針刀對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎兔軟骨細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響*

張 茜 張 典 許 悅 陳烯琳 秦露雪 郭長(zhǎng)青

（北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029）

膝骨關(guān)節(jié)炎（KOA）作為一種常見(jiàn)的慢性退行性骨關(guān)節(jié)炎疾病，以疼痛、活動(dòng)受限為主要臨床表現(xiàn)，以軟骨退變、滑膜病變等為主要病理表現(xiàn)［1］。研究顯示，異常生物力學(xué)可參與KOA的發(fā)生，并造成關(guān)節(jié)軟骨活性氧（ROS）的異常升高及抗氧化酶的減少，誘發(fā)軟骨細(xì)胞的氧化應(yīng)激［2］。氧化應(yīng)激可通過(guò)損傷線粒體基因組（mtDNA），及喚醒絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等激酶，或激活c-Jun氨基末端激酶通路（JNK）和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B通路（PI3K/Akt）等通路，而誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡，介導(dǎo)KOA的發(fā)病，并推動(dòng)KOA的病理進(jìn)程［3-6］。一系列研究已證實(shí)，針刀干預(yù)通過(guò)松解關(guān)節(jié)周?chē)浗M織，可幫助恢復(fù)膝關(guān)節(jié)力學(xué)平衡，且對(duì)軟骨細(xì)胞有一定的保護(hù)作用［7-9］。本實(shí)驗(yàn)即在此基礎(chǔ)上，測(cè)定氧化應(yīng)激相關(guān)標(biāo)志物及軟骨細(xì)胞內(nèi)DNA損傷標(biāo)志物，觀察針刀干預(yù)對(duì)KOA兔軟骨細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響，進(jìn)而探索針刀治療異常生物力學(xué)相關(guān)的KOA的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇28只健康清潔級(jí)6月齡雄性新西蘭兔，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，購(gòu)自北京富龍騰飛實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究院有限公司（動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK京2018-0041）。動(dòng)物均單籠飼養(yǎng)，室溫（20±2）℃，濕度40%～70%，標(biāo)準(zhǔn)飲食。

1.2 試劑與儀器 一氧化氮合酶（NOS）測(cè)試盒、丙二醛（MDA）測(cè)試盒、總超氧化物歧化（SOD）酶測(cè)試盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）測(cè)試盒（均購(gòu)自江蘇省南京市建成生物工程研究所）；抗磷酸組蛋白H2AX抗體（05-636-1，購(gòu)自 millipore）；HRP酶標(biāo)記抗小鼠二抗（GB23301，購(gòu)自Servicebio）；胃蛋白酶消化液、PBS緩沖液、組化試劑盒DAB顯色劑、高速組織研磨儀、渦旋混合器、脫色搖床（均購(gòu)自Servicebio）；實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)（AK-RO-C2型，艾肯水精靈）；酶標(biāo)檢測(cè)儀（Epoch型，BioTeK）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、移液器（均購(gòu)自Dragon）；組化筆（購(gòu)自Gene tech）；顯微鏡（購(gòu)自CIC）；電子天平（ME203E/02型，上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；立式冷藏陳列柜（LSC-316C型，星星生物科技有限公司）；臥式冷凍箱、-80℃冰箱（均購(gòu)自中國(guó)中科美菱公司）；4℃冰箱（日本SANYO公司）。

1.3 分組及造模 按照隨機(jī)數(shù)字表法將28只兔隨機(jī)分為空白組、模型組、電針組及針刀組，每組7只。造模方法選擇Videman左后肢伸直位固定制動(dòng)法，并經(jīng)實(shí)際情況改良。造模前10～16 h停止喂食，使用3%戊巴比妥鈉溶液以耳緣靜脈注射方式麻醉，劑量按30 mg/kg確定，后固定動(dòng)物，左后肢腹股溝至踝關(guān)節(jié)區(qū)域備皮，造模過(guò)程中使該肢膝關(guān)節(jié)伸直180°、踝關(guān)節(jié)背屈60°以保持完全伸直位，用65～85℃熱水浸泡高分子繃帶使其軟化，從腹股溝到足踝纏于兔腿，重點(diǎn)固定膝踝關(guān)節(jié)，腹股溝處墊棉以防皮膚磨損，后以硬度適中的紙板、布條及防啃咬繃帶進(jìn)一步固定。留出足趾觀察血供，每日檢查固定情況，及時(shí)處理脫落及腫脹等問(wèn)題，共制動(dòng)6周。

1.4 干預(yù)方法 空白組常規(guī)飼養(yǎng)，不予其他處理。模型組造模之后同空白組，不予干預(yù)。電針組造模成功后選擇左膝部血海、梁丘、犢鼻及外膝眼穴，取穴參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［10］結(jié)合動(dòng)物比較法，上述穴位常規(guī)消毒后，以規(guī)格為0.2 mm×13 mm（環(huán)球牌，蘇州針灸用品有限公司）的一次性無(wú)菌針灸針進(jìn)行針刺治療，后連接韓氏穴位神經(jīng)刺激儀，分別連接血海與犢鼻，梁丘與外膝眼。波形疏密波，頻率2/100 Hz，強(qiáng)度3 mA，治療15 min，隔日1次，共治療4周。針刀組造模成功后選擇0.3 mm×30 mm的HZ系列一次性針刀（北京卓越華友醫(yī)療器械有限公司），以左下肢股內(nèi)側(cè)肌肌腱、股外側(cè)肌肌腱、股直肌肌腱、股二頭肌肌腱止點(diǎn)及條索結(jié)節(jié)點(diǎn)為進(jìn)針部位，在上述部位以龍膽紫定位，常規(guī)備皮、消毒，針刀刃與肌腱或條索結(jié)節(jié)點(diǎn)所在肌肉肌腱走向平行，針刀體與皮膚垂直，按四部規(guī)程進(jìn)針刀，后分別松解各肌腱與骨連接處，及向條索和結(jié)節(jié)的縱軸方向進(jìn)行上下松解2～3次，出針后按壓片刻。每周1次，治療4周。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 各組動(dòng)物于治療結(jié)束后，以過(guò)量麻醉方式處死，在無(wú)菌條件下以直徑為8 mm的環(huán)鉆垂直于關(guān)節(jié)軟骨面，在左下肢脛骨平臺(tái)內(nèi)、外側(cè)中央負(fù)重區(qū)截取軟骨-軟骨下骨復(fù)合體圓柱形組織塊，鉆取深度為10 mm，用于免疫組化檢測(cè)；后快速刮取關(guān)節(jié)軟骨面上的剩余軟骨，予生理鹽水沖洗后封存，以備試劑盒檢測(cè)。1）將軟骨組織制備成10%的勻漿液，離心后取上清，采用bicincininic acid法（BCA）法測(cè)定上清液中的蛋白濃度，采用試劑盒測(cè)定勻漿中NOS、MDA、SOD及GSH-Px活性，按照說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作。2）用比色法測(cè)定NOS及GSH-PX活力，用硫代巴比妥酸（TBA）法測(cè)定MDA活力，用羥胺法測(cè)定SOD活力。測(cè)定特定波長(zhǎng)下有色產(chǎn)物的吸光度值（OD值），可據(jù)相應(yīng)公式計(jì)算出以上物質(zhì)活力。3）用免疫組化法測(cè)定γ-H2AX表達(dá)情況。將經(jīng)多聚甲醛固定及脫鈣后的復(fù)合體新鮮組織制成切片以石蠟包埋，二甲苯及乙醇梯度脫水，胃蛋白酶消化液孵育修復(fù)抗原，磷酸緩沖鹽溶液多次沖洗，3%過(guò)氧化氫阻斷，血清封閉，一抗及二抗孵育，二氨基聯(lián)苯胺顯色，經(jīng)蘇木素復(fù)染，再次進(jìn)行梯度脫水及透明過(guò)程，后用中性樹(shù)膠封片。每張切片隨機(jī)取4個(gè)視野（200倍），用顯微成像系統(tǒng)拍片。圖片分析借助Image-ProPlus6.0（IPP）圖像分析系統(tǒng)，先測(cè)量每張圖片的累積光密度值（IOD），后以IOD/區(qū)域面積方式計(jì)算其平均光密度值（AOD），以4個(gè)視野的平均AOD值代表該切片的AOD值，以評(píng)估實(shí)驗(yàn)兔軟骨細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX的表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。每組樣本數(shù)據(jù)符合正態(tài)以（）表示，予單因素方差分析進(jìn)行組間比較，用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行方差齊性的兩兩比較，用Games-Howell檢驗(yàn)予方差不齊的兩兩比較。顯著性差異取P＜0.05，極顯著性差異取P＜0.01。

2 結(jié)果

2.1 各組兔膝軟骨細(xì)胞NOS及MDA活力比較 見(jiàn)表1。結(jié)果表明，模型組軟骨細(xì)胞NOS活力高于空白組（P＜0.01）；針刀組軟骨細(xì)胞NOS活力低于模型組（P＜0.05）；電針組與模型組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；針刀組與電針組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。模型組軟骨細(xì)胞MDA活力高于空白組（P＜0.01）；針刀組軟骨細(xì)胞 MDA活力低于模型組（P＜0.05）；電針組與模型組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；針刀組與電針組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組兔膝軟骨細(xì)胞NOS及MDA活力比較（±s）

表1 各組兔膝軟骨細(xì)胞NOS及MDA活力比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05。下同。

組別空白組模型組電針組針刀組n 7 7 7 7 NOS活力（U/mg）0.90±0.19 1.36±0.38*1.09±0.24 0.99±0.13△MDA活力（nmoL/mg）3.73±0.87 6.09±1.43*5.08±1.24 4.69±1.09△

2.2 各組兔膝軟骨細(xì)胞SOD及GSH-Px活性比較見(jiàn)表2。結(jié)果表明，模型組軟骨細(xì)胞SOD活力低于空白組（P＜0.01）；針刀組及電針組軟骨細(xì)胞SOD活力均高于模型組（P＜0.05）；針刀組與電針組相比，無(wú)明顯差異（P＞0.05）。模型組軟骨細(xì)胞GSH-Px活力低于空白組（P＜0.01）；針刀組及電針組軟骨細(xì)胞GSH-Px活力與模型組相比，均無(wú)明顯差異（P＞0.05）；針刀組與電針組相比，無(wú)明顯差異（P＞0.05）。

表2 各組兔膝軟骨細(xì)胞SOD及GSH-Px活性比較（U/mg，±s）

表2 各組兔膝軟骨細(xì)胞SOD及GSH-Px活性比較（U/mg，±s）

組別空白組模型組電針組針刀組n 7 7 7 7 SOD活力22.98±6.54 14.29±4.19*21.06±1.80△20.33±4.43△GSH-Px活力37.09±9.66 24.29±8.74*27.26±5.35 28.22±5.75

2.3 各組兔膝軟骨細(xì)胞γ-H2AX的表達(dá)水平比較見(jiàn)圖1。光鏡下觀察結(jié)果，空白組軟骨表面完整，軟骨細(xì)胞未見(jiàn)明顯γ-H2AX表達(dá)；模型組可見(jiàn)表層軟骨撕脫，軟骨細(xì)胞γ-H2AX表達(dá)較密；針刀組及電針組較模型組軟骨損傷程度輕，可見(jiàn)少量軟骨細(xì)胞γ-H2AX表達(dá)。各組γ-H2AX的AOD值比較見(jiàn)表3。其中，模型組軟骨細(xì)胞γ-H2AX表達(dá)強(qiáng)于空白組（P＜0.01）；針刀組及電針組軟骨細(xì)胞γ-H2AX表達(dá)均弱于模型組（P＜0.05）；針刀組與電針組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 各組兔膝軟骨細(xì)胞γ-H2AX表達(dá)（200倍）

表3 各組兔膝軟骨細(xì)胞γ-H2AX的表達(dá)水平比較（U/mg，±s）

表3 各組兔膝軟骨細(xì)胞γ-H2AX的表達(dá)水平比較（U/mg，±s）

組別空白組模型組電針組針刀組n 7 7 7 7 AOD 2.27±1.85 24.17±4.15*10.06±0.90△12.22±2.15△

3 討論

KOA在中醫(yī)屬學(xué)“痹證”范疇，受異常應(yīng)力影響的KOA往往存在膝關(guān)節(jié)內(nèi)部組織間解剖位置的改變，在中醫(yī)可以用“筋骨失衡”來(lái)概括這一變化，即以關(guān)節(jié)周?chē)∪狻㈨g帶等軟組織為代表的“筋”和以軟骨、骨為代表的“骨”之間產(chǎn)生位置的異常變動(dòng)及由此引發(fā)的一系列失衡狀態(tài)?！端貑?wèn)·調(diào)經(jīng)論》［11］載“病在筋，調(diào)之筋；病在骨，調(diào)之骨”，強(qiáng)調(diào)了筋骨疾病治療過(guò)程中對(duì)病位的看重。膝痹的筋骨失衡中，異常應(yīng)力多直接作用于膝關(guān)節(jié)周?chē)浗M織，故需選擇對(duì)軟組織病變針對(duì)性強(qiáng)的療法。針刀作為一種軟組織松解術(shù)，可通過(guò)對(duì)膝關(guān)節(jié)周?chē)摹敖睢边M(jìn)行切開(kāi)、牽拉及機(jī)械刺激，調(diào)整“筋”與“骨”的異常位置關(guān)系，故適合治療異常機(jī)械應(yīng)力誘發(fā)的KOA［12］。本課題組前期已從對(duì)膝周伸屈肌群生物力學(xué)的調(diào)整、肌肉萎縮的延緩及韌帶功能的恢復(fù)等方面證實(shí)針刀對(duì)膝周軟組織異常生物力學(xué)的調(diào)節(jié)作用［7-9］。

異常生物力學(xué)與軟骨細(xì)胞的氧化應(yīng)激關(guān)聯(lián)緊密。一方面，軟骨細(xì)胞是軟骨的唯一細(xì)胞，對(duì)機(jī)械負(fù)荷較敏感。研究表明，異常機(jī)械載荷作用于關(guān)節(jié)軟骨，經(jīng)細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞周基質(zhì)及Ⅵ型膠原、跨細(xì)胞膜表面受體等的傳輸和調(diào)節(jié)，可完成力學(xué)信號(hào)與電信號(hào)間的轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞線粒體扭曲變形，產(chǎn)生并釋放ROS［13-14］。過(guò)量的ROS可造成mtDNA的脂質(zhì)過(guò)氧化，加速軟骨退變［3］。另一方面，機(jī)械負(fù)荷可提高與超氧化物歧化酶2（SOD2）下調(diào)相關(guān)的細(xì)胞水平，引起SOD2下調(diào)，這一現(xiàn)象尤其體現(xiàn)于OA軟骨中，而SOD2是線粒體中唯一存在的SOD同種型［2，15］。

氧化應(yīng)激的本質(zhì)是氧化水平和抗氧化水平的失衡，故以ROS的異常增多及抗氧化物的持續(xù)下調(diào)為主要表現(xiàn)，并伴隨氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生［16］。NO是軟骨細(xì)胞中ROS的主要類(lèi)型，主要由NOS調(diào)節(jié)生成，在NOS催化下易與超氧化物（O2）結(jié)合形成過(guò)氧亞硝酸鹽，該物質(zhì)通過(guò)損害蛋白質(zhì)及mtDNA而破壞軟骨細(xì)胞［17］。MDA為脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，是氧化應(yīng)激過(guò)程中氧自由基攻擊生物膜上的不飽和脂肪酸形成的，其升高常被視為細(xì)胞損傷的重要標(biāo)志［18-20］。SOD及GSH-Px為細(xì)胞中存在的抗氧化酶，二者均可通過(guò)對(duì)氧化物及氧化產(chǎn)物加以轉(zhuǎn)化，維護(hù)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡［15，21］。其中SOD偏重于清除氧自由基，GSH-Px擅長(zhǎng)抑制脂質(zhì)過(guò)氧化［18-19］。

本研究表明，造模后各組兔軟骨細(xì)胞與正常兔相比，NOS及MDA活力均升高，SOD及GSH-Px活力均下降。證明了異常生物力學(xué)可造成KOA兔軟骨細(xì)胞的氧化應(yīng)激。軟骨細(xì)胞氧化應(yīng)激既是KOA發(fā)病和進(jìn)展的關(guān)鍵因素，又可能成為KOA治療的新靶點(diǎn)［17］。已有多項(xiàng)研究證實(shí)，中藥、艾灸等療法可通過(guò)其抗氧化作用治療KOA［22-24］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，針刀干預(yù)可降低KOA兔膝軟骨細(xì)胞的NOS及MDA活力，升高SOD活力。提示我們：針刀干預(yù)可能基于其對(duì)膝周軟組織異常生物力學(xué)的調(diào)整作用，進(jìn)而影響氧化物合成酶及抗氧化防御酶，發(fā)揮抗氧化效應(yīng)。

另外，氧化應(yīng)激可直接造成軟骨細(xì)胞內(nèi)DNA的損傷，主要表現(xiàn)為DNA雙鏈斷裂（DSBs），DSBs可使組蛋白H2AX的139位絲氨酸磷酸化為γ-H2AX，故γ-H2AX被視為DNA損傷的直接指標(biāo)［25-26］。本實(shí)驗(yàn)中，模型組兔膝軟骨細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX表達(dá)較空白組明顯增多，針刀組較模型組表達(dá)下降，提示針刀干預(yù)可能通過(guò)抗氧化作用減少軟骨細(xì)胞內(nèi)DNA的損傷，從而保護(hù)軟骨細(xì)胞，延緩KOA的病理進(jìn)展。

值得一提的是，機(jī)械力學(xué)等刺激可激活MAPKs，通過(guò)其內(nèi)部信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)軟骨細(xì)胞中的誘導(dǎo)性一氧化氮合酶（iNOS）和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)，且iNOS本身即可促進(jìn)MMPs增加而加速KOA中的軟骨降解［27-28］。有研究顯示，針刀干預(yù)可抑制MMP-3及MMP-13的基因和蛋白表達(dá)［29］。故本實(shí)驗(yàn)中針刀對(duì)KOA兔軟骨細(xì)胞NOS活力的下調(diào)作用，可能同樣是通過(guò)抑制MAPKs來(lái)實(shí)現(xiàn)，有待進(jìn)一步研究。針刀及電針干預(yù)對(duì)軟骨細(xì)胞GSH-Px活力的影響雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但有上升趨勢(shì)，考慮可能與治療時(shí)間較短有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)不足之處還在于樣本量較少，且缺乏干預(yù)過(guò)程中更多時(shí)間點(diǎn)上的指標(biāo)檢測(cè)，將在之后研究中進(jìn)一步完善。