調(diào)理中焦氣機(jī)法對膿毒癥大鼠腸道屏障損傷及炎癥因子的影響*

李國臣 王為為 田正云 謝 娜 魏久翔 郝 浩 范開亮 孔 立△

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250011；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250014）

膿毒癥是因感染導(dǎo)致的危及生命的器官功能障礙［1-2］，病死率高達(dá)29%～38%［3-4］。胃腸道是膿毒癥發(fā)病早期最易累及的器官之一，是“應(yīng)激反應(yīng)的中心”，是“多器官功能障礙（MODS）的發(fā)動(dòng)機(jī)”，膿毒癥合并急性胃腸損傷可進(jìn)一步加重全身感染，加速SIRS向MODS的發(fā)生發(fā)展，并與患者不良預(yù)后密切相關(guān)［5-6］。最新研究證實(shí)，在導(dǎo)致膿毒癥胃腸損害的眾多機(jī)制中，炎癥介質(zhì)的失控性釋放是其主要機(jī)制［7-8］，因此從炎癥反應(yīng)入手探討減輕膿毒癥胃腸損傷具有重要意義。

近年來，中醫(yī)學(xué)在防治膿毒癥及器官損害方面進(jìn)行了深入探索［9-10］。本研究團(tuán)隊(duì)提出膿毒癥的根本病機(jī)為氣機(jī)逆亂，中焦脾胃是氣機(jī)逆亂的樞紐，調(diào)理中焦氣機(jī)是膿毒癥治療的關(guān)鍵。臨床研究發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)理中焦氣機(jī)可明顯改善患者腹脹腹痛、惡心反流、便秘或下利等臨床癥狀，能降低患者腹內(nèi)壓，恢復(fù)腸鳴音，減輕胃腸道損傷［11-12］。但其防治膿毒癥胃腸功能障礙方面的分子機(jī)制仍不明確。本研究擬從膿毒癥胃腸損傷著手，以炎癥反應(yīng)為切入點(diǎn)，觀察調(diào)理中焦氣機(jī)法對膿毒癥大鼠腸屏障的保護(hù)作用，探討其分子機(jī)制，以期為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD大鼠，共40只，6～8周齡，SPF級，體質(zhì)量（200±20）g，均購自山東彭悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，合格證號SCXK（魯）20140007。飼養(yǎng)于恒溫（22±20）℃、恒濕（55±5）%條件實(shí)驗(yàn)室。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（AWE-2019-047）。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

半夏瀉心湯組成：清半夏12 g，黃芩9 g，黃連3 g，人參9 g，干姜9 g，甘草9 g，大棗4枚（約16 g）。藥材購自山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房，制劑和質(zhì)量控制由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室負(fù)責(zé)。藥物配置方法：將顆粒煎煮、無菌濾膜過濾后，置60℃水浴箱內(nèi)分別濃縮至含藥1.2、0.6、0.3 g/mL的藥液，常溫冷卻后，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑與儀器

白細(xì)胞介素-6（IL-6）試劑盒（Elabscience公司）；白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）試劑盒（Elabscience公司）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒（Elabscience公司）；兔kit（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；檸檬酸抗原修復(fù)液（福州邁新生物技術(shù)有限公司）；DAB顯色試劑盒（Solarbio公司）；IL-6抗體（武漢三鷹科技有限公司）；IL-1β抗體（武漢三鷹科技有限公司）；TNF-α抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；DAO試劑盒（Elabscience公司）；D-乳酸試劑盒（南京Sbjbio科技有限公司）；內(nèi)毒素試劑盒（南京Sbjbio科技有限公司）。Muliskan酶標(biāo)儀（美國Thermo Scientific公司）；37℃恒溫箱；可調(diào)微量移液槍（德國Thermor公司）；輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（LEICA公司）；病理組織漂烘儀（郝思琳儀器設(shè)備有限公司）顯微鏡（OLYMPUS公司）；隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海錦屏儀器有限公司）。

1.4 模型制備

采用盲腸結(jié)扎穿孔法（CLP）建立膿毒癥大鼠模型［13］。術(shù)前常規(guī)禁食8 h，術(shù)前腹腔麻醉，待麻醉完全后，中下腹部備皮，消毒后鋪無菌洞巾。雙人協(xié)作，沿腹中線先剪一長約1 cm切口，后逐層開腹，進(jìn)入腹腔內(nèi)，用無菌無齒鑷子輕輕探查找到盲腸。輕輕將盲腸從切口處牽拉至腹腔外，用4-0尼龍縫線結(jié)扎其近回盲瓣端1/3處（避免結(jié)扎回腸及盲腸系膜血管），在結(jié)扎處與盲腸盲端之間中點(diǎn)處用無菌注射器針頭從系膜緣向?qū)ο的ぞ壺炌ù┐?，輕輕擠壓穿刺點(diǎn)附近盲腸并擠出少許腸內(nèi)容物，將盲腸連同擠出的內(nèi)容物一同還納入腹腔，逐層縫合并關(guān)閉腹腔，再次皮膚碘伏酒精消毒。另取8只大鼠進(jìn)行相同的開腹探查術(shù)，不進(jìn)行盲腸結(jié)扎和穿孔，作為假手術(shù)組。手術(shù)結(jié)束后予2 mL/100 g生理鹽水進(jìn)行液體復(fù)蘇。

1.5 分組及給藥

40只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和中藥高、中、低劑量組，每組8只。按照人-動(dòng)物體表面積法來計(jì)算給藥劑量，假手術(shù)組、模型組予10 mL/kg生理鹽水灌胃；中藥低劑量組予半夏瀉心湯3.05 g/kg灌胃；中藥中劑量組予半夏瀉心湯6.1 g/kg灌胃；中藥高劑量組予半夏瀉心湯12.2 g/kg灌胃。每12小時(shí)給藥1次。

1.6 標(biāo)本采集與檢測

1.6.1 血清二胺氧化酶（DAO）、D-乳酸、內(nèi)毒素水平檢測 給藥24 h后對大鼠進(jìn)行充分麻醉，腹主動(dòng)脈取血，分離血清，用ELISA法檢測血清DAO、D-乳酸、內(nèi)毒素水平。

1.6.2 蘇木素-伊紅（HE）染色觀察腸道病理形態(tài)學(xué)變化 給藥24 h后取回腸部腸組織后經(jīng)甲醛固定，乙醇脫水，石蠟包埋，切片，二甲苯脫蠟，HE染色，中性樹膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察腸黏膜組織病理學(xué)改變，參照Chiu's腸黏膜損傷評分標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)炎癥、萎縮和腸上皮化生等組織學(xué)變化分為0～5級，分別計(jì)1～6分。

1.6.3 血清IL-1β、IL-6和TNF-α檢測 給藥24 h后對大鼠進(jìn)行充分麻醉，腹主動(dòng)脈取血，分離血清，用ELISA法檢測血清炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平。

1.6.4 免疫組化法檢測腸組織中IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá) 給藥24 h后取回腸部腸組織，制作石蠟切片，將石蠟切片進(jìn)行脫蠟，3%H2O2去離子水中孵育，滴加試劑A，滴加一抗，滴加試劑B，滴加試劑C。使用蘇木素復(fù)染，再用鹽酸乙醇分化。透明后，樹脂膠封片，充分凝固后。在鏡下選擇染色均勻清晰區(qū)域進(jìn)行圖像采集和分析，每腸組織選擇3張切片，在顯微鏡下每張切片分別截取5個(gè)視野，截取的這5個(gè)視野中每個(gè)視野互不重疊。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用IBM SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，多組比較選用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)圖表選用Graphpad prism 6.0進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清DAO、D-乳酸、內(nèi)毒素水平比較

見表1。與假手術(shù)組相比，造模后大鼠血清DAO、D-乳酸和內(nèi)毒素水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，中藥治療組大鼠血清DAO、D-乳酸和內(nèi)毒素水平均有降低（P＜0.01）；不同劑量組間比較，高劑量組治療效果最優(yōu)（P＜0.01或P＜0.05）。

表1 各組大鼠血清DAO、D-乳酸和內(nèi)毒素水平比較（pg/mL，±s）

表1 各組大鼠血清DAO、D-乳酸和內(nèi)毒素水平比較（pg/mL，±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01；與中藥中劑量組比較，△P＜0.05，▲P＜0.01。下同。

組別假手術(shù)組模型組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組n 8 8 8 8 8 DAO 74.97±13.83 268.12±11.28*212.81±20.58*#▲169.79±4.53*#144.31±7.65*#▲D-乳酸772.85±19.09 1 330.38±33.86*1 140.31±19.94*#▲1 032.81±30.68*#883.93±23.90*#▲內(nèi)毒素67.15±2.49 128.81±10.48*114.61±3.02*#▲94.51±3.65*#84.82±1.45*#△

2.2 各組大鼠腸道病理形態(tài)學(xué)變化

假手術(shù)組黏膜層腸上皮結(jié)構(gòu)完整，上皮細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常、排列緊密，固有層腸腺豐富，可見較多杯狀細(xì)胞，未見明顯炎癥。模型組黏膜層可見大面積上皮細(xì)胞脫落，固有層裸露；局部可見潰瘍，固有層腸腺數(shù)量減少，被增生的結(jié)締組織取代，伴有較多淋巴細(xì)胞浸潤；局部可見靜脈血管淤血擴(kuò)張。中藥治療組中中藥高劑量組腸黏膜損傷最輕，黏膜層局部可見少量上皮細(xì)胞脫落；固有層腸腺豐富，可見較多杯狀細(xì)胞，局部可見少量炎性浸潤。見表2，圖1。

表2 各組腸組織病理損傷Chiu's評分比較（分，±s）

表2 各組腸組織病理損傷Chiu's評分比較（分，±s）

組 別n 病理評分8 8 8 8 8假手術(shù)組模型組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組1.00±0.76 5.25±0.46*4.37±0.52*#△3.75±0.46*#3.25±0.46*#△

圖1 各組大鼠腸道病理形態(tài)學(xué)變化（HE染色，200倍）

2.3 各組大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平比較

見表3。與假手術(shù)組比較，各造模組大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，中藥治療組大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平下降（P＜0.01），中藥高劑量組水平最低（P＜0.05）。

表3 各組大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平比較（pg/mL，±s）

表3 各組大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平比較（pg/mL，±s）

組別假手術(shù)組模型組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組n 8 8 8 8 8 IL-1β 261.04±13.89 958.80±18.14*730.66±9.99*#▲554.19±57.47*#458.76±53.78*#▲IL-6 62.92±0.69 203.74±8.92*178.18±6.60*#▲126.86±12.09*#102.78±5.27*#▲TNF-α 24.97±2.82 116.10±11.95*82.19±10.08*#▲75.88±2.61*#51.72±0.99*#▲

2.4 各組大鼠腸組織IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)比較

見表4，圖2。使用ImageJ pro6.0軟件對免疫組化照片進(jìn)行分析，每張切片選取3張200倍照片，計(jì)算其平均光密度進(jìn)行比較分析。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，其余各組腸組織IL-1β、IL-6和TNF-α陽性表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，中藥治療組大鼠腸組織IL-1β、IL-6和TNF-α陽性表達(dá)顯著降低（P＜0.01）；中藥高劑量組陽性表達(dá)最低（P＜0.05）。

表4 各組大鼠腸組織IL-1β、IL-6和TNF-α水平比較（±s）

表4 各組大鼠腸組織IL-1β、IL-6和TNF-α水平比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組n 8 8 8 8 8 IL-1β 9.08±0.68 58.83±6.30*#45.46±4.37*#▲33.48±4.7*#23.44±3.47*#△IL-6 24.04±2.18 89.83±8.92*#69.39±7.10*#▲52.87±3.84*#39.79±2.79*#△TNF-α 1.47±0.25 12.11±1.87*#9.05±7.34*#▲6.29±0.96*#4.28±0.40*#△

圖2 各組大鼠腸組織IL-1β、IL-6和TNF-α陽性表達(dá)

3 討論

膿毒癥是因感染導(dǎo)致的危及生命的器官功能障礙，胃腸道是膿毒癥時(shí)最易受損的器官，易發(fā)生胃腸功能障礙。胃腸功能的正常，有賴于腸道屏障功能的完整性。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥時(shí)炎癥因子過度釋放，失控的炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致腸道屏障功能損傷的主要病理機(jī)制。膿毒癥初期細(xì)菌內(nèi)毒素或脂多糖與結(jié)合蛋白結(jié)合形成免疫復(fù)合物，與單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞表面的Toll樣受體相結(jié)合，加速炎癥因子的分泌與釋放，導(dǎo)致全身性炎癥表現(xiàn)。炎癥因子的大量釋放可對腸道上皮細(xì)胞造成損傷，引起腸黏膜水腫、充血，上皮細(xì)胞膜及細(xì)胞間固有連接斷裂，細(xì)胞壞死，造成腸道通透性增加、腸道屏障功能受損［14-15］。本研究采用國際公認(rèn)的盲腸結(jié)扎穿孔法制備膿毒癥大鼠模型，研究發(fā)現(xiàn)，造模后膿毒癥大鼠血清DAO、D-乳酸、內(nèi)毒素等反映腸道屏障損傷的指標(biāo)明顯上升，提示膿毒癥大鼠腸道屏障受損，同時(shí)血清及腸組織中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平明顯升高，提示發(fā)生了失控的炎癥反應(yīng)，這與相關(guān)研究報(bào)道一致。

膿毒癥是一種復(fù)雜疾病，涉及全身多臟器，往往毒邪、痰濁、瘀血等諸邪畢至，相兼為病，單從某一臟某一腑進(jìn)行論治，往往不能涵蓋整個(gè)膿毒癥病機(jī)?？琢⒔淌谡J(rèn)為縱觀膿毒癥整個(gè)病變過程，氣機(jī)逆亂貫穿于膿毒癥始終，西醫(yī)所說的器官功能障礙或衰竭，即是中醫(yī)的臟腑氣機(jī)逆亂，提出膿毒癥的根本病機(jī)為氣機(jī)逆亂，特點(diǎn)是始于一處、五臟皆亂。臟腑功能的正常要靠臟腑之氣的升降出入?yún)f(xié)調(diào)平衡，臟腑氣機(jī)逆亂，則精氣血精液化生和輸布異常，痰濁、瘀血、火毒之邪驟生，合而致病，日久由氣及血致虛，最終致氣血衰敗，出現(xiàn)臟腑受損，危及生命?？琢⒔淌谕ㄟ^分析五臟生理特點(diǎn)并結(jié)合三焦辨證，進(jìn)一步指出：五臟氣機(jī)逆亂始于肺，中焦脾胃是五臟氣機(jī)逆亂的樞紐，調(diào)理中焦氣機(jī)是膿毒癥治療的關(guān)鍵，應(yīng)貫穿膿毒癥始終。

半夏瀉心湯源于漢·張仲景所著《傷寒雜病論》，仲景初用之治療痞證，后隨著中醫(yī)體系發(fā)展，其可用以治療各種因中焦氣機(jī)逆亂所致疾病，為調(diào)理中焦氣機(jī)代表方，方中半夏、干姜之辛散合黃芩、黃連之苦降，協(xié)調(diào)恢復(fù)中焦氣機(jī)升降之職?？嘈梁嫌茫㈤_于瀉，通而有降，使清陽得升，濁陰得降，中焦氣機(jī)升降復(fù)常。同時(shí)，半夏瀉心湯寒溫并投、調(diào)和陰陽，甘溫調(diào)補(bǔ)、扶正祛邪的特點(diǎn)，正符合臨床對于膿毒癥胃腸功能障礙患者的治療要求。半夏瀉心湯藥理研究進(jìn)展迅速，已證實(shí)其具有調(diào)控腸道炎癥反應(yīng)、保護(hù)胃腸黏膜、改善腸道菌群、調(diào)節(jié)胃腸動(dòng)力、免疫應(yīng)答和調(diào)控胃腸激素分泌的作用［16-18］。本研究發(fā)現(xiàn)，給予半夏瀉心湯治療后，膿毒癥大鼠血清DAO、D-乳酸、內(nèi)毒素水平明顯下降，腸道組織病理學(xué)評分降低，提示膿毒癥大鼠腸道屏障損傷減輕，同時(shí)血清及腸組織中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平也明顯下降，提示半夏瀉心湯治療能下調(diào)膿毒癥時(shí)失控的炎癥反應(yīng)。同時(shí)，不同劑量組間比較，半夏瀉心湯高劑量組治療作用最優(yōu)，具有劑量依賴性。

本研究通過盲腸結(jié)扎穿孔法制備膿毒癥大鼠模型，予調(diào)理中焦氣機(jī)的半夏瀉心湯干預(yù)，半夏瀉心湯治療能降低膿毒癥大鼠血清和腸組織中IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥因子水平，對膿毒癥大鼠腸屏障損傷具有保護(hù)作用，并存在劑量依賴性。本研究說明調(diào)理中焦氣機(jī)法可以減輕膿毒癥大鼠腸道屏障損傷，這可能與其抑制炎癥因子的釋放有關(guān)。