圓齒野鴉椿兩種色原酮碳苷化合物生物合成相關(guān)基因篩選與分析

向 雙, 孫維紅, 樂易迅, 陳德強(qiáng), 鄒雙全

(1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院；2.自然生物資源保育利用福建省高校工程研究中心，福建 福州 350002)

色原酮及其苷類化合物是一種天然次級代謝產(chǎn)物，具有多種生物活性和藥理作用，如生物保護(hù)、植物染色、抗炎抗菌、抗腫瘤、抗氧化和神經(jīng)保護(hù)等[1].Biflorin中文名為5,7-二羥基-2-甲基-色原酮-6-c-β-d-葡萄糖苷；isbiflorin中文名為5,7-二羥基-2-甲基-色原酮-8-c-β-d-葡萄糖苷.研究表明，色原酮碳苷biflorin和isobiflorin具有很強(qiáng)的抗炎活性[2,3]，15 mg·kg-1劑量的效果相當(dāng)于陽性對照藥物布洛芬100 mg·kg-1劑量的效果[3]，活性約為布洛芬的6.7倍.此外，biflorin和isobiflorin是強(qiáng)大的細(xì)胞毒性藥物，可以影響細(xì)胞存活、克隆原性和活動性，從而抑制癌癥的發(fā)生[4].Biflorin和isobiflorin已經(jīng)從許多植物中分離得到，包括粗莖鱗毛蕨(Dryopteriscrassirhizoma)[5]、全能花(Pancratiumbiflorum)[6]和丁香(Syzygiumaromaticum)[7]，其中丁香中含量最高，達(dá)1.5 mg·g-1.其他植物中的含量較低，導(dǎo)致色原酮碳苷開發(fā)利用價值較低.

近年來，轉(zhuǎn)錄組研究已成為鑒定植物代謝途徑中功能基因的廣泛應(yīng)用方法.許多類型化合物的生物合成途徑，如黃酮類化合物[8]、三萜類化合物[9]和甾體皂苷類化合物[10]都已通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究得以解析.然而biflorin和isobiflorin的生物合成研究相對匱乏，目前，僅對蘆薈biflorin和isobiflorin的合成途徑進(jìn)行了研究[11].植物Ⅲ型酮類聚合酶(PCS)催化丙二酰輔酶A合成色原酮—5，7-二羥基-2-甲基色原酮，然后在糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT)的作用下形成各種不同類型的色原酮化合物.

圓齒野鴉椿(Euscaphiskonishii)屬于省沽油科(Staphyleaceae)，是我國廣泛種植的傳統(tǒng)民間藥用和觀賞植物[12,13].研究表明[14]圓齒野鴉椿果皮中上述兩種色原酮碳苷類化合物的含量為9.46 mg·g-1，是丁香含量的6.3倍，而且在不同部位的含量存在顯著差異.本試驗基于轉(zhuǎn)錄組測序?qū)iflorin和isobiflorin的生物合成相關(guān)基因進(jìn)行了鑒定與篩選，分析其表達(dá)情況，并對6-CUGT基因和8-CUGT基因進(jìn)行了區(qū)分，利用qRT-PCR分析驗證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性.以期為圓齒野鴉椿不同品種的選育和種質(zhì)資源的利用提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

圓齒野鴉椿種植于福建農(nóng)林大學(xué)科技園，樹齡6年，于2018年10月采集圓齒野鴉椿葉片、枝條和果皮樣品，分別裝袋標(biāo)記，帶回實(shí)驗室蔭晾，然后在50 ℃烘干粉碎，用于色原酮碳苷含量測定.另一部分樣品采集完后，立即用清水洗凈，濾紙擦干，用5 mL凍存管收集并做好標(biāo)記，立即放入液氮中，后轉(zhuǎn)至-80 ℃冰箱保存，用于RNA提取及轉(zhuǎn)錄組分析，每個組織部位取3個重復(fù).

1.2 方法

1.2.1 色原酮碳苷含量測定 采用HPLC指紋圖譜法測定圓齒野鴉椿色原酮碳苷含量，具體參照倪林等[14]的測定方法.

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組測序及組裝 使用天根植物提取試劑盒(參照試劑盒步驟說明)提取圓齒野鴉椿枝條、葉片和果皮的RNA.使用Nanodrop 2000微量紫外分光光度計(Thermo Scientific, USA)對所得圓齒野鴉椿RNA樣品的純度和濃度進(jìn)行檢測，并利用Agilent Bioanalyzer 2100檢測其濃度和完整性.

利用First Strand cDNA Synthesis Kit(Roche)制備cDNA，具體步驟及反應(yīng)體系參考試劑盒說明.將cDNA片段末端修復(fù)，構(gòu)建圓齒野鴉椿轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫.檢測結(jié)果合格的cDNA文庫利用DNBSEQ高通量測序平臺測序，并用Trinity軟件組裝測序數(shù)據(jù).

1.2.3 功能注釋 利用BLAST[15]軟件將Unigene序列與COG[19]、GO[18]、KEGG[22]、KOG[20]、Swiss-Prot[17]、eggNOG4.5[21]、NR[16]數(shù)據(jù)庫比對，利用KOBAS2.0[23]獲取unigenes在KEGG中的KEGG Orthology結(jié)果，對unigenes的氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測，并利用HMMER[24]軟件與Pfam[25]數(shù)據(jù)庫比對，從而得到unigenes的注釋結(jié)果.

1.2.4 差異基因鑒定 利用Bowtie[26]將圓齒野鴉椿測序得到的Reads與unigenes進(jìn)行比對，并利用RSEM[27]進(jìn)行表達(dá)量水平預(yù)估.利用FPKM值表示unigenes的表達(dá)豐度.使用DESeq[28]分析樣品組間的差異表達(dá)情況，得到兩個樣品之間的差異表達(dá)基因集.

1.2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析 利用TBTOOL軟件的MUSCLE工具(http://www.drive5.com/muscle/)進(jìn)行多序列比對，然后利用數(shù)據(jù)集構(gòu)建N-J系統(tǒng)發(fā)育樹.進(jìn)行1 000次bootstrap抽樣，其它參數(shù)為默認(rèn)值.參考蛋白質(zhì)序列(GtUF6CGT1、TcCGT1和PlUGT43)下載自NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

1.2.6 qRT-PCR分析 使用天根試劑盒提取樣品總RNA并進(jìn)行電泳檢測.以提取的RNA為模板，按 TransScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix的說明書配制RT反應(yīng)液，總反應(yīng)體系20 μL：42 ℃孵育15 min，85 ℃滅活5 s，得到cDNA，-20 ℃保存.將稀釋5倍的cDNA作為qRT-PCR的模板，配制反應(yīng)液，總反應(yīng)體系20 μL：qRT-PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)；72 ℃ 10 s；95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 1 s.使用EkGADPH作為內(nèi)參基因，檢測各目的基因在樣本中的相對表達(dá)量.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同部位biflorin和isobiflorin含量差異

biflorin和isobiflorin在圓齒野鴉椿不同組織部位中的含量表現(xiàn)為果皮最高，葉片次之，枝條最低，且差異顯著(P<0.05).其中，果皮中biflorin和isobiflorin含量分別為5.073 4和4.388 4 mg·g-1，葉片中biflorin和isobiflorin含量分別為2.398 2和1.786 1 mg·g-1，而在枝條中biflorin和isobiflorin含量分別為0.521 6和0.495 3 mg·g-1(表1).

表1 圓齒野鴉椿不同部位的biflorin和isobiflorin含量1)Table 1 Contents of biflorin and isobiflorin in different tissues of E.konishii

2.2 測序及組裝結(jié)果

通過轉(zhuǎn)錄組測序分別從葉片、枝條、果皮中獲得91 768 881、100 363 012和100 124 694個高質(zhì)量讀段，GC含量分別為45.13%、45.62%和45.10%(表2).利用Trinity軟件進(jìn)行組裝之后共獲得了85 342個unigenes，總長度為76 934 761 bp，平均長度為893.60 bp，N50長度為1 307 nt，長度超過1 000 bp的unigenes有22 477個，占比26.34%，表明序列完整性較高，可用于功能注釋.

表2 轉(zhuǎn)錄組組裝數(shù)據(jù)Table 2 Data of transcriptome assembly

2.3 Unigenes功能注釋

對圓齒野鴉椿轉(zhuǎn)錄組unigenes功能進(jìn)行注釋(表3)，在85 342個unigenes中，共有40 218個unigenes被注釋到1個或多個數(shù)據(jù)庫.注釋到NR數(shù)據(jù)庫的unigenes數(shù)最多，有39 074個，占比45.79%.其次是注釋到eggNOG4.5數(shù)據(jù)庫的unigenes有37 241個，占比43.64%.注釋到COG、GO、KEGG、KOG、Pfam、Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫的unigenes數(shù)分別為11 713、23 899、14 291、22 551、25 124和24 234個，分別占比13.72%、28.00%、16.75%、26.42%、29.44%和28.40%.

表3 圓齒野鴉椿unigenes功能注釋Table 3 Function annotation of unigenes in E.konishii

2.4 不同組織間差異基因KEGG富集分析

圓齒野鴉椿葉片、枝條和果實(shí)3個組織中的差異基因主要富集在21條KEGG代謝通路中(圖1).其中，枝/葉間的差異基因富集在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中最多(66個)，其次是淀粉和蔗糖代謝(55個).葉/果皮中的差異基因富集在苯丙素生物合成中最多(40個).枝/果皮間的差異基因富集在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中最多(61個).并且，異黃酮生物合成，半乳糖代謝、光合作用的碳固定，泛素酮和其他萜醌生物合成，異喹啉生物堿生物合成，托烷、哌啶和吡啶生物堿的生物合成，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝、戊糖、葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)換只有葉/果皮或枝/果皮間的差異基因富集，沒有枝/葉間的差異基因富集.這些基因可能為果皮中特異表達(dá)基因.

圖1 不同組織間差異基因KEGG富集分析Fig.1 KEGG pathway enrichment analysis of differentially expressed genes among different tissues

2.5 Biflorin和isobiflorin合成候選基因篩選及分析

2.5.1 Biflorin和isobiflorin合成候選基因篩選 植物Ⅲ型酮類聚合酶(PCS)催化丙二酰輔酶A合成色原酮—5，7-二羥基-2-甲基色原酮，然后在糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下形成各種不同類型的色原酮化合物[11].但在圓齒野鴉椿的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中并未注釋到PCS基因，而該酶基因?qū)儆诓闋柾铣擅讣易?CHS).基于此，將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中注釋的CHS基因與PCS基因進(jìn)行序列比對與系統(tǒng)進(jìn)化樹分析(圖2a)，基因Ej19428與MedicagosativaPCS屬同源基因序列，可能扮演相同的功能.在CHS基因中，Ej08012表達(dá)相對較高(圖2b).另外，從差異基因中篩選出7個差異表達(dá)的糖基轉(zhuǎn)移酶UGT基因，這些基因可能參與isobiflorin和biflorin的合成.

a.PCS同源基因分析;b.PCS同源基因表達(dá)熱圖;c.UGT基因系統(tǒng)進(jìn)化樹;d.biforin和isobiforin結(jié)構(gòu);e.UGT基因表達(dá)熱圖.熱圖中數(shù)值為標(biāo)準(zhǔn)化后的Z-SCORE，紅色越深表示基因表達(dá)量越高，藍(lán)色越深表示基因表達(dá)量越低.圖2 biflorin和isobiflorin生物合成相關(guān)基因分析Fig.2 Analysis of genes related to biosynthesis of biflorin and isobiflorin

2.5.2UGT基因分類與表達(dá)分析 糖基轉(zhuǎn)移酶可在6位或8位C原子的位置發(fā)生取代，在6位C取代產(chǎn)生biflorin，在8位C取代則生成isobiflorin(圖2d)[11].為了區(qū)分6-CUGT和8-CUGT，將7個UGT基因與已知的6-CUGT(GtUF6CGT1)和8-CUGT(TcCGT1,PlUGT43)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2c).結(jié)果表明，Ej26841、Ej26842、Ej04721和Ej27609是6-CUGT，Ej29043、Ej29870和Ej19518是8-CUGT.因此，4個6-CUGT基因可能與bibiflorin的生物合成途徑有關(guān)，3個8-CUGT基因可能與isobiflorin的生物合成有關(guān).

6-CUGT基因和8-CUGT基因的表達(dá)模式不同(圖2e).6-CUGT在果皮中表達(dá)量最高，枝葉中較低，且biflorin的含量在果皮中也為最高，與UGT基因表達(dá)一致.8-CUGT在葉片中表達(dá)量最高，果皮次之.但isobiflorin的含量在果皮中最高，與UGT基因表達(dá)情況存在差異.

2.5.3 qRT-PCR分析 為了進(jìn)一步驗證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，對篩選出的基因進(jìn)行qRT-PCR分析(圖3).果皮中的Ej19428基因相對表達(dá)量高于枝和葉，6-CUGT基因在果皮中最高，枝和葉相對較低，8-CUGT基因相對表達(dá)量在葉片中最高，果皮和枝中低于葉.qRT-PCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)呈現(xiàn)一致的表達(dá)模式，證明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可靠.

圖3 biflorin和isobiflorin生物合成相關(guān)基因qRT-PCR分析Fig.3 qRT-PCR analysis of genes related to biosynthesis of biflorin and isobiflorin

3 討論與結(jié)論

圓齒野鴉椿作為我國傳統(tǒng)中藥材，其果皮內(nèi)色原酮碳苷含量高達(dá)現(xiàn)有植物6.3倍，極具開發(fā)潛力.本研究利用高通量測序平臺對圓齒野鴉椿葉片、枝條、果皮進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，為色原酮碳苷biflorin和isobiflorin合成相關(guān)基因的篩選提供了依據(jù).

根據(jù)KEGG富集分析結(jié)果，不同組織間的差異基因主要富集在21條KEGG代謝通路，且不同組織間的差異基因富集情況存在差異.圓齒野鴉椿類黃酮含量在葉片中最高[29]，富集在類黃酮生物合成的差異基因來自葉/果皮以及葉/枝，這些基因可能主要在葉片中特異性表達(dá)，影響葉片中類黃酮的含量；果皮中多糖(含半乳糖)含量較高[30]，只有枝/果皮間的差異基因富集在半乳糖代謝，這些基因可能主要在果皮中特異性表達(dá).因此推測Biflorin和isobiflorin含量在圓齒野鴉椿果皮中最高，也與果皮中特異性表達(dá)的基因有關(guān).

糖基化是生物體中最為重要的生物反應(yīng)之一，其在糖基轉(zhuǎn)移酶的催化作用下將糖基從活化的供體分子轉(zhuǎn)移到受體分子[31].糖基的取代位置不同生成的碳苷化合物也不同，如糖基在6位C取代產(chǎn)生biflorin，在8位C取代則生成isobiflorin[11].從圓齒野鴉椿轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出7個差異表達(dá)的糖基轉(zhuǎn)移酶UGT基因，通過與已知的6-CUGT(GtUF6CGT1)和8-CUGT(TcCGT1,PlUGT43)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，將7個UGT基因區(qū)分為4個6-CUGT和3個8-CUGT.表達(dá)分析結(jié)果表明，6-CUGT和8-CUGT基因的表達(dá)模式不同，6-CUGT在果皮中表達(dá)量最高，枝葉中較低，且biflorin的含量在果皮中也為最高，與UGT基因表達(dá)一致.這說明biflorin的含量與4個6-CUGT基因的表達(dá)水平有關(guān).8-CUGT在葉片中表達(dá)水平最高，果皮次之.但isobiflorin的含量在果皮中最高，與UGT基因表達(dá)情況存在差異，這可能與圓齒野鴉椿中豐富的碳苷類化合物有關(guān)[32].也可能是由于isobiflorin的合成初始發(fā)生在葉片中，后儲存于果皮，這類似于皂苷生物合成初始發(fā)生在葉片，儲存部位在根部[33,34].具體原因如何，還有待進(jìn)一步驗證和功能分析.

本研究初步篩選和分析了圓齒野鴉椿色原酮碳苷化合物生物合成相關(guān)基因，有助于圓齒野鴉椿資源的篩選和培育，以及圓齒野鴉椿藥用價值的開發(fā)和利用.