高糖對骨髓間充質(zhì)干細胞作用機制的研究進展

?？〗?解強 劉亦冰 戴文昊 高俊,2* 張曦,2

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)常州附屬醫(yī)院，江蘇 常州 213003 2.張曦名中醫(yī)工作室，江蘇 常州 213003

糖尿病性骨質(zhì)疏松癥(diabetic osteoporosis，DOP)是一種繼發(fā)于糖尿病的全身性的代謝性骨病。在高糖(high glucose，HG)環(huán)境下，無論是1型糖尿病還是2型糖尿病，骨形成與骨吸收的動態(tài)平衡均被打破，引起骨代謝紊亂。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)具有多譜系分化及自我更新的潛能，因此成為研究骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機制的重要靶點，也憑其來源廣泛、免疫原性低等優(yōu)勢成為骨組織工程理想的種子細胞。本文綜述HG對BMSCs的作用機制，有利于突破DOP干細胞療法的局限性，挖掘潛能優(yōu)勢。

1 BMSCs與DOP的關(guān)系概述

在骨髓微環(huán)境中，BMSCs的增殖、凋亡、分化、遷移等參與了骨代謝這一復(fù)雜的生物學(xué)過程。在長期HG環(huán)境下，干細胞會發(fā)生代謝紊亂，具體表現(xiàn)為，提前老化甚至凋亡、增殖受損、遷移緩慢、分化及旁分泌功能障礙等[1]。BMSCs的功能改變與功能障礙是DOP病態(tài)骨代謝模式的根本原因[2]，因此，BMSCs的功能活性與DOP的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

目前，不論是糖尿病還是骨質(zhì)疏松癥，其治療不僅僅局限于藥物療法，而更多擴展到細胞療法。越來越多的研究[3]表明，BMSCs在二者治療方面都發(fā)揮了巨大的潛力。有研究[4]發(fā)現(xiàn)，將BMSCs植入顱骨缺損大鼠模型中，不僅可以觀察到新骨形成，同時堿性磷酸酶等成骨標志物的表達也有所升高。然而，許多研究證實，移植到糖尿病患者體內(nèi)的BMSCs由于長期受到HG環(huán)境的“污染”，導(dǎo)致其出現(xiàn)衰老凋亡、增殖能力降低、成骨分化受損等一系列的不良表現(xiàn)，降低了其功能效應(yīng)，甚至引發(fā)骨質(zhì)疏松癥，這無疑限制了BMSCs對DOP的治療效益與應(yīng)用價值。因此，深入研究HG對BMSCs的作用機制有利于為臨床治療DOP提供新思路。

2 HG對BMSCs的作用機制

2.1 HG影響B(tài)MSCs增殖

綜合多個HG對BMSCs增殖影響的研究，我們發(fā)現(xiàn)，由于實驗采用的細胞種屬、細胞系、培養(yǎng)方式等的不同，結(jié)果不一。蔣孟佚[5]研究顯示，長期HG會削減大鼠BMSCs的增殖。但Li等[6]證實，HG對人BMSCs與大鼠BMSCs增殖影響的結(jié)果相反，即HG會促進人BMSCs的增殖，其原因大概是，與鼠BMSCs相較，人BMSCs的干細胞特性更強，可以抵抗HG毒性。此外，趙同平等[7]研究認為，HG在短期內(nèi)可以增強小鼠BMSCs增殖水平,但長期來看，HG又會抑制這種增殖效應(yīng)。對于不同葡萄糖水平的定義，韋恩秀等[8]提出，處于細胞增殖峰值的葡萄糖水平為正糖，低或高于此水平則分別稱之為低糖或HG，且在實驗研究中，將小鼠BMSCs增殖活性最佳的22.5和50.0 mmol/L葡萄糖水平定為正糖，并發(fā)現(xiàn)，經(jīng)22.5 mmol/L正糖預(yù)處理后，更換不同葡萄糖濃度再持續(xù)培養(yǎng)時，與正糖狀態(tài)相比，100～300 mmol/L的短暫HG具有促增殖作用，即短暫HG可以提高小鼠BMSCs增殖水平，而且這種短暫HG促增殖作用只對正糖預(yù)處理成立，對低糖預(yù)處理或交替培養(yǎng)不成立，然而，無論是HG持續(xù)性培養(yǎng)還是HG間歇性培養(yǎng)，一旦時間延長，都會抑制BMSCs增殖。

2.2 HG促進BMSCs凋亡

細胞凋亡是在一系列凋亡信號誘導(dǎo)下引發(fā)細胞內(nèi)級聯(lián)反應(yīng)從而導(dǎo)致細胞發(fā)生主動死亡。研究[9]表明，HG(55 mmol/L)可提高小鼠BMSCs凋亡率，長期HG會引起晚期糖基化終末產(chǎn)物積累，導(dǎo)致BMSCs凋亡。由于HG可以誘發(fā)氧化應(yīng)激，程韶等[10]研究認為，大量活性氧能介導(dǎo)Wnt/β-catenin、Pl3K/AKT等信號通路，使BMSCs凋亡與衰老，進而使骨重建失衡。另有研究[11]表明，以HG高脂或炎性因子等來模擬糖尿病微環(huán)境能夠引起B(yǎng)MSCs凋亡。

2.3 HG促進BMSCs自噬

自噬是真核細胞在應(yīng)激狀態(tài)下為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，產(chǎn)生自噬溶酶體，降解自身內(nèi)部受損細胞器、大分子蛋白質(zhì)等，進而調(diào)節(jié)關(guān)鍵因子等的表達，以介導(dǎo)機體新陳代謝的一類機體損傷保護機制。Beclin1和LC3Ⅱ是自噬相關(guān)因子，其表達變化可以反映細胞自噬程度[12]?，F(xiàn)代研究指出自噬與骨代謝疾病緊密相關(guān)，自噬介導(dǎo)的骨代謝失衡是多種骨病的根源。研究[13]發(fā)現(xiàn)，自噬可以通過Hedgehog、Wnt/β-catenin、AMPK/mTOR、BMPs/Smad、RANK/RANKL等信號通路調(diào)節(jié)2型糖尿病骨代謝。劉艷等[12]研究認為，HG會促進BMSCs中Beclin1和LC3Ⅱ的表達，使細胞產(chǎn)生更多的自噬體，表明HG環(huán)境可以增強BMSCs的自噬程度，揭示了BMSCs的自噬失衡可能與DOP相關(guān)。張平[14]也指出，在HG高胰島素狀態(tài)下，BMSCs會加速衰老，其自噬程度會得到加強。同時，HG狀態(tài)下，BMSCs表現(xiàn)出早衰傾向，IL-6等衰老相關(guān)炎性細胞因子分泌增加，BMSCs可能是通過自噬介導(dǎo)的衰老來避免凋亡以保持細胞存活。此外，DOP的發(fā)生與細胞氧化應(yīng)激水平密切相關(guān)，而線粒體是細胞氧化應(yīng)激發(fā)生的主要場所。因此，線粒體功能受損對于BMSCs的成骨分化有一定的抑制作用[15]。線粒體自噬被認為是一種降解受損或老化的線粒體的特殊細胞存活機制[16]。近年來一些研究[17]發(fā)現(xiàn)，線粒體自噬和BMSCs的成骨分化密切相關(guān)，而且HG可能會抑制大鼠BMSCs在成骨分化過程中的線粒體自噬現(xiàn)象。

2.4 HG誘導(dǎo)BMSCs鐵死亡

鐵死亡是近年來發(fā)現(xiàn)的區(qū)別于細胞凋亡、自噬、壞死等的一種氧化性死亡方式，其特征表現(xiàn)為鐵依賴性的細胞內(nèi)脂質(zhì)活性氧生成與降解失調(diào)[18]。有研究[19]指出，DOP與慢性鐵蓄積導(dǎo)致的活性氧升高密切相關(guān)。張希等[20]研究認為，HG會引起B(yǎng)MSCs內(nèi)的活性氧和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物增加，且使BMSCs線粒體萎縮、膜密度增加、內(nèi)膜嵴減少，從而使BMSCs發(fā)生鐵死亡，抑制其成骨分化。現(xiàn)代研究關(guān)于其具體作用機制尚未完全闡明，但部分研究[21]指出，鐵過載可以抑制BMSCs的Wnt信號，誘導(dǎo)鐵死亡，從而抑制BMSCs成骨分化，過量的鐵通過下調(diào)BMSCs中Runx2的表達來抑制其成骨分化[22]，鐵過載誘導(dǎo)BMSCs產(chǎn)生活性氧，從而干擾了BMSCs成骨分化過程[23]。然而，在HG環(huán)境下，有關(guān)BMSCs鐵代謝與骨代謝的相關(guān)性仍需進一步研究。

2.5 HG誘導(dǎo)BMSCs分化

來源于胚胎時期中胚層的BMSCs具有多向分化的潛能，可以分化為成骨細胞、脂肪細胞、血管內(nèi)皮細胞等多種類型。

2.5.1成脂-成骨分化：BMSCs成骨分化在骨形成、維持及骨重建中都具有著重要的作用。目前影響B(tài)MSCs成骨分化的信號通路包括RANKL/RANK/OPG、Wnt、MAPK、AGEs/RAGE、Smad、Notch等，炎癥、氧化應(yīng)激等狀態(tài)也影響B(tài)MSCs的分化能力。目前普遍認為PPARγ(過氧化物酶體增值激活受體)、Runx2是影響B(tài)MSCs成骨和成脂分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，Wnt/β-catenin是影響B(tài)MSCs成骨和成脂分化的關(guān)鍵信號通路[24]。然而迄今為止，由于細胞來源不同或細胞代謝需求等的原因，HG對BMSCs的成骨分化存在一些爭議。Yamawaki等[25]認為在HG環(huán)境下BMSCs可以產(chǎn)生更多的骨鈣素和鈣沉積，另有一些研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs的功能依賴于葡萄糖的攝取。然而，更多的研究[26-28]發(fā)現(xiàn)，HG可以通過調(diào)節(jié)miR-493-5p/ZEB2或GSK3β、Hedgehog、NF-κB信號通路抑制BMSCs成骨分化。此外，HG還會促進BMSCs成脂分化，導(dǎo)致脂肪在骨髓腔中積累，進而使骨質(zhì)、骨強度下降[29]。HG通過促進BMSCs的脂滴形成及PPARγ等成脂分化標志基因的上調(diào)表達，而減緩鈣結(jié)節(jié)形成，抑制Runx2等成骨分化標志基因的表達來干擾其向成骨分化[30]。

2.5.2成血管-成骨分化：骨組織是一種高度血管化的組織，在靜息狀態(tài)下，骨血流量可占心輸出量的10 %～15 %[31]。骨內(nèi)血管不僅可以提供營養(yǎng)支持、運送代謝產(chǎn)物，而且與骨形成密切相關(guān)，是保持骨組織結(jié)構(gòu)完整性的關(guān)鍵因素。集中在生長板干骺端、骨內(nèi)膜、骨膜下區(qū)域的H型血管可以介導(dǎo)血管生成和骨形成的偶聯(lián)過程[32]。H型血管的豐富度是評價機體衰老和骨量多少的敏感指標[33]。研究[34]表明，年齡相關(guān)的H型血管減少與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，受損的骨量可以通過促進H型血管的生成來得到改善。H型血管可以參與調(diào)控BMSCs的分化過程[35]，BMSCs可以通過促血管生成從而促進成骨。HG會抑制BMSCs向血管內(nèi)皮細胞分化[36]，而且HG削弱BMSCs向血管內(nèi)皮細胞分化的機制可能就是HG自身或受其干預(yù)的生長因子促進了BMSCs的凋亡，使BMSCs的增殖受損，從而使BMSCs成血管分化能力減弱。

2.6 HG影響B(tài)MSCs的定向遷移

BMSCs進入外周血循環(huán)時，在各種因子的相互作用下，可以附著在血管內(nèi)皮細胞上，同時G蛋白偶聯(lián)受體與其結(jié)合，經(jīng)激活的BMSCs能夠在骨受損區(qū)參與骨形成過程，在骨損傷的再生修復(fù)過程中，BMSCs的募集發(fā)揮了重要作用[37]。BMSCs向骨受損區(qū)的募集與其定向遷移能力密切相關(guān)，而且應(yīng)用BMSCs治療骨質(zhì)疏松癥時，需要其定向遷移至骨組織才能使治療效益最大化。

趨化因子及其受體是調(diào)控BMSCs定向遷移的重要因素?；|(zhì)細胞衍生因子-1(SDF-1)是一種趨化因子，與其G蛋白偶聯(lián)受體CXCR-4相互作用可發(fā)揮細胞趨化功能。許多研究表明，SDF-1在骨受損區(qū)高度表達，BMSCs可以在SDF-1/CXCR-4通路的趨化作用下，定向遷移至骨受損區(qū)，從而發(fā)揮骨形成功能。然而，張博[38]發(fā)現(xiàn)，在HG環(huán)境下，CXCR-4的表達受抑制，從而影響SDF-1/CXCR-4通路對BMSCs定向遷移能力的調(diào)控。此外，HG會使BMSCs過早老化，分泌大量炎性因子，抑制BMSCs的定向遷移。唐雪[39]表明，模擬糖尿病的HG無血清狀態(tài)，可使BMSCs的旁分泌因子減少，進而影響其遷移能力。這些研究都表明HG可以抑制BMSCs的定向遷移，限制BMSCs向骨受損區(qū)募集，進而影響骨代謝的過程。然而有學(xué)者[40]表示，HG可促進人BMSCs的遷移。

2.7 HG影響B(tài)MSCs的旁分泌功能

研究發(fā)現(xiàn)在外界微環(huán)境刺激下，BMSCs可以通過旁分泌多種生長因子促進骨修復(fù)和再生。這些生長因子包括胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforming growth factor-β1，TG-β1)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等可以影響成骨細胞活性，從而使BMSCs參與骨重建與血管形成的耦合過程以修復(fù)骨缺損[41-42]。王廣闊等[43]研究認為，BMSCs可以通過旁分泌作用使成骨相關(guān)基因Osterix、Runx2、OPN表達上調(diào)，從而提高成骨細胞成骨活性，也會使成骨細胞遷移相關(guān)基因MMP-2、MMP-9表達上調(diào)，從而促進成骨細胞趨化遷移到骨損傷部位，此外，BMSCs旁分泌作用還能增強成骨細胞增殖能力、成骨礦化能力。然而，在HG環(huán)境下，BMSCs的旁分泌作用被抑制[44-45]。

3 結(jié)語與展望

BMSCs的生物活性與功能特性與DOP的發(fā)生、發(fā)展及治療均有著密不可分的聯(lián)系。研究HG對BMSCs的影響作用，既可以深入了解DOP的發(fā)病機制，又可以為干細胞療法發(fā)揮更優(yōu)效益提供理論支持。綜上所述，HG對BMSCs的作用存在雙向性，一方面，在HG環(huán)境下，BMSCs會加速凋亡、鐵死亡及成脂向分化，而減緩旁分泌及成血管向分化，進而抑制成骨；另一方面，HG通過促進BMSCs及線粒體自噬，保存細胞活性，一定程度上會促進成骨。在BMSCs增殖方面，HG對不同來源的細胞系有不同作用傾向，但一般認為，短暫HG會促進BMSCs增殖，持續(xù)HG會抑制BMSCs增殖。此外，HG對BMSCs定向遷移也有不同的作用傾向，但大部分研究表明，HG會抑制其定向遷移能力。

雖然越來越多的學(xué)者通過研究HG對BMSCs的影響來間接為DOP的治療提供實驗論據(jù)，但其具體機制還有待進一步明確。而且，基礎(chǔ)與臨床研究均證明，DOP患者的BMSCs并非單純處于HG環(huán)境下，其鐵、脂、激素、蛋白質(zhì)水平均處于異常狀態(tài)，因此，HG對BMSCs的影響與其它物質(zhì)代謝之間又具有一定的聯(lián)系，并且是交互影響的，存在著錯綜復(fù)雜的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，故對DOP的理論認識仍需要日益更新。