPS有機(jī)會(huì)通過受損的血腦屏障進(jìn)入腦組織中激活腦內(nèi)的固有免疫細(xì)胞—小膠質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)而激活TLR4/NF-κB信號(hào)通路［11］。當(dāng)LPS與TLR4結(jié)合后，即開啟下游一系列反應(yīng)。這種由TLR4介導(dǎo)的信號(hào)通路又可分為2條途徑：一種為MyD88依賴途徑，一種為非依賴MyD88途徑，也稱TRIF依賴途徑，在膿毒癥中主要以MyD88依賴途徑為主［12］。MyD88通過激活下游一系列信號(hào)因子，最終激活NF-κB并使之磷酸化，進(jìn)而被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)，促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞釋放細(xì)胞因子包括TNF-α、IL-1β、IL-6等。作為重要的細(xì)胞因子，TNF-α、IL-1β、IL-6不僅能夠調(diào)節(jié)、誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞從血管向神經(jīng)組織遷移，也能夠直接激活細(xì)胞凋亡信號(hào)通路導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡。當(dāng)這些細(xì)胞因子大量進(jìn)入組織后，又可以作為胞外刺激因子再次激活NF-κB，形成正反饋的級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)［13-14］。本研究也發(fā)現(xiàn)，在LPS造模后6、12、24 h后，TLR4/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)量顯著增加，GS干預(yù)后能在一定程度上下調(diào)其相關(guān)蛋白的表達(dá)，且對(duì)細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β表達(dá)有顯著的抑制作用。

另外我們還發(fā)現(xiàn)，GS能夠逆轉(zhuǎn)LPS對(duì)BV2細(xì)胞的增殖抑制作用，且能夠增加細(xì)胞因子IL-10和TGF-β的表達(dá)。小膠質(zhì)細(xì)胞起源于胚胎時(shí)期的卵黃囊髓系祖細(xì)胞，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)“唯一”的免疫細(xì)胞，相當(dāng)于腦和脊髓中的“巨噬細(xì)胞”，在SAE神經(jīng)炎癥反應(yīng)中扮演著不可或缺的角色［15］。小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)高度可塑，當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生出血、感染或創(chuàng)傷等病理改變時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞迅速活化，胞體增大，呈阿米巴樣，突起變短甚至消失，并具備遷徙和吞噬能力［16-17］?；罨男∧z質(zhì)細(xì)胞依據(jù)抗原標(biāo)志物和功能分為兩種表型：M1表型和M2表型。M1表型是小膠質(zhì)細(xì)胞的經(jīng)典激活途徑，主要表達(dá)CD16、CD32和CD86等表面抗原，分泌IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎因子，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，并產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用。M2表型是小膠質(zhì)細(xì)胞的替代激活途徑，主要表達(dá)精氨酸酶1（Arg-1）和CD206等表面抗原，分泌IL-10、胰島素樣生長因子-1（IGF-1）和TGF-β等抗炎因子，抑制中樞炎癥反應(yīng)的過度發(fā)生、分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子，對(duì)神經(jīng)元發(fā)揮保護(hù)作用［18-20］。這也意味著，在LPS適當(dāng)濃度的誘導(dǎo)下，小膠質(zhì)細(xì)胞能夠朝著M1型大量分化，而GS能夠促使小膠質(zhì)細(xì)胞朝著M2型分化，但具體調(diào)控機(jī)制尚不明確。

綜上所述，我們推測GS具有調(diào)控SAE神經(jīng)炎癥反應(yīng)作用，且其保護(hù)作用機(jī)制可能與下調(diào)TLR4/NF-κB信號(hào)通路表達(dá)及調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞定向分化有關(guān)，但具體的調(diào)控靶點(diǎn)尚不明確，需進(jìn)一步探究。