環(huán)狀RNA在骨質(zhì)疏松癥中的研究進(jìn)展

曹年平 陳波波 黃崇峻 徐瑩 田野*

1. 中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院骨科，遼寧 沈陽 110004 2. 中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院麻醉科，遼寧 沈陽 110004

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)好發(fā)于老年人、絕經(jīng)后女性和糖皮質(zhì)激素用藥者，因其致骨折風(fēng)險(xiǎn)增高，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量。然而目前仍沒有特效治療能逆轉(zhuǎn)OP骨質(zhì)丟失，亟需研究OP發(fā)生機(jī)制并開發(fā)更有效的治療方法。最新研究發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA有望成為OP的診斷標(biāo)志物和治療新途徑。環(huán)狀RNA(circRNAs)是由反向剪接形成的無5’末端帽子和3’末端poly(A)尾的共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的非編碼RNA[1]。已知circRNAs可作為miRNAs和蛋白質(zhì)的海綿，抑制miRNAs和蛋白質(zhì)功能；circRNAs還可以調(diào)控轉(zhuǎn)錄以及部分翻譯為蛋白質(zhì)或作為蛋白質(zhì)支架發(fā)揮作用[2]。近年來大量研究表明circRNAs在心血管系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和骨科疾病[3-7]等中起重要作用。本文將對(duì)circRNAs在多種類型OP中發(fā)揮的調(diào)控作用和診斷價(jià)值進(jìn)行綜述。

1 CircRNAs調(diào)控絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是由于絕經(jīng)后女性雌激素水平下降，成骨-破骨活動(dòng)偏向于骨吸收而形成的骨代謝性疾病。CircRNAs在PMOP中存在差異表達(dá)。外周血單核細(xì)胞RNA測(cè)序結(jié)果顯示，PMOP患者有73個(gè)circRNAs顯著上調(diào)和300個(gè)circRNAs顯著下調(diào)[8]。一些circRNAs可調(diào)節(jié)BMP-2表達(dá)。BMP-2屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族蛋白，可誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨分化。PMOP患者中circ_0016624和circ_0048211均顯著降低，兩者過表達(dá)時(shí)均使BMP-2表達(dá)升高。經(jīng)靶點(diǎn)預(yù)測(cè)和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)得出circ_0016624海綿抑制miR-98以及circ_0048211海綿抑制miRNA-93-5p，從而提高了BMP-2表達(dá)，并促進(jìn)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化[9-10]。由此可見，促BMP-2表達(dá)的circRNAs生成減少是PMOP發(fā)生機(jī)制之一。此外，circ_0001795[11]在PMOP患者骨組織中表達(dá)降低。骨髓基質(zhì)細(xì)胞過表達(dá)circ_0001795后破骨分化受抑制，其機(jī)制是circ_0001795抑制miR-378作用而提高BMP-2表達(dá)，這可能對(duì)抑制PMOP進(jìn)展具有重要作用。

外泌體是細(xì)胞分泌的含有信息交流物質(zhì)的小囊泡。PMOP患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)分離的外泌體行微陣列測(cè)序，發(fā)現(xiàn)237個(gè)上調(diào)和279個(gè)下調(diào)的 circRNAs[12]。Zhi等[13]發(fā)現(xiàn)PMOP患者血清分離的外泌體中circ_0006859顯著升高，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)circ_0006859通過海綿miR-431-5p上調(diào)ROCK1表達(dá)來抑制骨生成并促進(jìn)脂肪生成。因此，circRNAs可能以外泌體形式作用于成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，對(duì)骨微環(huán)境發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

2 CircRNAs調(diào)控老年性骨質(zhì)疏松癥

老年性骨質(zhì)疏松癥(senile osteoporosis，SOP)是與衰老有關(guān)的原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞老化和成骨能力下降是其重要的發(fā)病機(jī)制[14]。最新研究[15-16]表示SOP與circRNAs的表達(dá)調(diào)控有關(guān)。對(duì)老年男性骨質(zhì)疏松性椎體壓縮骨折患者的外周血RNA測(cè)序，發(fā)現(xiàn)884個(gè)差異表達(dá)的 circRNAs(554個(gè)上調(diào)，330個(gè)下調(diào))[15]。KEGG分析顯示差異表達(dá)的circRNAs功能主要與“RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、MAPK信號(hào)通路、TP53轉(zhuǎn)錄調(diào)控”等通路有關(guān)。另一項(xiàng)研究[16]對(duì)老年男性骨質(zhì)疏松患者的BMSCs行RNA測(cè)序，篩選出circ_0006215顯著降低。過表達(dá)circ_0006215能促進(jìn)BMSCs成骨分化，其機(jī)制是circ_0006215作為miR-942-5p海綿而促進(jìn)成骨因子RUNX2和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF表達(dá)。并且過表達(dá)circ_0006215的BMSCs培養(yǎng)上清液可促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管生成。因此，circ_0006215具有促進(jìn)骨生成和血管生成的潛力，其表達(dá)降低可能是SOP形成的重要原因。

3 CircRNAs調(diào)控激素性骨質(zhì)疏松癥

糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)作為抗炎和免疫抑制劑被廣泛應(yīng)用，但長(zhǎng)期GC治療可導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥(glucocorticoid-induced osteoporosis，GIO)。研究[17]表明GC可抑制成骨細(xì)胞生成，促進(jìn)骨細(xì)胞凋亡，同時(shí)延長(zhǎng)破骨細(xì)胞的壽命。有報(bào)道[18]miRNAs參與GIO形成，如Let-7f-5p可調(diào)節(jié)TGFBR1表達(dá)，改善GIO骨量丟失，而circRNAs具有miRNAs海綿等功能也能調(diào)控GIO的發(fā)生發(fā)展。

Wang等[19]發(fā)現(xiàn)circRNAs在GIO中具有促進(jìn)骨生成的作用。Wang等在細(xì)胞和動(dòng)物模型中過表達(dá)circ_0006393能上調(diào)成骨基因的表達(dá)和提高GIO模型小鼠的骨密度。深入研究發(fā)現(xiàn)，circ_0006393海綿結(jié)合miR-145-5p而上調(diào)FOXO1表達(dá)。FOXO1是抑制成骨細(xì)胞氧化損傷的關(guān)鍵蛋白，具有促進(jìn)成骨的作用[20]。地塞米松抑制成骨細(xì)胞生長(zhǎng)并促進(jìn)其凋亡，如何解決這個(gè)問題是治療GIO的關(guān)鍵。研究[21]發(fā)現(xiàn)，敲除circ_0001275后可改善地塞米松對(duì)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的不利影響，其可能機(jī)制是敲除circ_0001275后，miR-377/CDKN1B 軸被激活從而逆轉(zhuǎn)GC對(duì)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制。

許多研究[18,22]表示miRNAs在GIO中具有調(diào)控作用。CircRNAs作為miRNAs調(diào)節(jié)分子，能否通過廣泛影響miRNAs作用而調(diào)控GIO發(fā)生發(fā)展，有待進(jìn)一步研究。總之，以上三種類型OP中均有circRNAs表達(dá)改變并通過miRNAs海綿發(fā)揮調(diào)控作用，見表1。

表1 3種類型骨質(zhì)疏松癥中circRNAs的調(diào)控作用及機(jī)制Table 1 The regulatory role of circRNAs in three types of osteoporosis

4 CircRNAs對(duì)骨內(nèi)細(xì)胞的調(diào)控作用

4.1 CircRNAs對(duì)干細(xì)胞的調(diào)控

多種干細(xì)胞具有成骨分化潛能，包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)、脂肪干細(xì)胞(ASCs)和牙髓干細(xì)胞(DPSCs)等。研究表明circRNAs能促進(jìn)干細(xì)胞成骨分化。Yang等[23]發(fā)現(xiàn)circ-VANGL1能海綿抑制miR-217而提高RUNX2表達(dá)。RUNX2是成骨分化轉(zhuǎn)錄因子，已證實(shí)在ASCs等干細(xì)胞成骨分化中起重要作用[24]?；赗UNX2改善骨質(zhì)疏松癥作用，研究其上游機(jī)制發(fā)現(xiàn)circRUNX2和circ_0011269也能促進(jìn)RUNX2表達(dá)[25-26]，并通過circRUNX2/miR-203/RUNX2和circ_0011269/miR-122/RUNX2通路促進(jìn)BMSCs成骨分化。

現(xiàn)有研究大多關(guān)于circRNAs在BMSCs中的作用，但circRNAs也調(diào)控其他干細(xì)胞。Ji等[27]在牙髓干細(xì)胞(DPSCs)中發(fā)現(xiàn)circ_0026827能海綿結(jié)合miR-188-3p，上調(diào)自噬促進(jìn)因子Beclin1和成骨促進(jìn)因子RUNX1表達(dá)，促進(jìn)DPSCs成骨分化。Shen等[28]發(fā)現(xiàn)circFOXP1在OP患者中顯著下調(diào)，并且circFOXP1可以作用于miR-33a-5p而上調(diào)FOXP1表達(dá)，促進(jìn)ASCs成骨分化，同時(shí)在老鼠模型中過表達(dá)circFOXP1能促進(jìn)ASCs異位成骨，表明circFOXP1具有促進(jìn)骨生成和預(yù)防骨質(zhì)疏松的潛在作用。

CircRNAs對(duì)干細(xì)胞成骨分化有積極作用，然而circRNAs也可能促進(jìn)骨質(zhì)疏松。Lin等[29]發(fā)現(xiàn)去卵巢小鼠模型中circ-SLC8A1高表達(dá)并通過海綿結(jié)合miR-516b-5p，使A激酶錨定蛋白2上調(diào)，從而促進(jìn)骨質(zhì)疏松癥進(jìn)展。研究[30]表示低強(qiáng)度激光照射可提高BMSCs增殖能力，因其下調(diào)circ_0001052，升高miR-124-3p水平，激活促增殖的Wnt/β-catenin通路。還有褪黑素能降低circ_0003865表達(dá)而促進(jìn)BMSCs成骨分化[31]。因此，一些circRNAs可能對(duì)BMSC增殖和成骨分化存在負(fù)性作用。

4.2 CircRNAs對(duì)成骨細(xì)胞的調(diào)控

CircRNAs能調(diào)節(jié)前成骨細(xì)胞增殖和凋亡。研究[32]發(fā)現(xiàn)過表達(dá)circRNA AFF4促進(jìn)前成骨細(xì)胞MC3T3-E1增殖和抑制其凋亡。其中circRNA AFF4通過海綿結(jié)合miR-7223-5P使PIK3R1升高而促進(jìn)MC3T3-E1增殖。還有研究[33]從鼠BMSCs中分離出含有circ-Rtn4的外泌體(Rtn4-Exos)與MC3T3-E1共培養(yǎng)后可減輕TNF-α對(duì)MC3T3-E1的細(xì)胞毒和細(xì)胞凋亡，提示Rtn4-Exos是成骨細(xì)胞的保護(hù)因子。除了影響前成骨細(xì)胞增殖和凋亡，circRNAs還能調(diào)節(jié)前成骨細(xì)胞的成骨分化和骨礦化。Circ_003795[34]在MC3T3-E1和MDPC-23細(xì)胞(小鼠成牙本質(zhì)細(xì)胞)成骨分化中顯著升高。研究得出circ_003795可以作用于miR-1249-5p，并上調(diào)COL15A1表達(dá)，促進(jìn)MC3T3-E1和MDPC-23細(xì)胞成骨分化及礦化。

4.3 CircRNAs對(duì)破骨細(xì)胞的調(diào)控

骨髓單核/巨噬細(xì)胞(bone marrow monocyte/macrophage cells，BMMCs)是破骨細(xì)胞的前體，破骨細(xì)胞大量生成使骨吸收增加，引起骨質(zhì)疏松。研究表明circRNAs能促進(jìn)破骨細(xì)胞生成。Chen等[35]在誘導(dǎo)BMMCs破骨分化時(shí)發(fā)現(xiàn)circRNA_28313顯著上調(diào)，并且circRNA_28313可以解除miR-195a對(duì)促破骨分化進(jìn)基因CSF1的抑制，從而促進(jìn)破骨細(xì)胞分化。Miao等[36]發(fā)現(xiàn)成熟破骨細(xì)胞中circRNA_009934升高明顯，過表達(dá)circRNA_009934促進(jìn)BMMCs增殖和破骨分化，而抑制circRNA_009934時(shí)，破骨細(xì)胞生成減少，因?yàn)閏ircRNA_009934可海綿結(jié)合miR-5107，上調(diào)促破骨分化基因TRAF6表達(dá)，從而促進(jìn)BMMCs增殖和破骨細(xì)胞生成。

腫瘤壞死因子-α(TNF-α)能促進(jìn)破骨分化并抑制成骨分化[37]。研究發(fā)現(xiàn)TNF-α誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化時(shí)，circHmbox1表達(dá)降低，并通過影響下游miR-1247-5p和Bcl6 表達(dá)促進(jìn)破骨細(xì)胞生成。TNF-α促進(jìn)破骨細(xì)胞分泌含circHmbox1的外泌體，此外泌體與前成骨細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，可抑制成骨分化。因此，circHmbox1是TNF-α誘導(dǎo)破骨分化和抑制成骨分化的重要調(diào)節(jié)因子[38]。以上circRNAs在骨內(nèi)細(xì)胞中的調(diào)控作用和海綿機(jī)制靶點(diǎn)見表2。

表2 骨內(nèi)細(xì)胞中circRNAs的調(diào)控作用及機(jī)制Table 2 The regulatory role of circRNAs in bone cells

5 CircRNAs在骨質(zhì)疏松癥中的通路研究

成骨分化和礦化是骨生成的關(guān)鍵途徑，許多信號(hào)通路參與其中，包括Notch[39]、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)[40]、Wnt/β-catenin[41]等信號(hào)通路。研究表明許多circRNAs能調(diào)節(jié)信號(hào)通路基因促進(jìn)成骨分化。Huang等[41]發(fā)現(xiàn)BMSCs和MC3T3-E1成骨分化過程中YAP1升高。有報(bào)道[42]YAP1能激活Wnt/β-catenin通路促進(jìn)成骨。探究YAP1上游機(jī)制發(fā)現(xiàn)，circ_0024097可解除miR-376b-3p對(duì)YAP1的抑制，促進(jìn)YAP1表達(dá)[41]。因此circ_0024097通過Wnt/β-catenin通路促進(jìn)BMSCs和MC3T3-E1的成骨分化。此外，研究[40]發(fā)現(xiàn)circRNA CDR1as通過miR-7/GDF5軸，激活Smad1/5/8和p38 MAPK通路，促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞的成骨分化?？梢奵ircRNAs可能調(diào)控多種信號(hào)通路，影響OP的發(fā)展。

6 CircRNAs作為骨質(zhì)疏松癥診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物

骨質(zhì)疏松癥(OP)診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是測(cè)量骨密度計(jì)算T值。若T值低于-2.5，即診斷為OP[43]。臨床上外周靜脈血便于獲取，而circRNAs有較穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，可能成為新的OP診斷和預(yù)后標(biāo)志物。Xiang等[44]分別檢測(cè)健康人、骨量減少人、OP患者血漿，發(fā)現(xiàn)OP患者血漿中circ_0001445顯著降低。皮爾遜相關(guān)分析示circ_0001445與T值呈正相關(guān)，與反映骨吸收的β-CTx呈負(fù)相關(guān)；ROC曲線示circ_0001445對(duì)診斷OP的靈敏度和特異性分別為97.62 %和82.22 %。OP患者治療6個(gè)月后，circ_0001445水平上調(diào)。因此，綜合分析circ_0001445可作為OP診斷和判斷預(yù)后標(biāo)志物。

研究發(fā)現(xiàn)一些circRNAs上調(diào)可能提示OP的發(fā)生。PMOP患者外周血單核細(xì)胞中檢測(cè)到circ_0001275顯著升高[45]。ROC曲線示circ_0001275對(duì)PMOP患者有診斷價(jià)值。從58例PMOP患者和60例健康人血清分離的外泌體中發(fā)現(xiàn)，PMOP組circ_0006859顯著升高。經(jīng)分析circ_0006859以ROC曲線下面積0.897 4，93.1 %的高靈敏度和93.33 %的高特異性可用于診斷PMOP[13]。雖然circRNAs在臨床疾病診斷中未廣泛應(yīng)用，但circRNAs較線性RNA穩(wěn)定，隨著circRNAs相關(guān)研究不斷深入，其臨床應(yīng)用前景將會(huì)逐漸體現(xiàn)。

7 總結(jié)與展望

CircRNAs可調(diào)控干細(xì)胞成骨分化和單核巨噬細(xì)胞破骨分化影響骨質(zhì)疏松癥進(jìn)展，還能調(diào)節(jié)多種成骨信號(hào)通路并作為骨質(zhì)疏松癥生物標(biāo)志物。然而，近年來circRNAs雖在許多疾病中廣泛研究，但在骨質(zhì)疏松癥中研究還處于起步階段，且主要集中于研究circRNAs的miRNAs海綿機(jī)制。CircRNAs能否調(diào)控更多成骨信號(hào)通路以及circRNAs作為蛋白質(zhì)支架和調(diào)控轉(zhuǎn)錄等其他機(jī)制是否存在骨質(zhì)疏松癥中有待進(jìn)一步研究。骨質(zhì)疏松癥是亟需解決的健康問題，circRNAs的深入研究有望對(duì)其病因、診斷、治療和預(yù)后提供新的見解和解決方案。