從江香豬附睪3β-HSD的年齡依賴性表達模式

劉文嬌, 蒙利潔, 龔 婷

(1.貴州大學高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點試驗室；2.貴州省動物遺傳育種與繁殖重點試驗室；3.貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025)

類固醇激素作為哺乳動物體內(nèi)最主要的性腺激素，包括雌、雄激素等，對動物性器官的發(fā)育、成熟具有重要的調(diào)控作用，與動物的繁殖性能息息相關(guān)[1].3β-羥基甾脫氫酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase, 3β-HSD)是合成類固醇激素所必需的酶，可以將腎上腺前體類固醇轉(zhuǎn)化為孕酮、睪酮等[2].人類有兩個3β-HSD家族基因，分別為3β-HSD1基因和3β-HSD2基因，編碼3β-HSD1和3β-HSD2兩種同工酶，而豬的3β-HSD基因只有一種[3].研究表明：3β-HSD在大鼠的腎上腺、卵巢和睪丸均有表達[4-5].在小鼠飲食中添加高劑量糖精鈉，發(fā)現(xiàn)睪丸中包括3β-HSD在內(nèi)的睪酮合成相關(guān)酶表達量與對照組及中、低劑量處理組相比極顯著降低，且高劑量處理組小鼠的精子活力、精子密度有所下降，畸形精子數(shù)量增多[6]；在大鼠退化的附睪中注射睪酮，發(fā)現(xiàn)附睪小管直徑增大、附睪上皮高度增加、上皮細胞中的主細胞數(shù)量增加[7].因此，推測3β-HSD作為睪酮合成過程的關(guān)鍵酶不僅在睪丸中發(fā)揮作用，也可能影響附睪的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理作用，從而影響雄性生殖生理活動.

本課題組前期對附睪發(fā)育進行了研究，將從江香豬的附睪發(fā)育分為4個時期，即初情期前(15 d)、初情期(30 d)、初情期后(60 d)、性成熟期(180 d)[8-9].哺乳動物精子的發(fā)生過程在睪丸中完成，隨后在附睪運行的過程中受到附睪上皮細胞及平滑肌細胞合成和分泌各種因子的相互作用，經(jīng)過附睪腔特殊的動態(tài)微環(huán)境后促使精子成熟[10].睪酮作為睪丸和附睪中最重要的一種雄激素，其合成受到多種酶的調(diào)節(jié)，如類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白(StAR)、細胞色素P450側(cè)鏈裂解酶(CYP11A1)、3β-HSD、17β-羥基類固醇脫氫酶(17β-HSD)等的調(diào)節(jié)[11].本課題組前期研究表明，雄激素受體在不同日齡從江香豬的附睪中均有表達，這提示與雄激素相關(guān)的酶可影響附睪對精子成熟、運輸、儲存等的調(diào)控功能[12].另有研究表明，3β-HSD在胎盤的巨大滋養(yǎng)層細胞中存在表達，表明3β-HSD參與孕酮的合成，且孕酮是促進雌性第二性征發(fā)育成熟及維持妊娠所必需的[13].膽汁酸在脂肪代謝中起著不可替代的作用，肝臟中3β-HSD的缺乏會影響膽汁酸代謝，引起血清中維生素水平的下降，最終導致膽道淤積、肝臟腫大[14].3β-HSD在睪丸中的表達[15]已有文獻證實，但對該酶是否存在于附睪中，并直接影響附睪生理功能的研究較為缺乏.

從江香豬是我國一種重要的微型地方豬種，具有體型矮小、性成熟早、基因純合、肉質(zhì)鮮嫩等特點，目前已被列為國家二級珍稀保護畜種.然而，該豬種與大白豬等豬種相比繁殖力較低，嚴重影響了其擴繁推廣.對從江香豬繁殖性能開展相關(guān)機制的研究，對提高該豬種公豬的種用價值有重大意義.因此，本試驗選取不同日齡從江香豬公豬作為研究對象，在蛋白水平上探索3β-HSD在附睪中的表達模式，旨在為探究3β-HSD對從江香豬精子生成調(diào)控的潛在分子機制及提高從江香豬的生產(chǎn)性能提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗嚴格遵循貴州大學動物試驗倫理(批準號:1801227).所用動物為出生15(初情期前，n=3)、30(初情期，n=3)、60(初情期后，n=3)、180 d(性成熟期，n=3)的健康雄性從江香豬共12頭，購于貴陽綠生源畜牧科技發(fā)展有限公司.

1.2 樣品采集

通過手術(shù)法獲取附睪、睪丸組織，其中一側(cè)附睪、睪丸組織在4%多聚甲醛固定液中固定后做連續(xù)切片兩張，每日齡得到12張切片用于免疫組織化學檢測；剩余一側(cè)附睪、睪丸組織在采集后立即剪碎置于液氮中保存，用于后續(xù)Western blot分析.

1.3 附睪組織石蠟切片制作

1.4 免疫組織化學檢測

1.5 SDS-PAGE與Western blot分析

SDS-PAGE與Western blot分析參照蒙利潔等[12]的方法進行.在剪碎的附睪中加入含1%苯甲基黃酰氟(PMSF)的RIPA裂解液(北京索萊寶生物科技有限公司)提取總蛋白.蛋白濃度測定及蛋白定量分析參照BCA試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司)說明書進行，隨后定量、變性蛋白質(zhì).SDS-PAGE電泳后切膠，將蛋白轉(zhuǎn)移至用甲醇浸泡2 min的聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，使用恒定電流100 mA轉(zhuǎn)膜2 h.將膜浸入5%脫脂奶粉中于37 ℃搖床封閉3 h，加入一抗[3β-HSD(購自賽默飛世爾科技有限公司，貨號：sc374244，稀釋比例：1∶1 000)、β-actin(購自江蘇親科生物研究中心有限公司，貨號：AF7018，稀釋比例：1∶5 000)于4 ℃搖床反應過夜.洗膜3次，每次10 min，隨后加入HRP標記的二抗(1∶5 000)于37 ℃搖床孵育2 h.洗膜3次，每次10 min，黑暗條件下使用ECL超敏發(fā)光進行顯色，使用ChemiDocXRS系統(tǒng)成像、拍照，條帶灰度用Image J軟件分析.

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標準差”表示.3β-HSD灰度值采用Image J軟件測定，免疫組織化學檢測結(jié)果用正置顯微鏡進行觀察、拍照.使用GraphPad Prism 6.0軟件進行單因素方差分析，使用Dunnett法進行多重比較.其中，P<0.01表示差異極顯著，用**表示.

2 結(jié)果與分析

2.1 3β-HSD在不同日齡從江香豬附睪中的表達定位

不同日齡從江香豬附睪3β-HSD免疫組織化學檢測結(jié)果(圖1)顯示，從江香豬附睪在初情期前(15 d)、初情期(30 d)、初情期后(60 d)、性成熟期(180 d)均有3β-HSD的表達.3β-HSD在各日齡段從江香豬附睪平滑肌中均有表達，其中，15 d的3β-HSD特異性表達于附睪液及脫落的生精細胞中，30 d的3β-HSD少量表達于基細胞中，60 d的基細胞和微絨毛被3β-HSD深染，180 d可在精子中觀察到3β-HSD的表達.

A1～A3、B1～B3、C1～C3、D1～D4分別為初情期前、初情期、初情期后、性成熟期的附睪；E1～E3:性成熟期的睪丸(陽性對照)；F1～F3:性成熟期的附睪(陰性對照，用PBS代替3β-HSD一抗)(LU：管腔；SM：平滑肌；S：精子；B：基細胞；St：微絨毛；LC：間質(zhì)細胞；A1、A2中的三角形表示附睪液；A3中的箭頭表示脫落的生殖細胞).圖1 從江香豬附睪3β-HSD免疫組織化學檢測結(jié)果Fig.1 Immunohistochemistry detection of 3β-HSD in epididymis of Congjiang Xiang pig

2.2 從江香豬附睪3β-HSD的表達

以β-actin為內(nèi)參蛋白，從江香豬附睪3β-HSD表達的Western blot檢測結(jié)果(圖2)顯示，3β-HSD表達于從江香豬初情期前、初情期、初情期后、性成熟期4個發(fā)育時期的附睪中，且附睪3β-HSD蛋白的分子質(zhì)量約為43 ku.3β-HSD表達灰度值在30 d顯著增加，并達到最大值，表達豐度表現(xiàn)為：初情期>性成熟期、初情期后、初情期前，此結(jié)果與免疫組織化學染色結(jié)果一致.

A：3β-HSD抗體的特異性檢驗；B：3β-HSD在15、30、60和180 d 附睪組織中的表達量[**表示差異極顯著(P<0.01)]；C:Western blot檢測結(jié)果.圖2 從江香豬附睪3β-HSD表達的Western blot檢測結(jié)果Fig.2 The expression of 3β-HSD protein in epididymis detected by Western blotting

3 討論與結(jié)論

從江香豬的附睪形態(tài)與其他哺乳動物相似，由假復層柱狀上皮和周圍的平滑肌組成[16].研究證實，雄激素和一些管腔因子(如類β-半乳糖苷酶、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白、人類附睪蛋白6/G蛋白耦聯(lián)受體64)在附睪的發(fā)育過程中起著必要的作用.如：β-半乳糖苷酶與附睪中的精子成熟機制有關(guān)[17]；LCN5、LCN6、LCN8是脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白家族的重要成員，其發(fā)揮作用時可與精子成熟過程中精子膜脂類的轉(zhuǎn)運相聯(lián)系[18]；人類附睪蛋白6/G蛋白耦聯(lián)受體64具有調(diào)節(jié)附睪水平的作用[18-19].但目前對上述因子介導的精子運輸、成熟及附睪形態(tài)變化的分子機制仍知之甚少.本試驗結(jié)果顯示，從江香豬附睪中3β-HSD的表達具有年齡依賴性，且在初情期的表達量最高.初情期前、初情期后、性成熟期3β-HSD的表達量相似，均極顯著低于初情期，這可能與附睪自身獨特的微環(huán)境有關(guān).精子成熟的過程依賴于附睪高度專業(yè)化的管腔內(nèi)微環(huán)境，免疫組織化學檢測結(jié)果顯示，從江香豬初情期的附睪上皮細胞類型已分化完成，細胞形態(tài)多為立方柱狀.初情期后附睪上皮細胞向基底層移動，此時細胞多為窄高柱狀[20].暗示從江香豬初情期附睪3β-HSD的高表達可能參與了附睪精子運輸、成熟及附睪發(fā)育的調(diào)控.因此，附睪中的3β-HSD可能會影響精子的運輸、成熟及雄性性器官的發(fā)育，從而形成有助于精子成熟和儲存的環(huán)境.

附睪與睪丸的連接通過睪丸輸出小管介導，成熟哺乳動物中每秒有1 000～1 500個精子進入附睪，在長達1、2、6 m(分別為小鼠、大鼠、人)的附睪小管中運行，最終到達附睪尾部儲存[21].Mewe et al[22]研究發(fā)現(xiàn)，在去除附睪平滑肌后，附睪的收縮完全停止，表明精子在附睪中的運行離不開附睪平滑肌、管腔液體、微絨毛的相互作用.本試驗結(jié)果顯示，3β-HSD主要表達在從江香豬附睪的平滑肌中，并且在各發(fā)育時期均有表達.3β-HSD在初情期前表達于附睪上皮的主細胞中.主細胞占附睪上皮細胞的80%，負責分泌大部分附睪管腔內(nèi)的蛋白因子.因此推測附睪主細胞可能通過分泌3β-HSD對附睪微環(huán)境或精子成熟產(chǎn)生影響.研究表明，雄激素對附睪的結(jié)構(gòu)和功能具有重要的調(diào)控作用[23-24].雌、雄激素受體在附睪平滑肌中均有表達，表明雌、雄激素對精子的運輸和成熟具有調(diào)控作用.本課題組前期證實了3β-HSD在從江香豬附睪平滑肌中存在表達，表明附睪平滑肌可能是雄激素合成關(guān)鍵酶的靶器官[25].初情期的附睪上皮細胞已經(jīng)發(fā)育完全，此時的3β-HSD在附睪上皮周圍的平滑肌和少數(shù)基細胞中呈陽性表達.初情期時，從江香豬初次產(chǎn)生具備受精能力的精子，此時的3β-HSD在附睪中高表達，可能與精子的成熟、運輸機制有關(guān)；初情期后的3β-HSD定位于附睪平滑肌、微絨毛和基細胞中.初情期后開始產(chǎn)生大量精子，微絨毛可以吸收管腔物質(zhì)及分泌更多的蛋白質(zhì)，這種結(jié)構(gòu)有利于精子儲存，此時附睪平滑肌和微絨毛中3β-HSD的陽性表達對于精子的運輸、成熟和儲存是必要的[26-27].基細胞具有改變形狀以調(diào)整管腔容積和壓力的能力，其在保護管腔結(jié)構(gòu)完整性的方面起到了重要作用，從而對精子的儲存和運輸產(chǎn)生影響[28].此外，性成熟期的3β-HSD主要在附睪平滑肌中呈陽性表達，在精子中也有表達.附睪管中的因子和精子會影響平滑肌的收縮.Mewe et al[22]在去除牛附睪管中的精子后，平滑肌收縮加快，這或許可以解釋本試驗初情期后從江香豬附睪中3β-HSD表達量的下降.總體上，附睪各種特征都與其特定的功能有關(guān)[29-30].3β-HSD在附睪平滑肌中的表達可能對精子在附睪內(nèi)的運輸進行調(diào)節(jié)，在微絨毛中的表達對精子運輸、成熟也起調(diào)節(jié)作用，在基細胞中的表達可能通過改變附睪容積從而影響精子儲存.

3β-HSD參與精子的發(fā)生及成熟、獲能、儲存和受精等一系列過程[31-32].本試驗結(jié)果顯示，附睪中3β-HSD的表達在初情期達到峰值.附睪中的3β-HSD可能與從江香豬初情期初次釋放精子、附睪迅速發(fā)育、附睪功能基本完善等方面有關(guān).進入附睪后，精子的結(jié)構(gòu)和功能進一步完善，需要多種因素相互作用，初情期時附睪上皮細胞中3β-HSD的表達量最高，提示附睪中的3β-HSD對精子運輸、成熟及儲存發(fā)揮重要作用.