擬南芥EPF/EPFL基因?qū)吮P菌抗性的功能分析

黃幼梅, 柴夢楠, 席鑫鵬, 朱文輝, 齊金崗, 秦 源, 蔡漢陽

(1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院;2.福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)學(xué)院,福建 福州 350002)

核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)屬于子囊菌門柔膜菌目核盤菌屬，是一種典型的死體營養(yǎng)型植物病原真菌，主要通過產(chǎn)生細胞壁降解酶和毒素等方式使寄主細胞致病[1].核盤菌的生態(tài)分布廣泛，能夠寄生400多種植物，尤其對豆科植物、茄科植物和十字花科植物的生長發(fā)育造成嚴重危害[2].在我國東南部地區(qū)，核盤菌嚴重威脅了作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，造成巨大的經(jīng)濟損失[3-4].由于核盤菌破壞性極強，因此，關(guān)于植物對核盤菌防御機制的研究具有重要的意義.

表皮模式因子EPF/EPFL(EPIDERMALPATTERNINGFACTOR/EPF-LIKE)基因家族具有11個成員，包括2個EPF(EPF1～2)和9個EPFL(EPFL1～9)基因，這些基因能夠編碼一類富含半胱氨酸的植物特異性分泌肽[5].通常在EPF/EPFL肽鏈的碳端具有6個或8個保守的半胱氨酸殘基，能夠形成分子間二硫鍵，從而影響肽鏈的折疊以及蛋白活性[6].迄今為止，部分EPFs基因家族成員的功能已經(jīng)被揭示.其中，擬南芥EPF1、EPF2和EPFL9(STOMAGEN)在調(diào)控植物表皮氣孔的形成和發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用[7].研究表明，EPF1/2和EPFL9的二級結(jié)構(gòu)具有一定的相似性，都由一個環(huán)狀結(jié)構(gòu)和兩個較為保守的β-折疊所組成[8].在氣孔發(fā)育過程中，這段環(huán)狀結(jié)構(gòu)決定了每個EPF/EPFL肽的功能特異性.在EPF1和EPF2的環(huán)狀結(jié)構(gòu)區(qū)域中，兩個半胱氨酸殘基間能夠形成額外的二硫鍵，在葉片氣孔發(fā)育過程中具有負調(diào)控作用，而EPFL9無法形成額外的二硫鍵，能夠正向調(diào)控葉片氣孔密度，并且對EPF1和EPF2具有拮抗作用[8-10].此外，核磁共振結(jié)果顯示,EPFL9具有兩個反向平行的β-折疊，兩個β-折疊之間由3個二硫鍵以及一個310-螺旋所組成，繼而決定了EPFL9的功能[8].

在擬南芥中，類受體蛋白激酶ERECTA(ER)基因家族有3個成員，分別是ER、ERECTA-LIKE1(ERL1)和ERL2，該家族成員之間能以共受體形式在植物生長發(fā)育中起著重要的調(diào)控作用[11].前人研究表明，細胞表面類受體蛋白激酶ER通過激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)級聯(lián)信號通路，促進植物對不同病原體的抗性[12-16].此外，ER類受體蛋白激酶的活性還會受到其配體蛋白表皮模式建成因子EPF/EPFL的調(diào)控[15,17].研究表明，EPF/EPFL在調(diào)控氣孔密度過程中起重要作用，同時也參與其他發(fā)育過程，如在植物莖頂端分生組織中，EPFL1、EPFL2、EPFL4和EPFL6具有冗余功能，并激活ER/ERL活性共同調(diào)控莖尖分生組織的生長[18].然而，關(guān)于EPFL基因在植物免疫中的作用尚不清晰.本實驗室前期研究表明，在ER-MPK信號途徑中，YDA下游基因YDDs(YDADOWNSTREAMGENEs)在植物對核盤菌的抗性反應(yīng)過程中發(fā)揮著重要的作用[19].為了研究EPF/EPFL分泌肽在植物免疫反應(yīng)中的作用，本研究通過實時熒光定量PCR檢測、核盤菌接種和二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine, DAB)染色，揭示了EPFL1、EPFL2、EPFL4和EPFL6通過激活YDDs基因的表達從而在植物對病原菌的防御反應(yīng)中發(fā)揮作用，為EPF/EPFL基因在植物免疫中的作用機制研究提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

供試核盤菌由福建農(nóng)林大學(xué)海峽聯(lián)合研究院基因組中心提供.

供試材料為野生型擬南芥(Col-0，用WT表示，由本實驗室保存)和epfl1,2,4,6四突變體擬南芥(由美國田納西大學(xué)Elena D. Shpak教授惠贈[18]).將擬南芥播種于1/2MS培養(yǎng)基上，置于溫度22 ℃、空氣濕度70%、光照強度50 μmol·m-2·s-1、光周期為光照∶黑暗=16 h∶8 h的溫室中培養(yǎng)，萌發(fā)后將幼苗移植至營養(yǎng)土中培養(yǎng)，30 d后進行核盤菌接種處理.

1.2 方法

1.2.1 核盤菌接種處理 取長、寬均為90 mm的方形培養(yǎng)皿，在其底部放置大小相近的濾紙，加入適量的水將濾紙浸濕.選取大小相近、表面平整的擬南芥葉片，將其平鋪于濾紙上，在葉脈處放置滅菌棉條，用移液槍吸取適當(dāng)?shù)乃畬⒚迼l浸濕，保持葉片濕潤.取直徑約為2.5 mm的核盤菌菌塊，置于擬南芥葉片上，放置溫室中處理36 h后測量病斑面積并進行拍照記錄.

1.2.2 DAB染色 接菌處理后，使用1 mg·mL-1DAB對葉片進行染色，避光處理8 h后轉(zhuǎn)移至75%乙醇中煮沸10 min進行脫色，晾干后進行拍照記錄.

1.2.3 RNA提取與cDNA合成 采用RNA提取試劑盒OMEGA Plant RNA Kit(廣州飛揚生物工程有限公司)提取擬南芥葉片的RNA，使用Superscript Ⅳ試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)進行反轉(zhuǎn)錄，具體操作步驟參照試劑盒說明書進行，合成的cDNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆?

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測 實時熒光定量PCR檢測采用試劑盒Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)，在Bio-Rad CFX384 Touch熒光定量PCR儀(上海土森視覺科技有限公司)上運行.熒光定量PCR反應(yīng)程序設(shè)置為：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s，60℃，34 s，40個循環(huán)；95℃，15 s.本研究選取擬南芥HK2基因(基因ID：AT4G26410)作為內(nèi)參基因[19-20]，其他引物序列如表1所示.采用2-ΔΔCt方法對熒光定量PCR數(shù)據(jù)進行分析，呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)來自3個生物學(xué)重復(fù)樣本的平均值.

2 結(jié)果與分析

2.1 EPF/EPFL基因在植物免疫過程中的表達

為了研究EPF/EPFL基因家族是否參與核盤菌的響應(yīng)過程，采用實時熒光定量PCR檢測擬南芥11個EPF/EPFL基因成員在WT接種核盤菌后不同時間點的表達水平.結(jié)果(圖1)顯示，接種核盤菌后，EPFL1、EPFL2、EPFL3、EPFL4、EPFL5、EPFL6和EPFL9的表達量都有顯著的上調(diào).其中，EPFL1、EPFL2、EPFL3、EPFL4和EPFL6在接種核盤菌12～48 h時均能持續(xù)上調(diào)表達；EPFL5在接種核盤菌48 h時才有明顯的上調(diào)表達，而在接種核盤菌12和24 h時的表達量沒有明顯的變化；EPFL9在接種核盤菌12 h有下調(diào)表達的趨勢，然而在接種核盤菌24和48 h時則出現(xiàn)顯著的上調(diào)表達.這些結(jié)果表明，EPFL1、EPFL2、EPFL3、EPFL4、EPFL5、EPFL6和EPFL9可能在植物對核盤菌的防御反應(yīng)中發(fā)揮作用.

誤差線表示±標準差(n=3)；顯著性差異分析采用t檢驗法；*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01).圖1 EPF/EPFL基因在擬南芥接種核盤菌后不同時間點的表達量Fig.1 Expressions of EPF/EPFL genes in Arabidopsis leaves at different time points after S.sclerotiorum inoculation

2.2 EPFL1、EPFL2、EPFL4和EPFL6的抗病性

為了進一步驗證EPFL1、EPFL2、EPFL3、EPFL4、EPFL5、EPFL6和EPFL9是否在植物免疫中發(fā)揮作用，對苗齡為30 d的WT和epfl1、epfl2、epfl3、epfl4、epfl5、epfl6、epfl9擬南芥單突變體進行核盤菌接種處理.結(jié)果顯示，與WT相比，epfl1、epfl2、epfl3、epfl4、epfl5、epfl6和epfl9單突變體葉片的病斑大小沒有明顯差異(圖2A).DAB染色顯示，WT中H2O2的含量與單突變體沒有明顯差別(圖2B).結(jié)果暗示，EPFL基因家族成員之間可能存在冗余功能.同時，前人的研究也表明了EPFL1、EPFL2、EPFL4和EPFL6在調(diào)控莖尖分生組織發(fā)育過程中存在冗余功能[18].為此，對本實驗室保存的epfl1,2,4,6四突變體擬南芥進行了核盤菌接種處理.植物活體接種結(jié)果表明，epfl1,2,4,6四突變體擬南芥葉片的病斑面積明顯大于WT(圖3A)，且葉片離體接種結(jié)果與此一致(圖3B).此外，本研究提取了經(jīng)過接菌處理的擬南芥葉片的總DNA，通過實時熒光定量PCR檢測葉片組織中核盤菌的內(nèi)參基因SsTUBb(S.sclerotioruhousekeeping gene encoding b-tubulin)和擬南芥的內(nèi)參基因HK2的相對含量，從而確定葉片組織中核盤菌的生長情況.結(jié)果表明，epfl1,2,4,6四突變體擬南芥葉片中的核盤菌含量明顯多于WT(圖3C).DAB染色結(jié)果顯示，接種核盤菌后，epfl1,2,4,6四突變體擬南芥葉片中的H2O2的含量明顯大于WT(圖3D).細胞內(nèi)H2O2的大量產(chǎn)生會導(dǎo)致細胞衰老和死亡，在epfl1,2,4,6四突變體擬南芥中H2O2的含量明顯高于WT，暗示epfl1,2,4,6四突變體擬南芥對核盤菌更敏感.這些結(jié)果共同表明，EPFL1、EPFL2、EPFL4和EPFL6在擬南芥應(yīng)答核盤菌中起著重要作用，同時也存在較強的冗余性.

A：植株葉片離體接種處理36 h;B：DAB染色.圖2 epfl1、epfl2、epfl3、epfl4、epfl5、epfl6和epfl9擬南芥單突變體抗病性鑒定Fig.2 Resistance evaluation of epfl1, epfl2, epfl3, epfl4, epfl5, epfl6 and epfl9 single mutant plants in response to S.sclerotiorum

A：植株葉片活體接種處理36 h;B：植株葉片離體接種處理36 h;C：葉片中的核盤菌含量[誤差線表示±標準差(n=3)；顯著性差異分析采用t檢驗法，**表示差異極顯著(P<0.01)];D：DAB染色.圖3 epfl1,2,4,6四突變體擬南芥抗病性鑒定Fig.3 Resistance evaluation of epfl1,2,4,6 quadruple mutant in response to S.sclerotiorum

2.3 EPFL1、EPFL2、EPFL4和EPFL6介導(dǎo)YDDs基因的表達參與植物免疫

本實驗室前期研究表明，在植物免疫反應(yīng)中，YDDs基因作用于ER-MPK-WRKY33信號途徑下游，正向調(diào)控植物對核盤菌的抗性[19].為了進一步研究EPFL1、EPFL2、EPFL4和EPFL6是否通過影響YDDs基因的表達參與擬南芥對核盤菌的防御反應(yīng)，本研究采用實時熒光定量PCR技術(shù)比較接種核盤菌前后YDDs基因在WT和epfl1,2,4,6四突變體擬南芥中的表達情況.在正常條件下，與WT相比，在21個YDDs基因中，有部分基因在epfl1,2,4,6四突變體擬南芥中的表達水平明顯下調(diào)，如YDD3、YDD4、YDD5等；而有些基因沒有明顯的變化，如YDD6、YDD7等(圖4).在接種核盤菌后，在WT中，21個YDDs基因的表達水平均顯著上調(diào)；而與WT相比，21個YDDs基因在epfl1,2,4,6四突變體擬南芥中的表達水平顯著下調(diào)(圖4).這些結(jié)果表明，EPFL1、EPFL2、EPFL4和EPFL6基因通過介導(dǎo)YDDs基因的表達，從而在擬南芥響應(yīng)核盤菌的過程中起正向調(diào)控作用.

誤差線表示±標準差(n=3)；顯著性差異分析采用單因素方差檢驗法；附不同字母表示差異顯著(P<0.05)，附相同字母表示差異不顯著(P>0.05).圖4 YDDs基因在WT和epfl1,2,4,6四突變體擬南芥中的表達量Fig.4 Expressions of YDDs genes in wildtype and epfl1,2,4,6 quadruple mutant

3 討論

在病原菌脅迫條件下，ER類受體激酶能夠接收并傳遞病原菌入侵的信號，激發(fā)植物體內(nèi)一系列的防御反應(yīng)[13-14,16].EPF/EPFL作為ER/ERL類受體激酶家族成員的配體，在多種生物過程中發(fā)揮作用，包括氣孔發(fā)育、花序形態(tài)建成以及莖頂端分生組織構(gòu)成[11,21].研究表明，ER/ERL類受體激酶家族參與調(diào)控植物的防御反應(yīng)[19,22].然而，關(guān)于EPF/EPFL分泌肽在植物對病原菌的防御反應(yīng)中的功能仍有待解析.本研究發(fā)現(xiàn)，與WT相比，epfl1、epfl2、epfl3、epfl4、epfl5、epfl6和epfl9擬南芥單突變體接種核盤菌后沒有明顯表型，而epfl1,2,4,6四突變體擬南芥對核盤菌比WT更加敏感，暗示了EPF/EPFL基因家族成員存在冗余功能.前人研究表明，EPFL1、EPFL2、EPFL4和EPFL6在調(diào)控莖頂端分生組織生長中具有冗余功能[18].研究表明，根據(jù)EPF/EPFL基因家族的進化關(guān)系和結(jié)構(gòu)特征顯示，EPF/EPFL基因家族成員可能是由4個共同的祖先基因通過復(fù)制而來的：如擬南芥EPFL1、EPFL2和EPFL3這3個基因可能來自同一個祖先基因；EPFL4、EPFL6和EPFL8這3個基因也可能來自同一個祖先基因.此外，也可能是由于EPF/EPFL基因家族和ER/ERL1/2數(shù)目不對稱所導(dǎo)致，11個EPF/EPFL都能分別與ER/ERL1/2結(jié)合而形成冗余功能[23].本研究結(jié)果表明，EPFL1、EPFL2、EPFL4和EPFL6可能在植物響應(yīng)核盤菌脅迫反應(yīng)中存在冗余功能，共同調(diào)控植物對病原菌的防御反應(yīng).

在植物免疫過程中，活性氧(ROS)不僅能夠抑制病原物的生長，還能作為重要的信號分子，從而激活植物體內(nèi)一系列的防衛(wèi)機制，參與宿主與病原體的相互作用[24].在病原菌的侵染下，植物體內(nèi)可以通過大量產(chǎn)生H2O2促進細胞壁木質(zhì)化及細胞凋亡，從而導(dǎo)致宿主植物產(chǎn)生過敏反應(yīng)(HR)來發(fā)揮抗病作用.因此，H2O2含量增加是植物抗逆的一個重要指標[25-26].本研究中，在核盤菌侵染下，epfl1,2,4,6四突變體擬南芥葉片中的H2O2含量明顯大于WT，epfl1,2,4,6四突變體擬南芥對核盤菌比WT更敏感，這與核盤菌接種處理的結(jié)果相吻合：進一步說明了EPFL1、EPFL2、EPFL4和EPFL6在植物對核盤菌的抗性反應(yīng)中可能發(fā)揮正向調(diào)控作用.此外，本實驗室前期研究表明，ER-MPK6-WRKY33信號途徑共同促進YDDs基因的表達從而調(diào)控擬南芥對核盤菌的防御反應(yīng)[19].因此，YDDs基因可以作為擬南芥參與核盤菌防御反應(yīng)的重要標記基因.本研究結(jié)果表明，EPFL1、EPFL2、EPFL4和EPFL6也能夠通過調(diào)控YDDs基因的表達，從而在植物對核盤菌的免疫過程中發(fā)揮作用.進一步暗示，EPF/EPFL基因家族可能是通過激活ER-MPK6-WRKY33信號途徑促進YDDs基因的表達從而調(diào)控擬南芥對核盤菌的防御反應(yīng).綜上所述，本研究揭示了EPF/EPFL基因在植物對核盤菌的防御反應(yīng)中起正調(diào)控作用，為將來選育高抗核盤菌作物提供參考.