蠟樣芽孢桿菌引起的食源性疾病檢測(cè)方法研究*

曹 霞，巴瑩瑩，王燕華

(重慶市南川區(qū)疾病預(yù)防控制中心，重慶 408400)

食源性疾病是當(dāng)前世界上最突出的衛(wèi)生問(wèn)題之一。根據(jù)國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，僅2021年我國(guó)食源性疾病暴發(fā)事件達(dá)5 493起，發(fā)病32 334例。其中，由微生物導(dǎo)致的食源性疾病位居第二。在事件處置過(guò)程中，通過(guò)對(duì)病例生物樣本、食品、環(huán)境等樣品的檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果相關(guān)性分析，確定食物鏈及食品衛(wèi)生學(xué)特征，對(duì)控制食源性疾病的暴發(fā)流行起到非常重要的作用。而傳統(tǒng)的病原體培養(yǎng)檢測(cè)周期長(zhǎng)，對(duì)樣品檢測(cè)人員技術(shù)要求高，限制了食源性疾病病例與食物鏈的同時(shí)收集、同步快速有效檢測(cè)，不利于證據(jù)鎖定[1]。本文通過(guò)多重聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)分子生物學(xué)技術(shù)、飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)，與傳統(tǒng)致病菌培養(yǎng)相結(jié)合的方法，快速鎖定突發(fā)公共衛(wèi)生事件中檢測(cè)方向，旨在為食源性疾病的病原檢測(cè)找到更為快捷、有效的方法，提高檢測(cè)效率。

1 材料與方法

1.1一般材料

1.1.1基本情況 2022年6月8日19:00，南川疾控中心接到區(qū)人民醫(yī)院電話報(bào)告：當(dāng)晚接診3例(一家人)因惡心、嘔吐等癥狀到該院急診科就診的病例，因有共同就餐史，懷疑為食用不潔食物引起的食物中毒。經(jīng)情況核實(shí)及流行病學(xué)調(diào)查，此次事件陸續(xù)涉及8個(gè)家庭18例病例，均食用了在同一攤位購(gòu)買的米粉，患者發(fā)病潛伏期短(30 min至3 h)，臨床表現(xiàn)以惡心、嘔吐、頭暈為主，后期部分病例出現(xiàn)腹痛、腹瀉等癥狀，符合食源性疾病表現(xiàn)。

1.1.2樣品來(lái)源 工作人員陸續(xù)采集患者嘔吐物、未食用完米粉、加工店剩余米粉及現(xiàn)場(chǎng)環(huán)境樣品等共計(jì)18份。

1.2方法

1.2.1主要儀器和試劑 MALDI Biotyper時(shí)間飛行質(zhì)譜儀(德國(guó)Bruker公司)；FilmArray 2.0多重病原體分子檢測(cè)系統(tǒng)(法國(guó)生物梅里埃公司)；VTEK-2細(xì)菌鑒定儀(法國(guó)生物梅里埃公司)；PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)伯樂(lè)公司)；恒溫培養(yǎng)箱(德國(guó) Memert公司)；顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。

食物中毒(18種)多重核酸快速檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法)(深圳生科原生物有限公司)；胃腸道感染性病原體核酸聯(lián)合檢測(cè)試劑盒(法國(guó)生物梅里埃公司)；BCL卡；蠟樣芽孢桿菌ATCC14579；甘露醇多黏菌素培養(yǎng)基(MYP)、硫酸錳培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂等。

1.2.2多病原及多重實(shí)時(shí)熒光PCR篩查 多病原篩查是將每份標(biāo)本分別吸取 200 μL樣本加入樣本制備管內(nèi)，合上管蓋，上下顛倒3次以混勻，按儀器標(biāo)準(zhǔn)操作流程在1 h內(nèi)完成包括核酸提取、純化、逆轉(zhuǎn)錄、第一輪 PCR 擴(kuò)增、第二輪 PCR 擴(kuò)增在內(nèi)的多個(gè)反應(yīng)步驟，并得到測(cè)試條中22種常見胃腸道感染相關(guān)的病原體靶標(biāo)(包括13種細(xì)菌、4 種寄生蟲和 5 種病毒所有病原體靶標(biāo))檢測(cè)結(jié)果。多重核酸快速檢測(cè)則是將糞便、食品、嘔吐物樣本及增菌液參照核酸提取試劑盒說(shuō)明書(RNA 提取試劑盒)，以提取的核酸為模板，分別進(jìn)行沙門氏菌、志賀氏菌、結(jié)腸彎曲菌、空腸彎曲菌、 單增李斯特氏菌、大腸桿菌 0157、蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌、致病性大腸桿菌 bfp 基因和 escV 基因、小腸耶爾森菌、肉毒桿菌、變形桿菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌、霍亂弧菌、副溶血性弧菌、腸道腺病毒等病原實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)。

1.2.3蠟樣芽孢桿菌定性定量培養(yǎng) 稱取25 g可疑食品，放入盛有225 mL生理鹽水溶液的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器充分混勻后進(jìn)行5個(gè)稀釋度稀釋，用無(wú)菌L棒將稀釋液均勻涂布接種于MYP平板，靜置10 min,30 ℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行蠟樣芽孢桿菌平板計(jì)數(shù)。取10 μL糞便標(biāo)本，劃線接種于MYP平板，進(jìn)行蠟樣芽孢桿菌定性培養(yǎng)。環(huán)境涂抹樣，患者嘔吐物及肛拭子均參照GB4789進(jìn)行。

1.2.4MALDI Biotyper時(shí)間飛行質(zhì)譜(Bruker)檢測(cè) 從MYP平板上挑取可疑菌落轉(zhuǎn)普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂進(jìn)行純化，根據(jù)布魯克微生物快速鑒定系統(tǒng)操作規(guī)程，采用直接轉(zhuǎn)移法制備待檢樣本。用一次性接種環(huán)挑取受試菌株單個(gè)菌落，直接涂抹于不銹鋼 MALDI MSP靶板圓孔中，每孔滴加70%甲酸溶液1 μL,室溫下晾干。隨后用1 μL基質(zhì)溶液覆蓋，自然晾干后上機(jī)鑒定。結(jié)果用 Biotyper3.1 Database 處理分析。

2 結(jié) 果

2.1多病原檢測(cè)系統(tǒng)篩查結(jié)果 FilmArray多病原篩查13種細(xì)菌，4種寄生蟲和5種病毒。包括彎曲菌(空腸、結(jié)腸、烏普薩拉)、難辨梭菌(霉素A/B)、類志賀鄰單胞菌、沙門菌、弧菌(副溶血、創(chuàng)傷、霍亂)、霍亂弧菌、小腸結(jié)腸耶爾森菌、致瀉大腸埃希菌/志賀菌、腸聚集性大腸埃希菌(EAEC)、產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌(ETEC)、腸致病性大腸埃細(xì)菌(EPEC)、產(chǎn)類志賀毒素大腸埃希菌(STEC)、大腸埃希菌0157、志賀菌/腸侵入性大腸埃希菌(EIEC)、隱孢子蟲、環(huán)孢子蟲、痢疾阿米巴、蘭伯氏賈第鞭毛蟲、腺病毒F組40/41、星狀病毒、諾如病毒GI/GⅡ、輪狀病毒A群、扎如病毒(Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ和Ⅴ)。檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

2.2多重PCR核酸快速檢測(cè)結(jié)果 11個(gè)樣品中檢出蠟樣芽孢桿菌核酸陽(yáng)性10個(gè)。陽(yáng)性樣品包括食品樣品3個(gè)，物表拭子2個(gè)，患者嘔吐物及糞便5個(gè)。檢測(cè)結(jié)果見表1。

表1 可疑污染樣品多重PCR核酸檢測(cè)結(jié)果

2.3蠟樣芽孢桿菌定量及定性培養(yǎng) 18個(gè)樣品中有9個(gè)樣品分離出蠟樣芽孢桿菌，其中5件為食品樣品(兩份剩余米粉蠟樣芽孢桿菌菌落計(jì)數(shù)高達(dá)2.1×106、1.1×106CFU/g)。其余4件為環(huán)境樣及物表拭子。3個(gè)樣品檢出金黃色葡萄球菌。檢測(cè)結(jié)果見表2。

表2 可疑污染樣品細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果[n(%)]

2.4MALDI Biotyper時(shí)間飛行質(zhì)譜(Bruker)鑒定結(jié)果 在食品及物表拭子中分離純化培養(yǎng)的61株可疑菌株，經(jīng)Bruker MBT_DB5989 數(shù)據(jù)庫(kù)分析,譜圖的相合性以0～3之間的數(shù)值[“l(fā)og (分值)”=分值]形式表示。置信水平以log(分值)≥2.0獲得可能鑒定[2]。經(jīng)質(zhì)譜鑒定為蠟樣芽孢桿菌的有37株，金黃色葡萄球菌2株，score評(píng)分均在1.89～2.40分，未成功鑒定的有22株，鑒定率為63.9%。質(zhì)譜陽(yáng)性菌株鑒定結(jié)果與 VITEK-2 及血漿凝固酶鑒定結(jié)果一致。檢測(cè)結(jié)果見表3。

表3 MALDI Biotyper時(shí)間飛行質(zhì)譜儀(Bruker)鑒定結(jié)果匯總

3 討 論

3.1多重PCR等快速檢測(cè)方法的技術(shù)優(yōu)勢(shì) 根據(jù)《食源性疾病暴發(fā)：調(diào)查和控制指南》[3]及重慶市食源性疾病突發(fā)事件衛(wèi)生應(yīng)急處置技術(shù)規(guī)范(試行)，檢驗(yàn)人員接到食源性疾病突發(fā)樣品后，應(yīng)作為緊急情況立即進(jìn)行檢驗(yàn)，以最快速度出具檢驗(yàn)報(bào)告。根據(jù)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)《食品衛(wèi)生監(jiān)督程序》的規(guī)定，一般應(yīng)在5 d內(nèi)出具檢驗(yàn)報(bào)告。傳統(tǒng)的生物培養(yǎng)鑒定法不僅需要增菌，選擇性平板培養(yǎng)，可疑菌落分純及生化鑒定，血清學(xué)鑒定多個(gè)步驟，更重要的是在事件暴發(fā)初期就必須確定正確的檢測(cè)方向，這對(duì)流調(diào)人員現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果相關(guān)性分析，掌握重要微生物、理化及毒素等病因?qū)е率吃葱约膊〉呐R床表現(xiàn)、標(biāo)本采樣要求及判定標(biāo)準(zhǔn)的要求很高，一旦檢測(cè)方向錯(cuò)誤，付出的時(shí)間及人力、物力成本極大。就此次事件而言，即使是目標(biāo)明確的常規(guī)培養(yǎng)時(shí)間耗費(fèi)也在5 d以上，此外，在食源性疾病暴發(fā)檢測(cè)中，受制于樣品采集環(huán)節(jié)的局限(如某些食品樣品缺失，樣品量不夠等)，特別是某些條件致病菌導(dǎo)致的食源性疾病，還涉及菌落計(jì)數(shù)及毒素分型的鑒定，檢測(cè)方法與常規(guī)GB4789標(biāo)準(zhǔn)程序也有較大的不同，結(jié)果報(bào)告時(shí)間亦無(wú)法保證。

本次食源性事件處置過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)室利用FilmArray 全自動(dòng)醫(yī)用 PCR 分析系統(tǒng)及多重核酸快速檢測(cè)試劑盒在無(wú)須復(fù)雜樣本前處理的情況下一次性檢測(cè)20多種相關(guān)的病原體靶點(diǎn)，從食品、環(huán)境及人員3個(gè)方面快速鎖定檢測(cè)方向，在事件發(fā)生初期，11個(gè)樣品中即檢出蠟樣芽孢桿菌核酸陽(yáng)性樣品10個(gè)，涉及食品樣品、物表拭子、患者嘔吐物及糞便，基本覆蓋了完整的食物中毒鏈條?；谏鲜鰧?shí)驗(yàn)室病原檢測(cè)結(jié)果，4 h內(nèi)基本可以判斷蠟樣芽孢桿菌污染極有可能是此次急性胃腸炎暴發(fā)的原因之一，這與后期細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果基本一致(尤其是兩件食品中蠟樣芽孢桿菌平板計(jì)數(shù)值超過(guò)1.0×105CFU/g的中毒劑量)；而MALDI-TOF MS 技術(shù)的運(yùn)用，在可疑菌株的鑒定方面具有快速、高效、檢測(cè)成本低廉的優(yōu)勢(shì)，菌落分純上機(jī)后5 min內(nèi)便可在參考數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)鑒定到屬或種的水平，應(yīng)急狀態(tài)下替代傳統(tǒng)生化鑒定和血清學(xué)鑒定技術(shù)，也為爭(zhēng)取疫情快速處置時(shí)間發(fā)揮了重要作用。這些快速檢測(cè)方法和自動(dòng)化檢測(cè)技術(shù)，不僅順應(yīng)了食品監(jiān)管對(duì)應(yīng)急事件處置時(shí)間的要求[4]，而且操作便捷，是傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)逐步向分子檢測(cè)水平發(fā)展的一個(gè)方向。

3.2應(yīng)用缺陷 盡管實(shí)時(shí)熒光PCR、時(shí)間質(zhì)譜等方法為事件準(zhǔn)確定性提供了良好的檢測(cè)平臺(tái)，但實(shí)際應(yīng)用中仍存在不少缺陷,除了受被檢樣品在采集、運(yùn)輸、儲(chǔ)存及核酸提取過(guò)程中DNA 降解，患者或帶菌者服用抗生素或其他抑菌制劑等影響外，方法檢出限、抗干擾能力、交叉反應(yīng)等都可能造成檢測(cè)結(jié)果與國(guó)標(biāo)經(jīng)典方法出現(xiàn)偏差[5-6]。此次食源性疾病檢測(cè)過(guò)程中，F(xiàn)ilmArray多病原檢測(cè)系統(tǒng)和多重核酸快速檢測(cè)試劑均未能檢測(cè)出患者嘔吐物中的金黃色葡萄球菌。這除了可能與樣品前期增菌時(shí)間不足，細(xì)菌濃度較低有關(guān)；還可能與試劑檢測(cè)下限較高(>1 000 copies)等因素有關(guān)。并且上述兩種方法一次性檢測(cè)成本消耗均較大,也在一定程度上限制了其在常規(guī)檢測(cè)中的應(yīng)用。

在此次突發(fā)事件中，食品及物表拭子中分離純化培養(yǎng)的61株可疑菌株，MALDI-TOF MS初次鑒定率準(zhǔn)確率僅為63.9%。除了對(duì)可疑菌株的識(shí)別存在偏差外，檢測(cè)實(shí)踐過(guò)程中，不同的實(shí)驗(yàn)室人員在同一株菌樣品涂抹處理上前后鑒定結(jié)果也呈現(xiàn)出較大的差異，這與鮑春梅等[7]利用 MALDI-TOF MS技術(shù)分析直接涂抹法及提取法對(duì)宋內(nèi)志賀菌的鑒定情況有類似之處。菌膜涂布太薄或太厚、忘記添加基質(zhì)、基質(zhì)結(jié)晶不均勻等情況都會(huì)干擾鑒定結(jié)果。不僅如此，樣品制備完成進(jìn)靶后，儀器真空度大小、質(zhì)量軸偏移、激光能量Offset值設(shè)置太強(qiáng)或太弱會(huì)都會(huì)影響圖譜質(zhì)量。此外，這項(xiàng)技術(shù)最大的局限性在于數(shù)據(jù)庫(kù)[8-9]。MALDI-TOF MS難以鑒定參考數(shù)據(jù)庫(kù)中不含其參考模式的微生物，目前對(duì)混合培養(yǎng)物、液體培養(yǎng)物中的微生物、絲狀真菌、未進(jìn)行傳代培養(yǎng)樣本、病毒樣本均不適用，對(duì)某些指紋圖譜比較相似的細(xì)菌血清型如志賀菌和大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、氣單胞菌群、李斯特菌，肺炎鏈球菌等也很難區(qū)分。不同的地域環(huán)境、不同的實(shí)驗(yàn)室間病原微生物培養(yǎng)方式，缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的操作流程等[10-11]，時(shí)間飛行質(zhì)譜技術(shù)還有許多問(wèn)題亟待完善。

3.3本次研究的偏差與不足 盡管根據(jù)《WS/T82-1996蠟樣芽孢桿菌食物中毒診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則》，此次事件從流行病史、現(xiàn)場(chǎng)衛(wèi)生學(xué)調(diào)查、臨床癥狀及污染食品中蠟樣芽孢桿菌計(jì)數(shù)幾方面，判定事件結(jié)論為食用蠟樣芽孢桿菌污染的米粉導(dǎo)致的食源性疾病，但是否與患者嘔吐物中檢出的金黃色葡萄球菌存在關(guān)聯(lián)未進(jìn)行進(jìn)一步深入探索；并且，食源性致病菌的鑒定及事件溯源更多的是通過(guò)基因型別、分子型別或全基因組測(cè)序等方式獲得更為精準(zhǔn)的結(jié)果[12]，如果本次事件能結(jié)合PFGE分型技術(shù)和毒力基因檢測(cè)技術(shù)綜合作為實(shí)驗(yàn)室診斷的參考判定依據(jù)，對(duì)案例的分析及判定更有意義。