紫杉醇聯(lián)合百合皂苷對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞增殖和遷移能力影響的研究*

李 君,趙蔚林,曹 強(qiáng)

(湘潭醫(yī)衛(wèi)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 湘潭 411102)

隨著工業(yè)化的不斷發(fā)展和人們生活節(jié)奏的加快，以及生活方式的不斷改變，精神心理、免疫因素的不斷變化，惡性腫瘤的發(fā)病率和病死率每年均呈現(xiàn)高速增長態(tài)勢(shì)。湖南部分地區(qū)人群有吃檳榔的習(xí)慣，使該地區(qū)成為口腔癌的高發(fā)地區(qū)[1-2]?？谇话┦前l(fā)生在口腔黏膜上皮的惡性腫瘤，以鱗狀細(xì)胞癌為主。對(duì)于口腔癌的治療，早期主要采取以外科手術(shù)治療為主的綜合治療，手術(shù)治療可以切除原發(fā)病灶，并對(duì)頸部淋巴結(jié)進(jìn)行相應(yīng)治療，從而提高患者的生存質(zhì)量，延長患者的生存時(shí)間。但對(duì)于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者或需要預(yù)防口腔癌復(fù)發(fā)者，化學(xué)藥物的治療也是一種重要手段[3-4]。百合皂苷是從中藥百合中提取的有效成分，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為百合皂苷具有抗癌、止咳平喘、鎮(zhèn)靜催眠、降血糖、抗氧化等功效[5-6]；紫杉醇是目前發(fā)現(xiàn)的天然抗癌藥物，已經(jīng)廣泛用于乳腺癌、肺癌、卵巢癌、食管癌及頭頸部腫瘤的治療[7]。本研究以人口腔鱗癌細(xì)胞作為研究對(duì)象，探討百合皂苷聯(lián)合紫杉醇對(duì)人口腔鱗癌細(xì)胞增殖和遷移的影響，將為臨床治療口腔鱗癌提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器 MCO-18型二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(濟(jì)南卓隆生物科技有限公司)，HD-650型細(xì)胞培養(yǎng)超凈工作臺(tái)(鄭州安晨科學(xué)儀器有限公司)，MDF-C8V1型-80 ℃超低溫保存箱(浙江和儀器有限公司)，CP-90XA型超速離心機(jī)(北京昊諾斯科技有限公司)，DR-200B型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(濟(jì)南雙秀生物技術(shù)有限公司)，HBS-1096型高壓滅菌鍋(深圳市鼎鑫宜實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，HH-600型電熱恒溫水箱(上海沉匯儀器有限公司)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)材料 人類口腔癌細(xì)胞系CAL27購自武漢大學(xué)附屬細(xì)胞庫。

1.1.3試劑 DMEM高糖培養(yǎng)液購自上海語純生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)購自武漢尚恩生物科技有限公司；胰蛋白酶消化液購自浙江羽翔生物科技有限公司；青霉素-鏈霉素雙抗溶液購自浙江聯(lián)碩生物科技有限公司；6、96孔板購自上海西唐生物科技有限公司；細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(MTT)試劑購自北京百奧萊博科技有限公司；二甲基亞砜(DMSO)購自上海研謹(jǐn)生物科技有限公司；Caspase-3抗體購自北京華夏遠(yuǎn)洋科技有限公司；細(xì)胞裂解液購自廣州左克生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1人類口腔鱗癌細(xì)胞CAL27細(xì)胞的培養(yǎng) 復(fù)蘇CAL27細(xì)胞，將DMEM高糖培養(yǎng)液與青霉素-鏈霉素雙抗溶液通過1∶100的比例進(jìn)行配置，將細(xì)胞從液氮保存灌中取出，將細(xì)胞凍存管放入電熱恒溫水箱，以37 ℃的溫度進(jìn)行解凍。用75%的乙醇噴灑及擦拭細(xì)胞培養(yǎng)超凈實(shí)驗(yàn)臺(tái)，然后放入細(xì)胞培養(yǎng)超凈臺(tái)中，將解凍的CAL27細(xì)胞移進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并向培養(yǎng)瓶中加入配置好的培養(yǎng)液，混合均勻，放入二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中，經(jīng)過48 h的培養(yǎng)后將培養(yǎng)瓶從二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出，放入細(xì)胞培養(yǎng)超凈實(shí)驗(yàn)臺(tái)中，倒去培養(yǎng)液；使用PBS沖洗，倒去PBS后，向培養(yǎng)瓶中加入適量胰蛋白酶消化液，充分消化后，棄去胰蛋白酶消化液，向培養(yǎng)瓶中加入配置好的培養(yǎng)液，反復(fù)吹打，將細(xì)胞懸液接種于新的培養(yǎng)瓶中，加入培養(yǎng)液，放入二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2MTT 使用胰蛋白酶消化液消化處理數(shù)期生長的CAL27細(xì)胞，離心后收集制成細(xì)胞懸液，調(diào)整其濃度至5×104mL-1，接種于96孔板，放入二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，依次加入百合皂苷、紫杉醇聯(lián)合制劑(10 、20 、40 、80 、160 μg/mL)，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置實(shí)驗(yàn)對(duì)照孔和空白孔。分別在培養(yǎng)到24、48、72 h后，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO溶液，置于搖床上振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀光密度(OD) 490 nm處測(cè)量各孔的吸光度(A)值。通過檢測(cè)實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、空白組的A值，計(jì)算口腔癌細(xì)胞增殖抑制率。

1.2.3細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)(Wound Healing) 將直尺和Marker筆在細(xì)胞培養(yǎng)超凈實(shí)驗(yàn)臺(tái)內(nèi)用紫外線照射30 min，然后使用Marker筆在6孔板背后畫橫線，在孔中加入8×105個(gè)細(xì)胞，加入DMEM高糖培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h，使其形成單層細(xì)胞，用10 μL移液器槍頭在單層細(xì)胞上一字劃痕，用PBS清洗3次，加入百合皂苷、紫杉醇聯(lián)合制劑作為加藥組(陽性對(duì)照)，同時(shí)設(shè)置未加藥組(陰性對(duì)照)和空白對(duì)照組進(jìn)行比對(duì)，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，24 h后換1次培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸去培養(yǎng)液，用PBS清洗3次，放置于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照，觀察加藥組、未加藥組及空白對(duì)照組劃痕愈合現(xiàn)象。

1.2.4Western blotting實(shí)驗(yàn) 使用百合皂苷及紫杉醇的聯(lián)合制劑處理CAL27細(xì)胞(聯(lián)合用藥組)，同時(shí)設(shè)置未處理CAL27細(xì)胞組(未加藥組)，加藥后放入二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，之后倒掉培養(yǎng)液，PBS緩沖液清洗3次，加入細(xì)胞裂解液，輕輕搖動(dòng)3 min，使用刮子將培養(yǎng)瓶上的細(xì)胞刮下，將細(xì)胞懸液收集于離心管中，邊搖動(dòng)邊裂解10 min，然后放入離心機(jī)(12 000 r/min)離心10 min，將上清液移入離心管保存?zhèn)溆?。采用Bradford蛋白濃度測(cè)定法，使用不同體積的牛血清白蛋白(BSA)、純水及900 μL的考馬斯亮藍(lán)G250，配制成濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的BSA溶液，輕微振蕩5 min后加入孔板中，根據(jù)A值計(jì)算蛋白濃度。將配制好的分離膠加入玻璃板中，下層膠凝固之后，加入濃縮膠，插入齒梳，濃縮膠凝固后拔出齒梳，固定在電泳槽上，并加入600 mL的電泳緩沖液，上樣并開始電泳，電泳結(jié)束后，取出分離膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)順序如下：黑色面-海綿-三層濾紙-凝膠-聚偏二氟乙烯膜-三層濾紙-海綿-白色面，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，封閉液封閉2 h，4 ℃條件下，一抗孵育過夜，TBST溶液清洗2次，室溫下二抗孵育2 h，TBST溶液洗膜，凝膠成像系統(tǒng)顯影，計(jì)算對(duì)應(yīng)條帶灰度值[8-9]。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均使用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理分析，組間差異采用方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1百合皂苷、紫杉醇聯(lián)合用藥對(duì)CAL27細(xì)胞增殖能力的影響 CAL27細(xì)胞在由低濃度到高濃度的百合皂苷、紫杉醇聯(lián)合用藥處理24、48、72 h后，口腔鱗癌CAL27細(xì)胞增殖能力隨百合皂苷、紫杉醇聯(lián)合制劑的濃度不斷升高而逐漸減弱，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組與空白組CAL27細(xì)胞增殖能力比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 百合皂苷、紫杉醇不同濃度聯(lián)合用藥對(duì)CAL27細(xì)胞增殖能力的影響

2.2百合皂苷、紫杉醇聯(lián)合用藥對(duì)CAL27細(xì)胞遷移能力的影響 空白對(duì)照組單層細(xì)胞上劃出一道痕，加藥組由于加入藥物的作用，CAL27細(xì)胞遷移受到抑制，未加藥組的細(xì)胞仍然保持原有的遷移能力，一段時(shí)間后，通過細(xì)胞遷移能夠?qū)澓鄹采w。加藥組與空白對(duì)照組細(xì)胞愈合率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

A.空白對(duì)照組；B.加藥組；C.未加藥組。圖2百合皂苷、紫杉醇聯(lián)合用藥對(duì)CAL27細(xì)胞遷移能力的影響(200×)

2.3百合皂苷、紫杉醇聯(lián)合用藥對(duì)CAL27細(xì)胞中Caspase-3蛋白表達(dá)情況的影響 聯(lián)合用藥組CAL27細(xì)胞中Caspase-3蛋白的表達(dá)明顯高于未加藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

A.兩組CAL27細(xì)胞中Caspase-3蛋白表達(dá)Western blotting圖；B.兩組CAL27細(xì)胞中Caspase-3蛋白表達(dá)比較。圖3 百合皂苷、紫杉醇聯(lián)合用藥對(duì)CAL27細(xì)胞中Caspase-3蛋白表達(dá)情況的影響

3 討 論

本研究中，MTT結(jié)果提示，百合皂苷、紫杉醇聯(lián)合制劑對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞CAL27細(xì)胞增殖具有抑制作用。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，百合皂苷、紫杉醇聯(lián)合制劑對(duì)口腔鱗癌CAL27細(xì)胞遷移具有抑制作用。通過Western blotting方法，測(cè)得百合皂苷、紫杉醇聯(lián)合處理CAL27細(xì)胞組(聯(lián)合用藥組)中促凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的表達(dá)明顯高于未加藥組。結(jié)果提示，百合皂苷、紫杉醇聯(lián)合用藥可能通過誘導(dǎo)口腔鱗癌CAL27細(xì)胞發(fā)生凋亡的方式抑制其增殖遷移的。

口腔鱗癌作為近幾年發(fā)展較快的惡性腫瘤，也同樣存在相關(guān)癌基因的活化，抑癌基因的失活以及信號(hào)通路的活化，有研究表明，抑癌基因P53的突變廣泛參與口腔鱗癌的發(fā)生、發(fā)展，作為廣泛參與多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展的JAK-STAT信號(hào)通路在口腔鱗癌中也處于過度活化狀態(tài)；還有研究表明，口腔癌細(xì)胞可以通過活化Wnt信號(hào)通路來抑制細(xì)胞凋亡機(jī)制的發(fā)生，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、增殖及轉(zhuǎn)移[10-15]。當(dāng)細(xì)胞面臨的內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變時(shí)，細(xì)胞通過自我分解自身蛋白質(zhì)或者降解衰老、病變的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的成分，能夠更好地去適應(yīng)環(huán)境，更容易生存，對(duì)于惡性腫瘤來說，自噬現(xiàn)象顯得尤為重要。有研究表明，通過對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞進(jìn)行體外耐藥實(shí)驗(yàn)證實(shí)，發(fā)生耐藥的腫瘤細(xì)胞更容易形成自噬體，適應(yīng)抗腫瘤微環(huán)境[15]。百合皂苷、紫杉醇聯(lián)合用藥是否通過細(xì)胞凋亡或者細(xì)胞自噬機(jī)制來抑制CAL27細(xì)胞增殖遷移，還需要進(jìn)一步做基因分子研究，也將成為下一個(gè)研究方向和重點(diǎn)。