連栽杉木林土壤叢枝菌根真菌的多樣性

陳艷芳, 文竹梅, 屈 峰, 劉青青, 邢先雙, 羅 航, 李夢琪, 陳 杭, 劉 博,4

(1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福建 福州 350002；2.曲阜市國有石門寺林場，山東 曲阜 273100；3.山東省水文中心，山東 濟南 250002；4.曲阜師范大學(xué)，山東 曲阜 273100)

杉木(Cunninghamialanceolata)是我國南方重要的用材樹種之一，具有生長快、產(chǎn)量高、材質(zhì)好等特點，被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)生活各個領(lǐng)域[1]，在我國森林資源中占有非常重要的地位.近年來，隨著杉木連栽代數(shù)的不斷增加，杉木林土壤理化性質(zhì)逐漸惡化，地力衰退，生產(chǎn)力下降[2-3]，嚴(yán)重影響了杉木林的可持續(xù)經(jīng)營和發(fā)展.為此，國內(nèi)外進行了大量的研究，但以往研究主要集中在土壤理化因子[4]、養(yǎng)分歸還[5-6]、化學(xué)計量特征[7]等方面，而對土壤系統(tǒng)中的微生物研究相對較少.微生物在林地生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，對林地生產(chǎn)力和養(yǎng)分循環(huán)產(chǎn)生重要影響，并且微生物對環(huán)境的依賴性較強，任何細(xì)微的環(huán)境變化都會對微生物的多樣性和群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較大影響[8].

叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi, AMF)是一種廣泛存在于陸地生態(tài)系統(tǒng)的共生菌，是土壤生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分[9,10].AMF作為直接聯(lián)系土壤和植物根系的一類微生物，利用根外菌絲將植物根系與土壤緊密地聯(lián)系在一起，對土壤變化敏感.AMF群落結(jié)構(gòu)會受到土壤理化性質(zhì)的影響，如土壤全氮、有機質(zhì)等能促進AMF的生長發(fā)育，土壤速效磷和無機氮能為AMF生長繁衍提供營養(yǎng)物質(zhì)[11,12].同時AMF也是維持林地肥力和林木生產(chǎn)力的重要生物因子[13].

已有學(xué)者對杉木林AMF開展了研究[14-15].但在連栽杉木林經(jīng)營過程中，AMF對不同連栽代數(shù)杉木林土壤質(zhì)量變化的響應(yīng)機制尚未明確，由此亟需進一步分析連栽代數(shù)杉木林對AMF群落分布的影響，揭示不同連栽代數(shù)杉木林AMF群落特征.鑒于此，本研究選取不同連栽代數(shù)(一、二、三、四代)的杉木林為研究對象，針對不同連栽代數(shù)杉木林，應(yīng)用高通量基因測序技術(shù)對土壤AMF群落組成進行研究，探討杉木連栽過程中AMF群落組成和多樣性的變化，分析AMF群落多樣性與土壤因子的關(guān)系，以期為高效培育杉木林提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 研究地概況

試驗地位于福建省南平市延平區(qū)王臺鎮(zhèn)溪后村安槽下(26°39′N，117°55′E).該地區(qū)為亞熱帶季風(fēng)氣候，平均海拔200 m，年均氣溫19.3 ℃.全年平均降雨量1 700 mm，降雨主要集中于3—8月，年均蒸發(fā)量為1 413 mm.樣地土壤質(zhì)地為砂質(zhì)粘土或粘土.林下主要物種有Dicranopterisdichotoma、Miscanthusfloridulus、Woodwardiajaponica、Blechnumorientale、Alpiniachinensis等.

1.2 樣地設(shè)置與土樣采集

于2020年12月在研究區(qū)選取海拔、坡度，土壤類型及立地條件相近的一代林(G1，17年)、二代林(G2，17年)、三代林(G3，18年)和四代林(G4，15年)4個不同連栽代數(shù)的杉木林.每個樣地設(shè)置3個20 m×20 m的樣地，樣地基本情況見表1.在每個樣地內(nèi)按五點取樣法選取5棵長勢相近的杉木，清除土壤表面凋落物，采集其0～20 cm的土壤，將同一樣方內(nèi)5棵杉木土壤均勻混合為一個樣本，裝入帶有編號的自封袋中，并置于有冰袋的保溫箱中保存.所采土樣帶回實驗室后，立即過2 mm土壤篩，并分為兩份，一份置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?，用于測定土壤AMF多樣性；另一份自然風(fēng)干，用于測定土壤的理化性質(zhì).

表1 樣地基本情況 Table 1 Basic information of the sample plots

1.3 AMF多樣性測定

采用Illumina MiSeq高通量基因組測序方法測定AMF多樣性.由北京奧維森基因科技有限公司進行測序，測序流程如下：采用土壤基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司提供)提取土壤中AMF的DNA.第一輪擴增引物為AML1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGA-3′)和AML2(5′-GTCGTTTAAAGCCATT ACGTC-3′)；第二輪擴增引物為AMV4.5NF(5′-TTGAAAGGGAAACGATTGAAGT-3′)和AMDGR(5′-TACGTCAACATCCTTAACGAA-3′).PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 5 s，58 ℃ 6 s，72 ℃ 10 s，30個循環(huán)；72 ℃ 7 min.第二輪PCR擴增體系：94 ℃ 5 min，94 ℃ 5 s，58 ℃ 6 s，72 ℃ 10 s，30個循環(huán)；72 ℃ 7 min；4 ℃保存.兩次擴增得到的產(chǎn)物均采用1.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測，純化后使用Miseq PE300上機測序.

1.4 土壤理化性質(zhì)測定

土壤pH值采用電位法(水土比2.5∶1)測定；土壤有機質(zhì)含量采用重鉻酸鉀容量法(外加熱)測定；全碳和全氮含量采用德國Elementar, Vario Max元素分析儀測定；土壤全磷含量采用鉬銻抗比色法測定；土壤速效磷含量測定采用雙酸浸提法；土壤速效鉀含量采用火焰光度計法測定；硝態(tài)氮、銨態(tài)氮含量采用全自動連續(xù)流動分析儀(AA3 SEAL Analytical，荷蘭)測定.

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 19.0軟件對所有試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和最小顯著差法(LSD)進行顯著性檢驗，顯著水平為0.05.采用Canoco 4.5對AMF、多樣性指數(shù)與土壤因子之間的關(guān)系進行冗余分析(redundancy analysis, RDA).最后利用Origin 9.0軟件作圖，圖表中數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同連栽代數(shù)杉木林土壤AMF群落OTUs的組成及結(jié)構(gòu)

由圖1可知，抽取的序列數(shù)達到27 000條以上，且隨著測序條數(shù)的增加，各處理土壤AMF稀釋曲線趨于平緩.說明不同處理的土壤樣本測序數(shù)據(jù)量足夠大，測得的數(shù)據(jù)能反映土壤中AMF群落的真實情況，可對AMF群落組成及多樣性進行分析；但仍有少量AMF種類未被發(fā)現(xiàn).本研究從不同連栽代數(shù)杉木林土壤中共得到1 314 765條有效序列.

從圖2可看出不同連栽代數(shù)杉木林土壤AMF群落OTUs組成的差異及共有物種的情況.從圖2可知，所有樣本中共檢測到1 340個OTUs，第一代(G1)、第二代(G2)、第三代(G3)和第四代(G4)分別有729、881、984和962個OTUs，分別占總OTUs數(shù)的54.40%、65.75%、73.43%和71.79%.第一代中特有的AMF群落OTUs占總OTUs序列數(shù)的2.54%，第二代中特有的AMF群落OTUs占7.54%，第三代中特有的AMF群落OTUs占8.36%，第四代中特有的AMF群落OTUs占1.87%.此外，第一代與第二代間共有OTUs數(shù)為533個(39.78%)，第二代與第三代共有的OTUs數(shù)量為615個(45.90%)，第三代與第四代共有的OTUs數(shù)量為779個(58.13%)，4個連栽代數(shù)間共有406個OTUs，占總OTUs序列數(shù)的30.30%.

2.2 不同連栽代數(shù)杉木林土壤AMF群落的多樣性

由表2可知，第二代杉木林AMF多樣性指數(shù)均高于其它代數(shù)，其次為第三代.

表2 不同連栽代數(shù)杉木林土壤AMF Alpha多樣性分析1) Table 2 α diversity index of soil AMF community under C.lanceolata plantations planted in different rotations

通過高通量測序，不同連栽代數(shù)杉木林土壤樣本共檢測1 340個AMF-OTUs.其中，相對豐度前三的屬分別為Glomus、Rhizophagus和Rhizoglomus.由圖3可以看出，Glomus屬是杉木林各代數(shù)的優(yōu)勢屬，第一代到第四代相對豐度分別為99.04%、98.45%、97.25%和91.21%，且隨著代數(shù)的增加而減少.根孢囊霉屬第一代到第四代相對豐度分別為0.66%、1.02%、2.66%和8.74%，且隨著代數(shù)的增加而增加.4個代數(shù)中Rhizoglomus的相對豐度均在1%以下.

2.3 不同連栽代數(shù)杉木林土壤AMF群落的PCoA聚類分析

基于β多樣性對不同連栽代數(shù)AMF進行主坐標(biāo)分析(principal coordinates analysis, PCoA)，探索不同連栽代數(shù)樣本間AMF群落組成的相似性或差異性.由圖4可知，在OTU水平上，PCoA 1軸和2軸解釋方差分別為37.87%和19.69%，第二代和第一代大部分都位于主成分1的正半軸，第三代和第四代位于主成分1的負(fù)半軸；第四代和大部分第一代位于主成分2的正半軸，第三代和大部分第二代位于主成分2的負(fù)半軸.第一代與第二代之間距離較近，表明AMF群落組成較為相似；第三代與第四代之間距離較遠，表明AMF群落組成具有較大差異.

2.4 環(huán)境因子相關(guān)性

表3 不同連栽代數(shù)杉木林土壤的化學(xué)性質(zhì)1) Table 3 Basic chemical characteristics of soil under C.lanceolata plantations planted in different rotations

從圖5可知，速效鉀、銨態(tài)氮、pH、速效磷和硝態(tài)氮與AMF群落豐度存在相關(guān)關(guān)系，其中，Glomus的物種Glomus-Gken1與速效鉀含量呈極顯著負(fù)相關(guān)；銨態(tài)氮含量與Glomus-An08-GLO5呈正相關(guān)關(guān)系，與Glomus-Gken3呈負(fù)相關(guān)；Glomus-sp.、Glomus-Gollotte04-sp.-5、Archaeospora-Li14-Arc1物種的豐度與速效磷含量呈正相關(guān)關(guān)系；Gigaspora-Gig4與速效磷含量呈極顯著正相關(guān).

圖5 基于種水平的AMF群落物種豐度(前20)與環(huán)境因子的相關(guān)性熱圖 Fig.5 Spearman correlation heatmap analysis of the correlation between species abundance of AMF community (top 20) at the species level and soil environmental factors

不同連栽代數(shù)杉木林土壤AMF主要屬的相對豐度與土壤環(huán)境因子的冗余分析(redundancy analysis, RDA)分析結(jié)果(圖6a)顯示，土壤因子對AMF主要屬群落組成的變異解釋量超過99.7%，第一排序軸解釋群落變化的98.8%，而第二排序軸解釋群落變化的0.9%.對于優(yōu)勢屬而言，Glomus屬與速效鉀含量呈正相關(guān)，與有機質(zhì)含量呈負(fù)相關(guān)；根孢囊霉屬與銨態(tài)氮含量呈正相關(guān)，而Rhizoglomus與全氮、全碳含量呈正相關(guān)，與pH、銨態(tài)氮含量呈負(fù)相關(guān).多樣性指數(shù)與土壤環(huán)境因子的RDA分析(圖6b)結(jié)果表明，第一排序軸、第二排序軸對AMF多樣性指數(shù)與土壤環(huán)境因子的解釋率分別為94.3%和0.2%.所有土壤因子中，銨態(tài)氮含量對AMF的Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)影響最大，呈正相關(guān)；而速效鉀、硝態(tài)氮含量與之呈負(fù)相關(guān).全氮含量與Simpson呈正相關(guān)，與全磷含量呈負(fù)相關(guān).

圖6 土壤AMF主要屬的相對豐度與土壤環(huán)境因子的RDA分析(a)及多樣性指數(shù)與土壤環(huán)境因子的RDA分析(b) Fig.6 Redundancy analysis of relative abundance of AMF main genera and soil environmental factors (a) and redundancy analysis of AMF diversity index and soil environmental factors (b)

3 討論

不同連栽代數(shù)杉木林土壤AMF相對豐度前三的屬分別為Glomus、Rhizophagus和Rhizoglomus，其中Glomus屬是杉木林各代數(shù)的優(yōu)勢屬，與景躍波等[14]對杉木林AMF多樣性的研究結(jié)果一致.這可能是因為Glomus是AMF中最大的群體，生活范圍較寬，可以在地下形成一個龐大的菌絲網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)[16-17]；其次，Glomus屬能夠通過菌絲片段和菌根根段繁殖，有較強的產(chǎn)孢能力和侵染植物根系能力，適應(yīng)能力強[18].