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    調(diào)理中焦氣機法對膿毒癥大鼠腸道屏障損傷及炎癥因子的影響*

    2022-11-02 06:41:22李國臣王為為田正云魏久翔范開亮
    中國中醫(yī)急癥 2022年10期
    關鍵詞:中藥劑量血清

    李國臣 王為為 田正云 謝 娜 魏久翔 郝 浩 范開亮 孔 立△

    (1.山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院,山東 濟南 250011;2.山東中醫(yī)藥大學,山東 濟南 250014)

    膿毒癥是因感染導致的危及生命的器官功能障礙[1-2],病死率高達29%~38%[3-4]。胃腸道是膿毒癥發(fā)病早期最易累及的器官之一,是“應激反應的中心”,是“多器官功能障礙(MODS)的發(fā)動機”,膿毒癥合并急性胃腸損傷可進一步加重全身感染,加速SIRS向MODS的發(fā)生發(fā)展,并與患者不良預后密切相關[5-6]。最新研究證實,在導致膿毒癥胃腸損害的眾多機制中,炎癥介質(zhì)的失控性釋放是其主要機制[7-8],因此從炎癥反應入手探討減輕膿毒癥胃腸損傷具有重要意義。

    近年來,中醫(yī)學在防治膿毒癥及器官損害方面進行了深入探索[9-10]。本研究團隊提出膿毒癥的根本病機為氣機逆亂,中焦脾胃是氣機逆亂的樞紐,調(diào)理中焦氣機是膿毒癥治療的關鍵。臨床研究發(fā)現(xiàn),通過調(diào)理中焦氣機可明顯改善患者腹脹腹痛、惡心反流、便秘或下利等臨床癥狀,能降低患者腹內(nèi)壓,恢復腸鳴音,減輕胃腸道損傷[11-12]。但其防治膿毒癥胃腸功能障礙方面的分子機制仍不明確。本研究擬從膿毒癥胃腸損傷著手,以炎癥反應為切入點,觀察調(diào)理中焦氣機法對膿毒癥大鼠腸屏障的保護作用,探討其分子機制,以期為臨床應用提供實驗依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物

    雄性SD大鼠,共40只,6~8周齡,SPF級,體質(zhì)量(200±20)g,均購自山東彭悅實驗動物公司,合格證號SCXK(魯)20140007。飼養(yǎng)于恒溫(22±20)℃、恒濕(55±5)%條件實驗室。本實驗經(jīng)山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準(AWE-2019-047)。

    1.2 實驗藥物

    半夏瀉心湯組成:清半夏12 g,黃芩9 g,黃連3 g,人參9 g,干姜9 g,甘草9 g,大棗4枚(約16 g)。藥材購自山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中藥房,制劑和質(zhì)量控制由山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院制劑室負責。藥物配置方法:將顆粒煎煮、無菌濾膜過濾后,置60℃水浴箱內(nèi)分別濃縮至含藥1.2、0.6、0.3 g/mL的藥液,常溫冷卻后,4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3 試劑與儀器

    白細胞介素-6(IL-6)試劑盒(Elabscience公司);白細胞介素-1β(IL-1β)試劑盒(Elabscience公司);腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒(Elabscience公司);兔kit(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);檸檬酸抗原修復液(福州邁新生物技術(shù)有限公司);DAB顯色試劑盒(Solarbio公司);IL-6抗體(武漢三鷹科技有限公司);IL-1β抗體(武漢三鷹科技有限公司);TNF-α抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);DAO試劑盒(Elabscience公司);D-乳酸試劑盒(南京Sbjbio科技有限公司);內(nèi)毒素試劑盒(南京Sbjbio科技有限公司)。Muliskan酶標儀(美國Thermo Scientific公司);37℃恒溫箱;可調(diào)微量移液槍(德國Thermor公司);輪轉(zhuǎn)式切片機(LEICA公司);病理組織漂烘儀(郝思琳儀器設備有限公司)顯微鏡(OLYMPUS公司);隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械有限公司);電熱恒溫鼓風干燥箱(上海錦屏儀器有限公司)。

    1.4 模型制備

    采用盲腸結(jié)扎穿孔法(CLP)建立膿毒癥大鼠模型[13]。術(shù)前常規(guī)禁食8 h,術(shù)前腹腔麻醉,待麻醉完全后,中下腹部備皮,消毒后鋪無菌洞巾。雙人協(xié)作,沿腹中線先剪一長約1 cm切口,后逐層開腹,進入腹腔內(nèi),用無菌無齒鑷子輕輕探查找到盲腸。輕輕將盲腸從切口處牽拉至腹腔外,用4-0尼龍縫線結(jié)扎其近回盲瓣端1/3處(避免結(jié)扎回腸及盲腸系膜血管),在結(jié)扎處與盲腸盲端之間中點處用無菌注射器針頭從系膜緣向?qū)ο的ぞ壺炌ù┐?,輕輕擠壓穿刺點附近盲腸并擠出少許腸內(nèi)容物,將盲腸連同擠出的內(nèi)容物一同還納入腹腔,逐層縫合并關閉腹腔,再次皮膚碘伏酒精消毒。另取8只大鼠進行相同的開腹探查術(shù),不進行盲腸結(jié)扎和穿孔,作為假手術(shù)組。手術(shù)結(jié)束后予2 mL/100 g生理鹽水進行液體復蘇。

    1.5 分組及給藥

    40只SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組和中藥高、中、低劑量組,每組8只。按照人-動物體表面積法來計算給藥劑量,假手術(shù)組、模型組予10 mL/kg生理鹽水灌胃;中藥低劑量組予半夏瀉心湯3.05 g/kg灌胃;中藥中劑量組予半夏瀉心湯6.1 g/kg灌胃;中藥高劑量組予半夏瀉心湯12.2 g/kg灌胃。每12小時給藥1次。

    1.6 標本采集與檢測

    1.6.1 血清二胺氧化酶(DAO)、D-乳酸、內(nèi)毒素水平檢測 給藥24 h后對大鼠進行充分麻醉,腹主動脈取血,分離血清,用ELISA法檢測血清DAO、D-乳酸、內(nèi)毒素水平。

    1.6.2 蘇木素-伊紅(HE)染色觀察腸道病理形態(tài)學變化 給藥24 h后取回腸部腸組織后經(jīng)甲醛固定,乙醇脫水,石蠟包埋,切片,二甲苯脫蠟,HE染色,中性樹膠封片。在光學顯微鏡下觀察腸黏膜組織病理學改變,參照Chiu's腸黏膜損傷評分標準,根據(jù)炎癥、萎縮和腸上皮化生等組織學變化分為0~5級,分別計1~6分。

    1.6.3 血清IL-1β、IL-6和TNF-α檢測 給藥24 h后對大鼠進行充分麻醉,腹主動脈取血,分離血清,用ELISA法檢測血清炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平。

    1.6.4 免疫組化法檢測腸組織中IL-1β、IL-6、TNF-α表達 給藥24 h后取回腸部腸組織,制作石蠟切片,將石蠟切片進行脫蠟,3%H2O2去離子水中孵育,滴加試劑A,滴加一抗,滴加試劑B,滴加試劑C。使用蘇木素復染,再用鹽酸乙醇分化。透明后,樹脂膠封片,充分凝固后。在鏡下選擇染色均勻清晰區(qū)域進行圖像采集和分析,每腸組織選擇3張切片,在顯微鏡下每張切片分別截取5個視野,截取的這5個視野中每個視野互不重疊。

    1.7 統(tǒng)計學處理

    應用IBM SPSS20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以()表示,多組比較選用單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。數(shù)據(jù)圖表選用Graphpad prism 6.0進行繪制。

    2 結(jié)果

    2.1 各組大鼠血清DAO、D-乳酸、內(nèi)毒素水平比較

    見表1。與假手術(shù)組相比,造模后大鼠血清DAO、D-乳酸和內(nèi)毒素水平明顯升高(P<0.01);與模型組比較,中藥治療組大鼠血清DAO、D-乳酸和內(nèi)毒素水平均有降低(P<0.01);不同劑量組間比較,高劑量組治療效果最優(yōu)(P<0.01或P<0.05)。

    表1 各組大鼠血清DAO、D-乳酸和內(nèi)毒素水平比較(pg/mL,±s)

    表1 各組大鼠血清DAO、D-乳酸和內(nèi)毒素水平比較(pg/mL,±s)

    注:與假手術(shù)組比較,*P<0.01;與模型組比較,#P<0.01;與中藥中劑量組比較,△P<0.05,▲P<0.01。下同。

    組別假手術(shù)組模型組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組n 8 8 8 8 8 DAO 74.97±13.83 268.12±11.28*212.81±20.58*#▲169.79±4.53*#144.31±7.65*#▲D-乳酸772.85±19.09 1 330.38±33.86*1 140.31±19.94*#▲1 032.81±30.68*#883.93±23.90*#▲內(nèi)毒素67.15±2.49 128.81±10.48*114.61±3.02*#▲94.51±3.65*#84.82±1.45*#△

    2.2 各組大鼠腸道病理形態(tài)學變化

    假手術(shù)組黏膜層腸上皮結(jié)構(gòu)完整,上皮細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常、排列緊密,固有層腸腺豐富,可見較多杯狀細胞,未見明顯炎癥。模型組黏膜層可見大面積上皮細胞脫落,固有層裸露;局部可見潰瘍,固有層腸腺數(shù)量減少,被增生的結(jié)締組織取代,伴有較多淋巴細胞浸潤;局部可見靜脈血管淤血擴張。中藥治療組中中藥高劑量組腸黏膜損傷最輕,黏膜層局部可見少量上皮細胞脫落;固有層腸腺豐富,可見較多杯狀細胞,局部可見少量炎性浸潤。見表2,圖1。

    表2 各組腸組織病理損傷Chiu's評分比較(分,±s)

    表2 各組腸組織病理損傷Chiu's評分比較(分,±s)

    組 別n 病理評分8 8 8 8 8假手術(shù)組模型組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組1.00±0.76 5.25±0.46*4.37±0.52*#△3.75±0.46*#3.25±0.46*#△

    圖1 各組大鼠腸道病理形態(tài)學變化(HE染色,200倍)

    2.3 各組大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平比較

    見表3。與假手術(shù)組比較,各造模組大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平明顯升高(P<0.01);與模型組比較,中藥治療組大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平下降(P<0.01),中藥高劑量組水平最低(P<0.05)。

    表3 各組大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平比較(pg/mL,±s)

    表3 各組大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平比較(pg/mL,±s)

    組別假手術(shù)組模型組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組n 8 8 8 8 8 IL-1β 261.04±13.89 958.80±18.14*730.66±9.99*#▲554.19±57.47*#458.76±53.78*#▲IL-6 62.92±0.69 203.74±8.92*178.18±6.60*#▲126.86±12.09*#102.78±5.27*#▲TNF-α 24.97±2.82 116.10±11.95*82.19±10.08*#▲75.88±2.61*#51.72±0.99*#▲

    2.4 各組大鼠腸組織IL-1β、IL-6和TNF-α表達比較

    見表4,圖2。使用ImageJ pro6.0軟件對免疫組化照片進行分析,每張切片選取3張200倍照片,計算其平均光密度進行比較分析。結(jié)果顯示,與假手術(shù)組相比,其余各組腸組織IL-1β、IL-6和TNF-α陽性表達顯著升高(P<0.01);與模型組相比,中藥治療組大鼠腸組織IL-1β、IL-6和TNF-α陽性表達顯著降低(P<0.01);中藥高劑量組陽性表達最低(P<0.05)。

    表4 各組大鼠腸組織IL-1β、IL-6和TNF-α水平比較(±s)

    表4 各組大鼠腸組織IL-1β、IL-6和TNF-α水平比較(±s)

    組別假手術(shù)組模型組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組n 8 8 8 8 8 IL-1β 9.08±0.68 58.83±6.30*#45.46±4.37*#▲33.48±4.7*#23.44±3.47*#△IL-6 24.04±2.18 89.83±8.92*#69.39±7.10*#▲52.87±3.84*#39.79±2.79*#△TNF-α 1.47±0.25 12.11±1.87*#9.05±7.34*#▲6.29±0.96*#4.28±0.40*#△

    圖2 各組大鼠腸組織IL-1β、IL-6和TNF-α陽性表達

    3 討論

    膿毒癥是因感染導致的危及生命的器官功能障礙,胃腸道是膿毒癥時最易受損的器官,易發(fā)生胃腸功能障礙。胃腸功能的正常,有賴于腸道屏障功能的完整性?,F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥時炎癥因子過度釋放,失控的炎癥反應是導致腸道屏障功能損傷的主要病理機制。膿毒癥初期細菌內(nèi)毒素或脂多糖與結(jié)合蛋白結(jié)合形成免疫復合物,與單核細胞或巨噬細胞表面的Toll樣受體相結(jié)合,加速炎癥因子的分泌與釋放,導致全身性炎癥表現(xiàn)。炎癥因子的大量釋放可對腸道上皮細胞造成損傷,引起腸黏膜水腫、充血,上皮細胞膜及細胞間固有連接斷裂,細胞壞死,造成腸道通透性增加、腸道屏障功能受損[14-15]。本研究采用國際公認的盲腸結(jié)扎穿孔法制備膿毒癥大鼠模型,研究發(fā)現(xiàn),造模后膿毒癥大鼠血清DAO、D-乳酸、內(nèi)毒素等反映腸道屏障損傷的指標明顯上升,提示膿毒癥大鼠腸道屏障受損,同時血清及腸組織中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平明顯升高,提示發(fā)生了失控的炎癥反應,這與相關研究報道一致。

    膿毒癥是一種復雜疾病,涉及全身多臟器,往往毒邪、痰濁、瘀血等諸邪畢至,相兼為病,單從某一臟某一腑進行論治,往往不能涵蓋整個膿毒癥病機。孔立教授認為縱觀膿毒癥整個病變過程,氣機逆亂貫穿于膿毒癥始終,西醫(yī)所說的器官功能障礙或衰竭,即是中醫(yī)的臟腑氣機逆亂,提出膿毒癥的根本病機為氣機逆亂,特點是始于一處、五臟皆亂。臟腑功能的正常要靠臟腑之氣的升降出入?yún)f(xié)調(diào)平衡,臟腑氣機逆亂,則精氣血精液化生和輸布異常,痰濁、瘀血、火毒之邪驟生,合而致病,日久由氣及血致虛,最終致氣血衰敗,出現(xiàn)臟腑受損,危及生命??琢⒔淌谕ㄟ^分析五臟生理特點并結(jié)合三焦辨證,進一步指出:五臟氣機逆亂始于肺,中焦脾胃是五臟氣機逆亂的樞紐,調(diào)理中焦氣機是膿毒癥治療的關鍵,應貫穿膿毒癥始終。

    半夏瀉心湯源于漢·張仲景所著《傷寒雜病論》,仲景初用之治療痞證,后隨著中醫(yī)體系發(fā)展,其可用以治療各種因中焦氣機逆亂所致疾病,為調(diào)理中焦氣機代表方,方中半夏、干姜之辛散合黃芩、黃連之苦降,協(xié)調(diào)恢復中焦氣機升降之職??嘈梁嫌?,寓開于瀉,通而有降,使清陽得升,濁陰得降,中焦氣機升降復常。同時,半夏瀉心湯寒溫并投、調(diào)和陰陽,甘溫調(diào)補、扶正祛邪的特點,正符合臨床對于膿毒癥胃腸功能障礙患者的治療要求。半夏瀉心湯藥理研究進展迅速,已證實其具有調(diào)控腸道炎癥反應、保護胃腸黏膜、改善腸道菌群、調(diào)節(jié)胃腸動力、免疫應答和調(diào)控胃腸激素分泌的作用[16-18]。本研究發(fā)現(xiàn),給予半夏瀉心湯治療后,膿毒癥大鼠血清DAO、D-乳酸、內(nèi)毒素水平明顯下降,腸道組織病理學評分降低,提示膿毒癥大鼠腸道屏障損傷減輕,同時血清及腸組織中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平也明顯下降,提示半夏瀉心湯治療能下調(diào)膿毒癥時失控的炎癥反應。同時,不同劑量組間比較,半夏瀉心湯高劑量組治療作用最優(yōu),具有劑量依賴性。

    本研究通過盲腸結(jié)扎穿孔法制備膿毒癥大鼠模型,予調(diào)理中焦氣機的半夏瀉心湯干預,半夏瀉心湯治療能降低膿毒癥大鼠血清和腸組織中IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥因子水平,對膿毒癥大鼠腸屏障損傷具有保護作用,并存在劑量依賴性。本研究說明調(diào)理中焦氣機法可以減輕膿毒癥大鼠腸道屏障損傷,這可能與其抑制炎癥因子的釋放有關。

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