基于高通量測序的巨菌草根系固氮菌群組成及其促生性能分析

陳小紅, 張 雪, 劉家敏, 李 晶, 林標聲,,4

(1.龍巖學院生命科學學院，福建 龍巖 364012；2.福建農(nóng)林大學生命科學學院，福建 福州 350002；3.國家菌草工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002；4.預(yù)防獸醫(yī)學與生物技術(shù)福建省高等學校重點實驗室，福建 龍巖 364012)

菌草技術(shù)是“以草代木”發(fā)展起來的中國特有技術(shù)[1].該技術(shù)已推廣至全球100多個國家，在中國“脫貧攻堅戰(zhàn)”中發(fā)揮了重要作用.巨菌草(Pennisetumgiganteum)是菌草中最重要的代表，其隸屬于禾本科(Poaceae)狼尾草屬(Pennisetum)，最早于2005年從南非夸納省引進，至今在中國已有26年的種植歷史[2].目前，巨菌草主要在中國西部的青海、新疆、內(nèi)蒙古等地的沙漠、鹽堿地和沙地等種植，其產(chǎn)量高(最高可達150 t·hm-2左右)、植株高大(最高可達十幾米)、抗逆性強，是防風固沙、水土保持的優(yōu)良草種[3-4].巨菌草在此類貧瘠地生長旺盛，且能顯著增加土壤微生物群落多樣性，提高土壤肥力，推測可能是其中與植物互作的固氮菌在起作用[5-6].有關(guān)巨菌草固氮菌的研究主要集中在內(nèi)生固氮菌的菌群組成、分離及鑒定方面[7-8]，而其根系固氮菌還未見報道.因此，本研究采用高通量測序技術(shù)(high-throughput sequencing)分析巨菌草根系固氮菌群組成，研究其主要固氮菌的促生性能，以期為挖掘巨菌草根系固氮菌資源、提高菌草生物質(zhì)產(chǎn)量及研發(fā)微生物固氮菌肥提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

菌草：采自福建省龍巖市龍巖學院作物種植基地.

玉米種子：蘇科甜1506品種，由山東壽禾種業(yè)有限公司提供.

培養(yǎng)基：Ashby無氮培養(yǎng)基，用于固氮菌株的篩選，具體配方見文獻[9]，固體培養(yǎng)基加2%瓊脂；無機磷和有機磷培養(yǎng)基，用于固氮菌的解磷能力試驗，具體配方見文獻[10]；CAS培養(yǎng)基，用于檢測菌株產(chǎn)鐵載體能力，具體配方見文獻[11].

試劑盒：ELISA試劑盒、細菌吲哚乙酸(indole-3-acetic acid, IAA)ELISA試劑盒，購自上海羽朵生物科技有限公司；OMEGA試劑盒，購自北京諾博萊德科技有限公司.

1.2 方法

1.2.1 樣本采集及高通量測序分析 在種植基地，按S型原則進行布點，選取5株間距大于1 m的巨菌草作為取樣點.小心挖掘每個取樣點的巨菌草植株的完整根系，抖落大塊土壤，收集根系表面虛土作為根表土壤樣本；采用滅菌小刀刮取抖土后的植株根表，所刮取物質(zhì)作為根表樣本；同時，取距植株根1 cm左右的土壤作為根圍土壤樣本.5個取樣點同一類型樣本裝入同一無菌塑料袋中，混合均勻后封口，待用.

按照OMEGA試劑盒說明書提取各樣本細菌基因組總DNA，選擇360 bp片段作為各樣本固氮功能基因nifH的PCR擴增片段.引物序列為nifH-F(5′-AAAGGYGGWATCGGYAARTCCACCAC-3′)/nifH-R(5′-TTGTTSGCSGCRTACATSGCCATCAT-3′).PCR反應(yīng)體系(25 μL)：5×GC Buffer 5 μL，5×Reaction buffer 5 μL，DNA模板2 μL，上游引物(10 μmol·L-1)1 μL，下游引物(10 μmol·L-1) 1 μL，dNTP(2.5 mmol·L-1) 2μL，Q5 DNA Polymerase(2 U·μL-1) 0.25 μL和ddH2O 8.75 μL.PCR反應(yīng)條件：98 ℃，2 min；98 ℃，15 s；55 ℃，30 s；72 ℃，30 s；35個循環(huán)；72 ℃，5 min.所得目的基因片段經(jīng)1%(質(zhì)量分數(shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測，純化回收后經(jīng)高通量測序平臺(Miseq-Illumina)進行序列測定和分析(委托北京奧維森生物科技有限公司完成)，采用CD-HIT分類方法對所得序列進行歸類，通過序列豐度分析各樣本的固氮菌群組成[12].此外，根據(jù)屬水平上的豐度信息，利用R軟件(vegan包)進行主成分分析(principal component analysis, PCA)，比較各樣本間固氮菌群的相似性[13].

1.2.2 固氮菌的分離與純化 用滅菌小刀刮取根表樣品1 g，放入9 mL無菌水中；用無菌鏟子分別取根表土壤、根圍土壤樣本10 g，放入90 mL無菌水中；各樣本混合均勻，制成菌懸液，分別進行梯度稀釋后，取0.1 mL菌液涂布于無氮培養(yǎng)基中，30 ℃倒置培養(yǎng)24～48 h，統(tǒng)計各樣本固氮菌落數(shù).每個樣品取樣3次，求平均值.

分別挑選各樣本中菌落數(shù)占比較高、長勢旺盛的5個典型菌落，記錄各菌落的基本形態(tài)特征，并測定固氮酶活性(ELISA試劑盒測定).選擇固氮酶活性較高的菌株，通過平板劃線法在無氮固體培養(yǎng)基中進行純化后保存，待用[14].

1.2.3 固氮菌株的篩選 聚類分析：將所挑選的菌株接入無氮培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，收集各菌株菌液，按譚志遠等[15]的方法提取菌液的全細胞蛋白，通過SDS-PAGE全細胞蛋白電泳聚類分析確定所挑選菌株的類群關(guān)系.

生理生化特性的鑒定：按照文獻[16]的方法測定.

溶磷性能的測定：將分離菌分別接種于無機磷和有機磷培養(yǎng)基中，通過溶磷圈大小評定其溶磷性能[10].

產(chǎn)鐵載體能力的測定：將分離菌采用點接種法接種于CAS培養(yǎng)基中，通過溶解圈大小判定其產(chǎn)鐵載體能力[11].

1.2.4 所篩選固氮菌的16S rDNA序列鑒定 采用細菌通用引物27F對所篩選固氮菌株的16S rDNA序列進行鑒定.PCR反應(yīng)總體系50 μL：模板DNA 2 μL，2×TsingKE Master Mix 25 μL，上游引物(10 μmol·L-1) 1 μL，下游引物(10 μmol·L-1)1 μL和ddH2O 21 μL.PCR反應(yīng)程序：94 ℃，10 min；94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃， 1.5 min；30個循環(huán)；72 ℃，10 min.所得序列經(jīng)NCBI 數(shù)據(jù)庫比對，用DNAMAN V6軟件構(gòu)建同源關(guān)系樹，確定菌株分類地位[17].

1.2.5 所篩選固氮菌的促生性能測定 水培玉米促生試驗[18]：將玉米種子用0.1%(質(zhì)量分數(shù))升汞表面消毒30 min后浸泡催芽3～4 d，挑選芽長勢一致的玉米種子，將其浸泡在對數(shù)生長期(濃度約為108CFU·mL-1)的固氮菌培養(yǎng)液中，浸泡時間12～20 h，以浸泡清水為對照.將各處理組的玉米種子置于50 mL無菌水中培養(yǎng)，每組6個塑料杯，每杯1粒，培養(yǎng)10 d.記錄各組玉米幼苗的株高、根長、分根數(shù).

盆栽玉米促生試驗[19]：將玉米種子表面消毒后浸泡催芽、出苗，挑選長勢基本一致的幼苗，置于固氮菌培養(yǎng)液(108CFU·mL-1)中浸泡12～20 h，以浸泡清水為對照.將各處理組幼苗移栽至已滅菌的土壤中，每組6盆，每盆1株，移栽5 d后再次澆灌5 mL左右菌液，10 d后統(tǒng)計玉米苗株高.

2 結(jié)果與分析

2.1 巨菌草根系的固氮菌群組成

3個樣本固氮功能基因nifH的PCR擴增結(jié)果如圖1所示，各樣本序列大小均為360 bp左右.經(jīng)高通量測序平臺測序，3個樣本共獲得4萬～5萬多條Index完全匹配的有效序列，再采用CD-HIT分類方法對所獲得的序列進行歸類注釋，結(jié)果如圖2所示.門分類水平上，各樣本中豐度最高的菌均為變形菌門(Proteobacteria)和藍藻菌門(Cyanobacteria)，放線菌門(Actinobacteria)、螺旋體門(Spirochaetes)、硬壁菌門(Bacteroidetes)、擬桿菌門(Firmicutes)、酸桿菌門(Acidobacteria)等在不同樣本也有少量分布(圖2A).屬分類水平上，豐度較高的菌為慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、科薩克氏菌屬(Kosakonia)、固氮螺菌屬(Azospirillum)和克雷伯氏菌屬(Klebsiella)，其中，根表的固氮菌群種類和豐度明顯高于其他兩個樣本(圖2B).此外，PCA表明，3個樣本的固氮菌群組成差別較大(圖3).

M.DL5 000 plus DNA marker.圖1 根系各樣本nifH基因擴增Fig.1 Amplification of nifH gene in root samples

圖2 門(A)和屬(B)水平上根系各樣本主要固氮菌的組成Fig.2 Composition of main nitrogen-fixing bacteria from root samples at the phylum level (A) and genus level (B)

2.2 巨菌草根系的固氮菌分離數(shù)

巨菌草根系各樣本固氮菌分離數(shù)見圖4，從根表、根表土壤、根圍土壤分別分離到4.5×105、4.0×104、5.4×103CFU·g-1固氮菌.其中，根表固氮菌含量最為豐富，與高通量測序結(jié)果一致.

2.3 巨菌草根系主要固氮菌的篩選與鑒定

2.3.1 固氮菌的基本形態(tài)特征和固氮酶活性 從3個樣本中各挑選5個占比較高、長勢旺盛的典型菌落，其菌落形態(tài)和固氮酶活性如表1所示.

表1 固氮菌株菌落形態(tài)特征及固氮酶活性Table 1 Nitrogenase activity and morphological characteristics of consortium of nitrogen-fixing bacteria

2.3.2 固氮菌SDS-PAGE全細胞蛋白電泳聚類分析 經(jīng)SDS-PAGE全細胞蛋白電泳聚類分析(圖5)，所篩選的15株固氮菌可分為7個類群.

圖5 根系各樣本分離固氮菌的SDS-PAGE全細胞蛋白電泳聚類分析Fig.5 Cluster analysis on whole cell proteins of nitrogen-fixing bacteria isolated from root samples by SDS-PAGE electrophoresis

2.3.3 固氮菌的生理生化特性及溶磷和產(chǎn)鐵載體能力 結(jié)合聚類分析和固氮酶活性結(jié)果，挑選7個代表菌株進行生理生化特性及溶磷和產(chǎn)鐵載體能力測定，結(jié)果如表2所示.除9#菌株外，其他菌株均具有產(chǎn)氨能力.其中，2#和4#菌株在生長代謝過程中能分解蛋白胨中的色氨酸產(chǎn)生吲哚(吲哚試驗)，能分解有毒的過氧化氫(過氧化氫酶試驗)，能將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽和氨(NO3-還原試驗)，且具有較強產(chǎn)鐵載體能力和溶磷能力.因此，對2#和4#菌株做進一步鑒定，并用于后續(xù)促生試驗.

表2 固氮菌的生理生化特性及溶磷和產(chǎn)鐵載體能力1)Table 2 Physiological and biochemical characteristics, phosphorus-dissolving and iron carrier-producing capacities of nitrogen-fixing bacteria

2.3.4 固氮菌的16S rDNA序列鑒定 對代表菌株2#和4#進行PCR擴增，得到的條帶大小在1 600 bp左右(圖6).將其純化后送檢測序，得到的16S rDNA序列與NCBI下載的同源序列進行比對，并構(gòu)建同源關(guān)系樹(圖7).結(jié)果表明，2#菌株為科薩克氏菌(Kosakoniaradicincitans)，4#菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，其同源性均為100%.

M.DL2 000 plus DNA marker.圖6 2#和4#固氮菌PCR擴增電泳結(jié)果Fig.6 Electropherogram of PCR amplified 16S rDNA from nitrogen-fixing bacteria 2# and 4#

圖7 2#(A)和4#(B)固氮菌16S rDNA基因序列同源關(guān)系樹Fig.7 Phylogenetic tree of nitrogen-fixing bacteria 2# (A) and 4# (B) based on 16S rDNA sequencing

2.4 巨菌草根系固氮菌的促生性能

如表3所示，與對照組相比，經(jīng)過2種固氮菌處理的水培玉米幼苗株高、根長、分根數(shù)均有一定程度的增加，其中，2#處理組的株高、分根數(shù)及4#處理組的分根數(shù)與對照組差異達顯著水平(P<0.05).2#和4#固氮菌處理的盆栽玉米株高均顯著增加(P<0.05).

表3 2#和4#固氮菌的促生性能1)Table 3 Growth-promoting effect of nitrogen-fixing bacteria 2# and 4#

3 討論

目前，針對土壤根系固氮菌的研究主要集中在豆科植物[20]，而有關(guān)禾本科植物巨菌草根系固氮菌的報道較少.本試驗采用高通量測序技術(shù)研究了巨菌草根系固氮菌群的分布情況，結(jié)果表明：巨菌草根系存在豐富的固氮菌群，但根表、根表土壤和根圍土壤3個樣本的菌群分布差異較大；藍藻菌門和變形菌門為巨菌草根系固氮菌的主要門類；慢生根瘤菌屬、芽孢桿菌屬、科薩克氏菌屬為核心屬.而本團隊前期研究表明，巨菌草中存在豐富的內(nèi)生固氮菌群，其中，克雷伯氏菌屬細菌占比最高[12].這表明巨菌草根系固氮菌群組成和分布與內(nèi)生固氮菌有較大區(qū)別.通過無氮培養(yǎng)基從巨菌草根表、根表土壤和根圍土壤中分別分離獲得4.5×105、4.0×104和5.4×103CFU·g-1固氮菌，根表的固氮菌群種類和數(shù)量明顯高于其他兩個樣本.這表明相對于土壤，固氮菌可能更趨向富集于植物根表，以增強與植物的互作效應(yīng)，促進植物生長；根表可成為巨菌草根系固氮菌特定種類的重要來源.從3個樣本中分離到15株固氮菌，經(jīng)SDS-PAGE全細胞蛋白電泳聚類分析將其分為7個類群，結(jié)合生理生化特性及溶磷和產(chǎn)鐵載體能力測定，最終選定2#和4#菌株作為巨菌草根系的代表固氮菌.經(jīng)16S rDNA序列鑒定，2#和4#菌株分別為科薩克氏菌和枯草芽孢桿菌；經(jīng)玉米水培和盆栽試驗驗證，這兩株菌株均具有一定的促生性能，有利于玉米株高、根長、分根數(shù)的增加.科薩克氏菌和枯草芽孢桿菌是近年來報道較多的對玉米具有良好促生作用的根際固氮菌[21-22]，研究主要集中在這兩種菌的生物學特性和促生性能，有關(guān)其實際固氮效率和安全性能還有待進一步研究.