櫻桃枝干病害病原鑒定及生物防治

張淑靜，趙 林，孫 超，王 靜，馬安寶，曲永赟

（1.山東省林業(yè)科學(xué)研究院，山東 濟南 250014；2.濟南棲圣農(nóng)林科技有限公司，山東 濟南 250014）

近年來，櫻桃作為一種重要的經(jīng)濟果樹在全國果業(yè)生產(chǎn)中的重要地位越來越凸顯，已成為我國鄉(xiāng)村振興、產(chǎn)業(yè)興旺的重要引擎[1-4]。目前，全國櫻桃的種植面積超過24.7 萬hm2，年總產(chǎn)量在140 萬t 左右[5-7]。櫻桃栽培區(qū)域遍布全國23 個省市，櫻桃已成為我國水果產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要組成部分。

然而，櫻桃病蟲害的發(fā)生已成為制約我國櫻桃產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的主要障礙[8-9]。其中，櫻桃枝干病害成為近年來櫻桃樹上一種毀滅性病害，發(fā)病嚴重地區(qū)直接導(dǎo)致櫻桃樹大面積枯萎死亡，造成櫻桃絕收[10-11]。但目前對于櫻桃枝干病害的病原及發(fā)病特征研究未有報道，同時如何有效采取針對性生物防治手段未見研究。為了明確櫻桃枝干病害病因，我們對該病的病原進行了初步研究；同時，篩選到高效拮抗該病原的生防微生物，并探究了該菌株液體制劑對櫻桃枝干病害的防治效果，為后續(xù)針對櫻桃枝干病害微生物菌劑的研發(fā)以及櫻桃枝干病害生物防治提供理論和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 病害調(diào)查及采樣

2019年至2020年連續(xù)2年在山東省主要櫻桃產(chǎn)區(qū)煙臺福山區(qū)、濰坊臨朐縣、泰安天寶鎮(zhèn)以及淄博燕崖鎮(zhèn)進行病害調(diào)查，調(diào)查面積超20 hm2。調(diào)查內(nèi)容主要為枝干病害發(fā)生時間、發(fā)病癥狀、危害程度以及受害株率等。

同時，我們采集發(fā)生枝干病害的枝段，統(tǒng)一編號并標明采集地點和采集時間，送回實驗室進行病原菌的分離等相關(guān)研究。

1.2 病原菌分離培養(yǎng)及鑒定

1.2.1 病原菌分離培養(yǎng)

將采集送回的枝段立即進行病原菌分離。先用蒸餾水將枝段清洗干凈，再用75%乙醇溶液進行消毒；再用無菌刀片和接種針在枝段病健交界處以及染病的木質(zhì)部和韌皮部取組織塊，接種于孟加拉紅培養(yǎng)基上，在28℃條件下恒溫培養(yǎng)。待培養(yǎng)物長出，在PDA 培養(yǎng)基上進行兩次轉(zhuǎn)板純化。將所有純化的培養(yǎng)物按照采集地點、采集時間和標本號進行統(tǒng)一編號，保存于4℃冰箱。

1.2.2 致病性接種試驗

將活化好的yts-01、yts-02 接種于PDB 培養(yǎng)基中，28℃、120 r/min 培養(yǎng)72 h，經(jīng)過濾將菌絲體除去，制成yts-01 和yts-02 的孢子懸液。選用健康的2年生櫻桃樹苗作為供試材料，一共30 株，分成3 組，分別做如下處理：在同一高度處用接種針進行扎孔處理：①在傷口處接種yts-01 孢子懸液；②在傷口處接種yts-02 孢子懸液；③在傷口處接種無菌水作為對照。選擇的櫻桃樹有一定的間隔，防止試驗過程交叉感染。每隔5 d 觀察發(fā)病狀況。

1.2.3 病原菌形態(tài)特征觀察

將活化好的病原菌接種于PDA 培養(yǎng)基上，進行形態(tài)特征觀察，主要包括菌落形態(tài)、生長速度、顏色等；制作切片在顯微鏡下對其分生孢子形態(tài)、大小等特征進行觀察。

1.2.4 病原菌分子生物學(xué)鑒定

將分離后獲得的病原菌純培養(yǎng)體送至山東森琪生物技術(shù)有限公司進行ITS 序列測序。將測的序列在在線GenBank 核酸數(shù)據(jù)庫中進行Blast 分析，得到相關(guān)性序列，利用MEGA7 軟件構(gòu)建yts-01 系統(tǒng)進化樹，并進行yts-01 系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.3 熒光假單胞桿菌GH2-1 對櫻桃枝干病害病原的抑制作用

1.3.1 櫻桃枝干病害病原高效拮抗菌株篩選

利用平板對峙培養(yǎng)法，對高效拮抗櫻桃枝干病害病原越橘間座殼（Diaporthe vaccinii）的拮抗菌株進行篩選。

將實驗室已保存的14 株待測拮抗菌株于NA 培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，28℃恒溫培養(yǎng)24 h；用接種環(huán)挑取一環(huán)菌苔接種于含10 mL NB 培養(yǎng)基的50 mL 三角瓶中，于28℃搖床中120 r/min 均勻震蕩36 h，得到待選菌株的活化菌液。將越橘間座殼于PDA 培養(yǎng)基上進行活化培養(yǎng)，28℃恒溫培養(yǎng)60 h。用打孔器在活化好的櫻桃枝干病害菌邊緣打取直徑為5 mm 的菌餅，接種在PDA 平板中央；在距中央2.0 cm 的兩側(cè)用移液槍接10 μL 待選菌液；對照組在另外兩側(cè)相同距離處接種10 μL NB 培養(yǎng)基。每一處理重復(fù)3 次。處理完成后，28℃恒溫培養(yǎng)，逐日觀察待選菌株對越橘間座殼的抑制作用；待對照組病原菌長滿平板后，測量實驗組病斑的大小，并計算抑菌率。

抑菌率=[（對照菌落直徑-菌餅直徑）-(處理菌落直徑-菌餅直徑)]/（對照菌落直徑-菌餅直徑）×100%。

1.3.2 熒光假單胞桿菌GH2-1、發(fā)酵上清液及所產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)對櫻桃枝干病害病原的抑制效果

采用平板對峙法檢測熒光假單胞桿菌GH2-1 對櫻桃枝干病害病原生長的抑制效果。實驗方法同1.3.1。

采用含毒介質(zhì)法檢測熒光假單胞桿菌GH2-1 發(fā)酵上清液對櫻桃枝干病害病原生長的抑制效果。將熒光假單胞桿菌GH2-1 發(fā)酵上清液與PDA 固體培養(yǎng)基按照1:10 的比例充分混合，制成含毒平板；將櫻桃枝干病害病原菌餅接種于平板中央，對照用無菌水代替，每個處理重復(fù)3 次。后續(xù)實驗同上。

采用倒扣平板法檢測熒光假單胞桿菌GH2-1 所產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)對櫻桃枝干病害病原生長的抑制效果。對照組：將櫻桃枝干病害病原的菌餅接于PDA 平板中央并倒扣于LB 固體平板上，封口。實驗組：吸取100 μL熒光假單胞桿菌GH2-1 菌液于PDA 平板上，用滅菌的涂布棒均勻涂開，于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將櫻桃枝干病害病原菌餅接于PDA 平板中央并倒扣于熒光假單胞桿菌GH2-1 平板上，封口，于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每一處理重復(fù)3 次。后續(xù)實驗同上。

1.4 熒光假單胞菌GH2-1 液體制劑對櫻桃枝干病害防治效果

1.4.1 供試藥劑

GH2-1 液體制劑300 倍稀釋液。

1.4.2 供試材料與防治對象

供試材料為櫻桃幼苗，品種為 ‘紅寶石’；防治對象為櫻桃枝干病害，病原越橘間座殼（Diaporthe vaccinii）。

1.4.3 試驗地情況

試驗地設(shè)在濰坊市臨朐縣櫻桃產(chǎn)區(qū)。往年櫻桃枝干病害在該地發(fā)病嚴重，特別是櫻桃苗移栽后因感染櫻桃枝干病害成活率較低；我們于2020年3月15日、3月31日和4月15日進行林間防治櫻桃枝干病害試驗。所有試驗小區(qū)栽培條件及管理措施一致，施藥時櫻桃枝干病害處于發(fā)病初期。

1.4.4 試驗設(shè)計及安排

本試驗設(shè)計了熒光假單胞菌GH2-1 液體制劑300 倍稀釋液和不施藥清水做對照共2 個處理，每個小區(qū)200 m2，重復(fù)3 次，共6 個小區(qū)，各小區(qū)隨機排列。共施藥2 次，第1 次于2020年3月15日進行浸根處理；移栽緩苗15 d 后于2020年3月31日第2 次施藥，本次方式為灌根，每一小區(qū)施用量100 kg；4月15 第3 次

施藥，本次方式為噴霧，每一小區(qū)施用量15 kg；5月中旬進行發(fā)病情況調(diào)查。

1.4.5 試驗調(diào)查及計算方法

最后1 次用藥間隔30 d 后統(tǒng)計發(fā)病狀況，并計算防治效果。

櫻桃枝干病害發(fā)病級數(shù)參照表1，以單株為單位。

表1 櫻桃枝干病害發(fā)病分級標準Table 1 Classification standard of cherry stem disease

藥效按式①、②計算：

病情指數(shù)DI（%）=[∑（病級數(shù)）×該級發(fā)病植株數(shù)）]/[（病級最高值×調(diào)查總株數(shù)）]×100%①

防治效果（%）=（對照病級指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100%②

2 結(jié)果與分析

2.1 櫻桃枝干病調(diào)查結(jié)果

2.1.1 櫻桃枝干病危害情況

在連續(xù)2年的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，櫻桃枝干病害在3年以內(nèi)樹齡的幼林中發(fā)病嚴重，特別是對剛移栽的櫻桃幼苗危害尤為嚴重；4月進入發(fā)病高峰。通過實地調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在調(diào)查的全部幼林中，發(fā)病嚴重地區(qū)占40%左右，此病區(qū)櫻桃感病率高達80%以上，死株率約50%以上，特別嚴重的幾乎全部死亡。

2.1.2 櫻桃枝干病病癥特征

櫻桃枝干病發(fā)病后，樹干表面有明顯內(nèi)陷區(qū)域，明顯感到樹皮與樹干分離；但初發(fā)病源顏色變化不明顯；進一步觀察發(fā)現(xiàn)，病原侵染后，發(fā)病部位由木質(zhì)部向韌皮部擴展逐漸變黑腐爛，也可由韌皮部向木質(zhì)部擴展變黑腐爛，還表現(xiàn)在由近根處向遠根處進行擴展，最終導(dǎo)致主桿或側(cè)枝干枯（圖1）。

為了進一步確定櫻桃枝干枯死是由病原菌感染所致，我們將部分樣品噴灑無菌水保濕，3 天后發(fā)現(xiàn)在枝段橫切木質(zhì)部有大量真菌生長（圖2）。

圖2 感病枝段木質(zhì)部真菌生長狀況Figure 2 Growth status of xylem fungi in susceptible branches

2.2 病原菌分離培養(yǎng)及鑒定

2.2.1 病原菌分離培養(yǎng)

利用真菌分離技術(shù)將采集送回的142 個枝段樣品進行病原菌分離純化，共分離314 株真菌。經(jīng)平板培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，所有分離菌株分為兩種菌落形態(tài)，其中289 株菌落形態(tài)一致，編號為yts-01；剩余25 株菌落形態(tài)一致，編號為yts-02。由此，我們初步推測yts-01 為櫻桃枝干病害的病原菌。

2.2.2 致病性接種試驗

由于致病性接種試驗期間溫度和濕度處于發(fā)病最佳條件，在處理10 d 后即可觀察到接種部位發(fā)生變化。結(jié)果顯示，接種yts-01 孢子懸浮液的櫻桃全部發(fā)病，在接種處出現(xiàn)褐色病斑且該區(qū)域明顯內(nèi)陷；接種yts-02 和無菌水的櫻桃均不發(fā)病。

對發(fā)病的部位取樣進行病原菌的分離培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)分離到的菌株菌落形態(tài)與試驗菌株yts-01一致，符合柯赫氏法則。以上結(jié)果證實yts-01 為櫻桃枝干病害的病原菌。

2.2.3 病原菌形態(tài)特征觀察

接種在PDA 培養(yǎng)基上的yts-01 菌落生長速度快，平均生長速度為1.5 cm/d，6 d 左右基本長滿平板（圖3-A）。菌落初期為白色、圓形，氣生菌絲疏松不緊密，隨著生長，出現(xiàn)不規(guī)則同心圓（圖3-A）。后期，在同心圓上生長出子座（生長第6 d開始出現(xiàn)），且菌落表面變灰色（圖3-B，圖3-C）。

圖3 yts-01 菌落培養(yǎng)特征Figure 3 Colony culture characteristics of yts-01

分生孢子梗較短或分化不明顯，分生孢子串生于分生孢子梗上，呈現(xiàn)圓形、橢圓、長圓柱等形狀，長度5～7 μm（圖4）。

圖4 yts-01 分生孢子Figure Conidia of yts-01

2.2.4 病原菌分子生物學(xué)鑒定

我們將測序結(jié)果與GenBank 中收錄的DNA 序列進行比對，并建立yts-01 進化樹。結(jié)果說明，櫻桃枝干病病原菌yts-01 與Diaporthe vaccinii（Accession No.LC206678）聚成一支，同源性最高（圖5）。

圖5 yts-01 系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 5 Phylogenetic tree of yts-01

因此，綜合菌株的ITS 序列分析與形態(tài)學(xué)特征，鑒定yts-01 為越橘間座殼（Diaporthe vaccinii）。

2.3 熒光假單胞桿菌GH2-1 對櫻桃枝干病害病原的抑制作用

2.3.1 櫻桃枝干病害病原高效拮抗菌株篩選

結(jié)果顯示，在實驗例1 中分離到的14 株菌中，有6 株菌對櫻桃枝干病害菌生長有抑制效果，分別為GH2-1、GH2-2、GH2-4、GH2-5、GH2-6 和GH2-9（表2）；通過對不同菌株抑菌率計算統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，菌株GH2-1 對櫻桃枝干病害菌抑制效果高達90.98%，顯著高于其他菌株（表2）。

表2 不同菌株抑菌率統(tǒng)計Table 2 Statistics of bacteriostasis rate of different strains

前期，我們已鑒定GH2-1 為熒光假單胞菌，故結(jié)合上述抑菌率結(jié)果，選擇熒光假單胞菌GH2-1 為研究對象進行后續(xù)相關(guān)研究。

2.3.2 熒光假單胞桿菌GH2-1、發(fā)酵上清液及所產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)對櫻桃枝干病害病原的抑制效果

從圖6可以看出，熒光假單胞桿菌GH2-1、發(fā)酵上清液及其所產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)和對櫻桃枝干病害病原的生長有明顯的抑制效果（圖6A、B、C）；抑制后的櫻桃枝干病害病原菌落直徑顯著低于對照（圖6D、E、F）；抑菌率分別為94.49%、62.51%和72.41%。以上結(jié)果說明，熒光假單胞桿菌GH2-1 及其產(chǎn)物能夠高效抑制櫻桃枝干病害病原的生長。

圖6 熒光假單胞桿菌GH2-1 及其發(fā)酵產(chǎn)物對櫻桃枝干病害病原生長的抑制效果（結(jié)果顯示為平均值±標準差（n≥3）。**p＜0.01）Figure 6 Inhibitory effect of Pseudomonas fluorescens GH2-1 and its products on the growth of cherry stem disease pathogens

2.4 熒光假單胞菌GH2-1 液體制劑對櫻桃枝干病害防治效果

表3結(jié)果表明，最后一次施藥后30 d 后，熒光假單胞菌（P.fluorescens）菌株GH2-1 液體制劑對櫻桃枝干病害有較好的防治效果，防治效果為74.3%。這進一步說明菌株GH2-1 在櫻桃枝干病害防治中具有廣泛應(yīng)用前景。

表3 各個處理后櫻桃枝干病害的發(fā)病指數(shù)及防治效果Table 3 Disease index and control effect of cherry branch disease after each treatment

3 結(jié)論與討論

有文獻報道，越橘間座殼（Diaporthe vaccinii）能夠引起核桃枝枯病、藍莓枝枯病的發(fā)生，但未見越橘間座殼引起櫻桃枝干病害的報道[12-13]。本文從感染櫻桃枝干病的櫻桃枯枝中分離到病原yts-01，通過柯赫氏法則驗證該菌株為櫻桃枝干病害的病原，利用形態(tài)特征觀察及分子生物學(xué)鑒定確定yts-01 為越橘間座殼。由越橘間座殼引起櫻桃枝干病害為首次發(fā)現(xiàn)。鑒于該病具有傳染性強、危害范圍廣、傳播隱匿等特點，應(yīng)對其生物學(xué)特性和發(fā)生發(fā)展規(guī)律進行深入研究，為后續(xù)病害防治提供更多理論依據(jù)。

生物防治因其具有環(huán)保、安全、有效、可持續(xù)等特點成為目前植物病害防治研究熱點[14-15]。本文在確定越橘間座殼為櫻桃枝干病害的病原的基礎(chǔ)上，通過平板對峙實驗篩選了對該病害病原有高效抑制效果的熒光假單胞桿菌GH2-1；并對熒光假單胞菌GH2-1 的拮抗功能進行了初步研究。結(jié)果表明，熒光假單胞桿菌GH2-1、發(fā)酵上清液及其所產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)和對櫻桃枝干病害病原的生長有明顯的抑制效果（圖6A、B、C）；抑制后的櫻桃枝干病害病原菌落直徑分別顯著低于對照 （圖6D、E、F）；抑菌率分別為94.49%、62.51%和72.41%。這表明，熒光假單胞桿菌GH2-1 及其產(chǎn)物能夠高效抑制櫻桃枝干病害病原的生長，但對于發(fā)揮作用的具體物質(zhì)以及作用原理還需進一步研究。

眾所周知，外界非生物因素以及寄主、其他微生物等生物因素都會嚴重影響微生物生防制劑在田間防效的穩(wěn)定性，致使其優(yōu)勢難以長時間保持[16]。本文初步研究了熒光假單胞桿菌GH2-1 對櫻桃枝干病害田間防效，結(jié)果表明，熒光假單胞菌GH2-1 液體制劑在櫻桃枝干病害防治中具有廣泛應(yīng)用前景。后期，還需要根據(jù)櫻桃枝干病害的發(fā)病特點以及熒光假單胞桿菌GH2-1 用藥方式選擇合適的劑型制成微生物菌劑，為櫻桃枝干病害生物防治做出更大貢獻。