復(fù)方腸泰方通過(guò)抑制Akt/mTOR/p70S6K通路誘導(dǎo)CT26細(xì)胞自噬的研究

劉芮奇，李靈常，崔莉，孫娥?

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210028；2.江蘇省中醫(yī)藥研究院，江蘇 南京 210028）

結(jié)腸癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤，近年來(lái)，我國(guó)結(jié)腸癌的患病率和病死率逐年增加。最新中國(guó)癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告顯示，結(jié)腸癌患病率在惡性腫瘤中位居第三，病死率在惡性腫瘤中位居第五［1］，其中新發(fā)病例37.6萬(wàn)例，死亡病例19.1 萬(wàn)例，已經(jīng)嚴(yán)重威脅到人們的生命健康。結(jié)腸癌的早期癥狀不明顯，發(fā)現(xiàn)時(shí)多是中晚期［2］，因此，深入研究結(jié)腸癌的防治具有重要意義。目前臨床上常用于治療結(jié)腸癌的化療藥物有奧沙利鉑、氟尿嘧啶、伊立替康和卡培他濱等，但是較強(qiáng)的胃腸道副作用和神經(jīng)毒性嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。

中藥治療結(jié)腸癌不但能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，抑制誘發(fā)結(jié)腸癌基因表達(dá)，抑制轉(zhuǎn)移瘤生長(zhǎng)，還能提高患者免疫力，改善結(jié)腸癌術(shù)后不良反應(yīng)［3］。復(fù)方腸泰方是江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院霍介格教授的經(jīng)驗(yàn)方，由人參、黃芪、藤梨根、八月札、苦參、薏苡仁組成，長(zhǎng)期應(yīng)用于臨床治療結(jié)腸癌。前期研究發(fā)現(xiàn)，與單純FOLFOX4方案化療相比，復(fù)方腸泰方聯(lián)合FOLFOX4可減輕化療引發(fā)的毒性，從而提高治療效果［4-5］。復(fù)方腸泰方還具有抗小鼠結(jié)腸癌血管生成作用［6］。本研究進(jìn)一步探討復(fù)方腸泰方是否可通過(guò)誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞產(chǎn)生自噬，實(shí)現(xiàn)促癌細(xì)胞死亡的作用。

自噬又被稱作Ⅱ型程序性死亡，在多種癌癥中發(fā)揮作用，通過(guò)促進(jìn)致癌分子的降解，最終阻止癌癥的發(fā)展［7］。參與自噬調(diào)節(jié)的主要通路包括Akt/mTOR/p70S6K 信號(hào)通路和Ras/Raf－1/（MEK1/2）/（ERK1/2）通路，兩者都與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)［8］。本文將研究復(fù)方腸泰方對(duì)CT26細(xì)胞增殖和自噬的影響，并探討其產(chǎn)生自噬是否與Akt/mTOR/p70S6K 信號(hào)通路有關(guān)，為復(fù)方腸泰方的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 細(xì)胞株

小鼠結(jié)腸癌CT26細(xì)胞，購(gòu)自美國(guó)模式菌種收集中心（ATCC），保存于江蘇省中醫(yī)藥研究院中藥制劑研究室。用含10%胎牛血清的RPMI－1640 不完全培養(yǎng)液于37 ℃、5%CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑

RPMI－1640 不完全培養(yǎng)液（批號(hào)：20210114）、胰蛋白酶（批號(hào)：20200731）、MTT 細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（20210705）、細(xì)胞自噬染色檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20210312），均購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；四季青無(wú)噬菌體低內(nèi)毒素優(yōu)級(jí)胎牛血清（南京基遠(yuǎn)生物科技有限公司，批號(hào)：21020702）；雷帕霉素（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：092220201231）；人參、黃芪、藤梨根、八月札、苦參、薏苡仁均由江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥房提供，經(jīng)江蘇省中醫(yī)院黃然主管中藥師鑒定，均符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)；抗體LC3（批號(hào)：BS－8878R）、Beclin－1（批號(hào)：BSM－33323M）、Akt1+2+3（批號(hào)：BS－6951R）、mTOR（批號(hào)：BS－1992R）、p70S6K（批號(hào)：BS－1426R）、p－Akt（批號(hào)：BSM－33281M），均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；pmTOR（武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)：BM4840）；p－p70S6K（美國(guó)CST公司，批號(hào)：9234T）。

1.3 主要儀器

電子天平（瑞安市英衡電器有限公司，YHC1002）；調(diào)溫電熱套（北京市光明醫(yī)療儀器有限公司，DZTW）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠，RE－5203）；真空滅菌鍋（廣州市深華生物技術(shù)有限公司，GI80DP）；數(shù)顯恒溫?cái)嚢柩h(huán)水箱（常州國(guó)華電器有限公司，HH－60）；生物安全柜（蘇州賽默飛世爾儀器有限公司，1300 系列Ⅱ級(jí)）；臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠，TDL－40B）；倒置顯微鏡（重慶光電儀器有限公司，XDS－1B）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Forma 公司，HERAcell150）；-80 ℃冰箱（Thermo Forma 公司，-86 ℃ULT Freezer）；熒光倒置顯微鏡（南京奧力科學(xué)儀器有限公司，Olympus Ⅸ73）；透射電鏡（日本電子株式會(huì)社，JEM－1400）；酶標(biāo)儀（上海美谷分子儀器有限公司，Spectra max 190）。

2 方法

2.1 復(fù)方腸泰方的制備

復(fù)方腸泰方處方：人參9 g，黃芪15 g，藤梨根15 g，八月札9 g，苦參6 g，薏苡仁20 g。用10 倍體積水浸泡藥材0.5 h，大火煮沸后小火煎煮1 h，藥液趁熱經(jīng)100目篩網(wǎng)過(guò)濾，濾渣再加8 倍體積水煎煮1 h，過(guò)濾，放冷，合并兩次濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至生藥量為2.5 g/mL。用培養(yǎng)基稀釋復(fù)方腸泰方溶液，超聲30 min，10 000 r/min 離心10 min，上清液用0.22 μm 無(wú)菌濾膜過(guò)濾除菌。

2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率

在96 孔板中，設(shè)置空白對(duì)照組以及不同濃度復(fù)方腸泰組（10、20、40、70、80、90 mg/mL），每組6 個(gè)復(fù)孔。將CT26 細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的數(shù)量接種于96 孔板中，置于37 ℃、5%CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%密度，吸出原培養(yǎng)基，加入100 μL 不同濃度藥物。培養(yǎng)24 h 后每孔加入50 μL MTT 溶液，在37 ℃下孵育，4 h 后MTT 還原為甲臜。吸出上清液保留底部藍(lán)紫色結(jié)晶，每孔加入150 μL DMSO，平板搖床搖勻10 min 使甲臜充分溶解。酶標(biāo)儀在490 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔吸光度。

2.3 透射電鏡觀察細(xì)胞中自噬體

CT26 細(xì)胞以2×105個(gè)/孔的數(shù)量接種于6 孔板中，細(xì)胞長(zhǎng)到80%匯合度后，吸出原培養(yǎng)基，加入80 mg/mL復(fù)方腸泰方溶液孵育24 h。培養(yǎng)基終止消化，2 000 r/min離心2 min，棄細(xì)胞上清。PBS洗滌3次后轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP 管中，離心去除PBS。輕輕加入1 mL 2.5%戊二醛，室溫固定至少2 h，然后進(jìn)行包埋固化切片，3%醋酸鈾－枸櫞酸鉛雙染色，透射電鏡觀察細(xì)胞中自噬體并拍照記錄。

2.4 MDC法檢測(cè)細(xì)胞中自噬體

用MDC 法對(duì)自噬體進(jìn)行染色。24 孔板中放入與其等體積的細(xì)胞爬片，CT26 細(xì)胞以5 × 104個(gè)/孔的數(shù)量接種于24 孔板中，細(xì)胞長(zhǎng)到80%匯合度后，吸出原培養(yǎng)基。設(shè)置空白對(duì)照組以及低、中、高濃度（20、40、80 mg/mL）復(fù)方腸泰組，干預(yù)細(xì)胞24 h。棄原培養(yǎng)液，加入300 μL 1 × Wash bufffer 洗2 次，然后每孔加入100 μL MDC 工作液，室溫避光染色30 min 后棄染液，每孔加入300 μL 1 × Wash bufffer 洗3 次。取出爬片，

有細(xì)胞一面滴20 μL 抗熒光淬滅劑，蓋玻片封片，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞被染色情況并拍照記錄。

2.5 自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素

設(shè)置空白對(duì)照組、80 mg/mL 復(fù)方腸泰組和復(fù)方腸泰+雷帕霉素組。將CT26 細(xì)胞以5 × 103個(gè)/孔的數(shù)量接種于96 孔板中，每組6 個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%匯合度，復(fù)方腸泰+ 雷帕霉素組用自噬誘導(dǎo)劑50 nmol/L 雷帕霉素與80 mg/mL 復(fù)方腸泰方溶液共同干預(yù)細(xì)胞，孵育24 h后，用熒光倒置顯微鏡拍攝不同組的細(xì)胞狀態(tài)。然后使用MTT 法評(píng)估CT26 細(xì)胞的存活率。

2.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)

CT26 細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的數(shù)量接種于6 孔板中，細(xì)胞長(zhǎng)到80%匯合度后，吸出原培養(yǎng)基，分別加入低、中、高濃度（20、40、80 mg/mL）復(fù)方腸泰方溶液孵育。24 h 后用胰酶消化細(xì)胞，培養(yǎng)基終止消化，2 000 r/min離心2 min，PBS洗滌3次，去上清得細(xì)胞沉淀。加入沉淀體積5 倍的裂解液，將沉淀吹散，4 ℃裂解1 h，超聲破碎儀破碎，10 000 r/min 離心10 min，收集上清液。BCA 法用于確定蛋白質(zhì)量濃度，將上樣液于100 ℃水中煮沸5 min 使蛋白質(zhì)變性，冰上驟冷，SDS－PAGE 電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用5%脫脂奶粉將膜封閉2 h，封閉后，與一抗在4 ℃下孵育過(guò)夜，回收一抗，二抗室溫?fù)u床振蕩反應(yīng)2 h。ECL 發(fā)光顯色。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad Prism 6 統(tǒng)計(jì)軟件處理。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析（One－way ANOVA），兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 CT26細(xì)胞增殖情況比較

不同濃度復(fù)方腸泰方溶液（10、20、40、70、80、90 mg/mL）處理CT26細(xì)胞24 h后，MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，10、20、40 mg/mL 濃度的復(fù)方腸泰方對(duì)細(xì)胞增殖影響較小。當(dāng)復(fù)方腸泰方濃度增至80 mg/mL 時(shí)，細(xì)胞存活率為50%左右，且隨著濃度的增加，增殖抑制效果增強(qiáng)。見(jiàn)表1。為確保復(fù)方腸泰方對(duì)CT26 細(xì)胞有增殖抑制作用且能進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)，故選用低、中、高劑量的復(fù)方腸泰方溶液（20、40、80 mg/mL）進(jìn)行后續(xù)研究。

表1 各組對(duì)CT26細(xì)胞增殖的抑制作用比較（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，*P ＜0.05，***P ＜0.001，****P ＜0.000 1。

組別空白對(duì)照組復(fù)方腸泰組濃度（mg/mL）0 10 20 40 70 80 90存活率（%）100.00 93.62±4.12 95.53±6.71 96.30±5.08 72.53±3.98*47.04±2.37***29.78±0.65****

3.2 CT26細(xì)胞產(chǎn)生自噬情況比較

透射電鏡結(jié)果見(jiàn)圖1，與空白對(duì)照組相比，80 mg/mL 濃度的復(fù)方腸泰方溶液干預(yù)細(xì)胞后可以看到類似自噬溶酶體結(jié)構(gòu)，放大后能看到自噬體中被降解的細(xì)胞器。MDC 使自噬體在熒光顯微鏡下發(fā)出藍(lán)綠色熒光，結(jié)果見(jiàn)圖2。低、中、高劑量復(fù)方腸泰方溶液干預(yù)CT26細(xì)胞后，細(xì)胞熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，50 nmol/L雷帕霉素組細(xì)胞熒光強(qiáng)度最高。自噬體只是檢測(cè)自噬的單一指標(biāo)，為進(jìn)一步驗(yàn)證復(fù)方腸泰方是否誘導(dǎo)CT26細(xì)胞產(chǎn)生自噬，使用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin－1 蛋白表達(dá)水平，結(jié)果見(jiàn)圖3、表2。與空白對(duì)照組相比，中、高劑量復(fù)方腸泰方溶液干預(yù)CT26 細(xì)胞后，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)升高。Beclin－1 蛋白表達(dá)隨復(fù)方腸泰方給藥濃度增加而增加（P＜0.05），說(shuō)明復(fù)方腸泰方可以誘導(dǎo)CT26產(chǎn)生自噬。

表2 CT26細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的比較（±s）

表2 CT26細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的比較（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

組別空白對(duì)照組復(fù)方腸泰組濃度（mg/mL）0 20 40 80 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ0.82±0.04 0.69±0.06 0.90±0.07 0.88±0.03 Beclin－1/GAPDH 0.40±0.08 0.74±0.10*0.86±0.13**1.01±0.18**

圖1 透射電鏡觀察CT26細(xì)胞內(nèi)自噬溶酶體

圖2 MDC染色法檢測(cè)CT26細(xì)胞自噬體（×200）

圖3 不同濃度復(fù)方腸泰方對(duì)CT26細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3.3 自噬誘導(dǎo)CT26細(xì)胞存活率情況比較

雷帕霉素可通過(guò)抑制mTOR通路，誘導(dǎo)和促進(jìn)細(xì)胞自噬的發(fā)生。用自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素干預(yù)細(xì)胞，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生存狀況，結(jié)果見(jiàn)圖4?？瞻讓?duì)照組細(xì)胞伸展良好，邊界清晰；80 mg/mL濃度復(fù)方腸泰干預(yù)后，貼壁細(xì)胞數(shù)減少，細(xì)胞少量皺縮，少數(shù)細(xì)胞從伸展?fàn)顟B(tài)變?yōu)閳A形狀態(tài)；80 mg/mL濃度復(fù)方腸泰+50 nmol/L濃度雷帕霉素干預(yù)后，細(xì)胞皺縮嚴(yán)重，貼壁細(xì)胞數(shù)少。MTT法檢測(cè)CT26細(xì)胞存活率，結(jié)果與空白對(duì)照組相比，復(fù)方腸泰方抑制了CT26細(xì)胞增殖，復(fù)方腸泰+雷帕霉素使CT26細(xì)胞的病死率增加。見(jiàn)表3。

圖4 自噬誘導(dǎo)劑對(duì)復(fù)方腸泰方作用的CT26細(xì)胞形態(tài)的影響（×100）

表3 自噬誘導(dǎo)CT26細(xì)胞存活率的比較（±s）

表3 自噬誘導(dǎo)CT26細(xì)胞存活率的比較（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，**P ＜0.01，***P ＜0.001。

組別空白對(duì)照組復(fù)方腸泰組復(fù)方腸泰+雷帕霉素組濃度（mg/mL）0 80 80存活率（%）100.00 57.30±5.22**26.31±2.18***

3.4 對(duì)Akt/mTOR/p70S6K通路影響的比較

采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)Akt/mTOR/p70S6K通路的相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，p－Akt、p－mTOR和p－p70S6K與自噬呈負(fù)相關(guān)。與空白對(duì)照組相比，低、中、高劑量復(fù)方腸泰干預(yù)CT26細(xì)胞后，p－Akt/Akt、p－mTOR/mTOR和p－p70S6K/p70S6K的蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。結(jié)果表明復(fù)方腸泰方可能通過(guò)抑制Akt/mTOR/p70S6K通路，誘導(dǎo)CT26細(xì)胞產(chǎn)生自噬。見(jiàn)表4、圖5。

圖5 不同濃度復(fù)方腸泰方對(duì)CT26細(xì)胞Akt/mTOR/p70S6K通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表4 各組對(duì)CT26細(xì)胞Akt/mTOR/p70S6K通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s）

表4 各組對(duì)CT26細(xì)胞Akt/mTOR/p70S6K通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

組別空白對(duì)照組復(fù)方腸泰組濃度（mg/mL）0 20 40 80 p－Akt/Akt 0.99±0.13 0.75±0.07*0.38±0.03**0.17±0.01**p－mTOR/mTOR 0.77±0.07 0.80±0.02 0.59±0.15 0.24±0.09*p－p70S6K/p70S6K 1.33±0.16 0.76±0.08*0.55±0.06*0.26±0.02**

4 討論

結(jié)腸癌屬“腸覃”“腸癖”“臟毒”等范疇［9］。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，結(jié)腸癌的形成是由于人體正氣不足，外邪侵襲脾胃，導(dǎo)致脾失健運(yùn)，氣血津液運(yùn)行失常，水濕停聚，積久形成瘀、毒、濕熱。故治療結(jié)直腸癌應(yīng)以補(bǔ)益氣血、驅(qū)邪外出為原則，以健脾益氣、化瘀解毒為治療方法［10］。復(fù)方腸泰方按照健脾益氣、化瘀解毒的治療原則，由人參、黃芪、藤梨根、八月札、苦參、薏苡仁組成。方中人參補(bǔ)脾益肺、扶正培本；薏苡仁健脾寧心、利水滲濕；黃芪補(bǔ)氣、益衛(wèi)固表；苦參瀉火解毒；藤梨根清熱解毒、祛風(fēng)除濕；八月札疏肝理氣、活血止痛。全方配伍，共奏補(bǔ)益正氣、健脾利濕、清熱解毒、活血化瘀之功。一方面直接補(bǔ)益正氣提高人體免疫力，另一方面驅(qū)除損害人體正氣的病邪［11］。

復(fù)方腸泰方的抗癌作用可能是通過(guò)抑制癌細(xì)胞的增殖實(shí)現(xiàn)的。實(shí)驗(yàn)表明，10 ～60 mg/mL復(fù)方腸泰方對(duì)細(xì)胞的增殖作用影響較小，細(xì)胞存活率在90%左右。但當(dāng)復(fù)方腸泰方濃度增至70 mg/mL 時(shí)，細(xì)胞存活率降至70%，且隨著濃度的增加，增殖抑制作用增強(qiáng)。

本研究進(jìn)一步探索了復(fù)方腸泰方抑制癌細(xì)胞增殖是否與自噬相關(guān)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，復(fù)方腸泰方干預(yù)CT26細(xì)胞后，可觀察到自噬小體和自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的增加。僅中、高劑量的復(fù)方腸泰方增加了CT26 細(xì)胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)水平，提示復(fù)方腸泰方的濃度與自噬的發(fā)生密切相關(guān)，今后仍需在后續(xù)研究中擴(kuò)大復(fù)方腸泰方濃度范圍來(lái)繼續(xù)探索其誘導(dǎo)自噬的規(guī)律。自噬已被確定為腫瘤細(xì)胞存活和抵抗的潛在機(jī)制，一方面可以阻止致癌蛋白如p62 以及受損蛋白和細(xì)胞器的積累起到抑制腫瘤作用［12］，另一方面，在晚期腫瘤或癌癥治療期間，自噬可以作為細(xì)胞防御機(jī)制發(fā)揮作用，使腫瘤細(xì)胞能夠在缺氧和代謝應(yīng)激等惡劣條件下存活［13］。這說(shuō)明自噬對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用具有雙重性，自噬既可以誘導(dǎo)細(xì)胞死亡又可以在缺氧等惡劣環(huán)境下促使腫瘤細(xì)胞存活。然而復(fù)方腸泰方誘導(dǎo)CT26細(xì)胞產(chǎn)生的自噬與腫瘤細(xì)胞死亡的關(guān)系尚不明確，因此筆者采用自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素干預(yù)CT26細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)復(fù)方腸泰+雷帕霉素組細(xì)胞存活率為26%，而復(fù)方腸泰組細(xì)胞存活率為57%，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示誘導(dǎo)產(chǎn)生的自噬促進(jìn)了CT26細(xì)胞的死亡。綜上，復(fù)方腸泰方可通過(guò)誘導(dǎo)CT26細(xì)胞產(chǎn)生自噬，促使細(xì)胞死亡，從而達(dá)到抗結(jié)腸癌作用。

自噬相關(guān)通路可調(diào)控細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、代謝和運(yùn)動(dòng)。PI3K 激酶是最上游的分子，作為自噬信號(hào)級(jí)聯(lián)的觸發(fā)器，磷酸化Akt 能抑制TSC1/2 導(dǎo)致mTORC1 激活［14］。mTORC1通過(guò)磷酸化使形成的自噬調(diào)節(jié)復(fù)合物失活，從而抑制自噬小體的發(fā)生。p70S6K 靶點(diǎn)作為mTOR 的下游，可以被mTOR 通路激活。因此Akt/mTOR/p70S6K 通路與自噬的發(fā)生密切相關(guān)，通過(guò)抑制此通路調(diào)節(jié)自噬可為多種疾病的治療提供策略［15］。研究表明，小檗堿可以通過(guò)抑制mAPK/mTOR/p70S6K 信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞抑制性自噬，從而抑制人胃癌細(xì)胞的體內(nèi)、外生長(zhǎng)［16］。紅景天苷通過(guò)抑制PI3K/Akt/mTOR通路誘導(dǎo)人大腸癌細(xì)胞凋亡和自噬［17］。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，復(fù)方腸泰方干預(yù)CT26細(xì)胞后，Akt、mTOR 和p70S6K 蛋白的磷酸化水平降低。說(shuō)明復(fù)方腸泰方可能通過(guò)抑制Akt/mTOR/p70S6K 通路誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生自噬。

綜上所述，復(fù)方腸泰方可通過(guò)抑制Akt/mTOR/p70S6K 通路誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞自噬，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞增殖，發(fā)揮抗結(jié)腸癌作用，本研究可為臨床開(kāi)發(fā)治療結(jié)腸癌確有療效的復(fù)方制劑奠定基礎(chǔ)。