PhJAZ1蛋白對(duì)毛竹中抗蟲相關(guān)代謝物和SPL家族基因的影響

黃錦鵬, 李玉紅, 朱騰飛, 任慧波, 蘇 軍

(福建農(nóng)林大學(xué)海峽聯(lián)合研究院基礎(chǔ)林學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)研究中心，福建 福州 350002)

毛竹(Phyllostachysheterocycla)是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)資源，存在特殊的大小年現(xiàn)象，在同一片竹林中同時(shí)存在大年和小年兩類竹葉有利于竹林抵抗蟲害[1].而我國(guó)大部分的毛竹林為經(jīng)營(yíng)強(qiáng)度極大且竹葉類型單一的大年竹林，蟲害發(fā)生頻繁，給毛竹產(chǎn)業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失[2].

在受到昆蟲取食時(shí)，植物體內(nèi)會(huì)通過內(nèi)源激素含量等的變化實(shí)現(xiàn)對(duì)昆蟲的防御[3]，這也是植物感受和細(xì)胞間傳遞損傷信號(hào)的基礎(chǔ).茉莉酸(jasmonate, JA)已被證實(shí)與植物響應(yīng)咀嚼式口器昆蟲的危害有直接關(guān)系[4].在模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)中，JAZ1(jasmonate ZIM-domain 1)屬于高效的轉(zhuǎn)錄抑制因子，能抑制JA信號(hào)途徑下游相關(guān)抗蟲基因的表達(dá)[5].JAZ1蛋白在未被降解時(shí)通過與髓細(xì)胞組織增生蛋白(myelocytomatosis proteins, MYC)類轉(zhuǎn)錄因子MYC2結(jié)合抑制下游抗蟲基因的表達(dá)，該蛋白被降解后MYC2與MED25(mediator 25)結(jié)合，使得下游抗蟲基因得以表達(dá)，進(jìn)而大量合成可以直接毒害昆蟲的次生代謝物質(zhì)，包括黃酮類和單寧類等物質(zhì)[6-9].研究表明，竹葉在被昆蟲取食后體內(nèi)的次生代謝物質(zhì)(包括黃酮、生物堿和單寧等)的含量極顯著上升，且這些物質(zhì)在小年竹葉中的積累量顯著大于大年竹葉[1,10-12].

SPL(squamosa promoter-binding protein-like)屬于植物年齡依賴性發(fā)育的重要調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子[13-14].SPL在植物幼年期間呈現(xiàn)低水平表達(dá)，隨著植物的生長(zhǎng)和發(fā)育，SPL表達(dá)水平會(huì)逐漸升高.SPL廣泛調(diào)節(jié)植物的進(jìn)化過程，包括開花[15-16]、次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)[17-18]和抗逆反應(yīng)[19-20].研究表明，擬南芥中的SPL9可以在蛋白水平上直接抑制JAZ3的降解，導(dǎo)致隨著年齡的增長(zhǎng)，植物的JA信號(hào)響應(yīng)逐漸減弱[5].本團(tuán)隊(duì)前期通過體外的酵母單雜交試驗(yàn)與HEK-293T細(xì)胞中的雙熒光報(bào)告系統(tǒng)，證明PhSPL17能夠直接結(jié)合PhJAZ1的啟動(dòng)子區(qū)，并在轉(zhuǎn)錄水平上抑制PhJAZ1的表達(dá)[21-22].然而，PhJAZ1在毛竹體內(nèi)如何通過調(diào)節(jié)下游PhSPL家族基因的表達(dá)影響次生代謝物質(zhì)的積累進(jìn)而影響抗蟲性尚不明確.本試驗(yàn)通過探究PhJAZ1對(duì)毛竹中次生代謝物質(zhì)及下游抗蟲相關(guān)PhSPL家族基因表達(dá)的影響，為深入研究毛竹JA信號(hào)通路的抗蟲機(jī)制提供參考，并為基因工程在毛竹遺傳育種方面的應(yīng)用提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用野生型擬南芥及毛竹均采自福建農(nóng)林大學(xué)海峽聯(lián)合研究院林學(xué)中心人工氣候室；JAZ1功

能缺失型突變體擬南芥jaz1訂購(gòu)自擬南芥資源中心(ABRC, The Ohio State University Rightmire Hall 1060 Carmack Road Columbus, OH43210USA)，編號(hào)為SALK_011957，該突變體是在野生型擬南芥Col-0中以T-DNA插入方式，使jaz1基因缺失，從而使JAZ1功能缺失；棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)由福建農(nóng)林大學(xué)教育部生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供.

1.2 毛竹PhJAZ1基因的獲得

在毛竹基因組數(shù)據(jù)庫Bamboo GBD(http://www.bamboogdb.org/)中對(duì)擬南芥、水稻和毛竹中JAZ家族蛋白進(jìn)行同源基因序列比對(duì)[22]，選取同源性最高的基因(PH01000360G1030)為模板，利用Primer5軟件設(shè)計(jì)PCR引物：正向引物F為5′-ATGGAGATGTCTGCGTCCGCGA-3′，反向引物R為5′-TTGGCTGCATTCTGTGTTCAAGC-3′.

毛竹PhJAZ1基因以毛竹cDNA為模板，用KOD-Plus-Neo高保真酶通過PCR擴(kuò)增獲得PhJAZ1基因.擴(kuò)增體系(50 μL)：10×Buffer 5 μL，dNTPs 5 μL，上、下游引物各1.5 μL，MgSO43 μL，模板1 μL，ddH2O 33 μL.

反應(yīng)條件：

保溫 16 ℃ +∞.

1.3 PhJAZ1過表達(dá)載體的構(gòu)建

將擴(kuò)增獲得的PhJAZ1基因和攜帶綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)標(biāo)簽的載體pFGFP分別用BamH>Ⅰ特異性核苷酸酶進(jìn)行酶切，再利用Infusion連接酶(In-Fusion?HD Cloning Kit)將PhJAZ1基因連接到pFGFP載體上.之后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，37 ℃搖床培養(yǎng)1 h后涂布于含有終濃度為50 ng·μL-1卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)后，挑取陽性單克隆菌經(jīng)PCR鑒定后送測(cè)序公司測(cè)序.測(cè)序結(jié)果正確的陽性菌在含有終濃度為50 ng·μL-1卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中于37 ℃搖床過夜培養(yǎng)，利用質(zhì)粒小提試劑盒(DP103, TIANGEN)提取質(zhì)粒，獲得PhJAZ1基因過表達(dá)載體ACT2∷GFP-PhJAZ1.PhJAZ1載體構(gòu)建的引物序列：正向引物F為5′-TCCAGCTCCAGGATCCATGGAGATGTCTGCGTCCGCGA-3′，反向引物R為5′-GAGAAAGCTTGGATCCTTGGCTGCATTCTGTGTTCAAGC-3′.

1.4 PhJAZ1過表達(dá)擬南芥和毛竹的獲得

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法將PhJAZ1過表達(dá)載體轉(zhuǎn)入擬南芥[23].先將構(gòu)建好的過表達(dá)載體ACT2∷GFP-PhJAZ1通過凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌AGL0中，再將攜帶過表達(dá)載體ACT2∷GFP-PhJAZ1的農(nóng)桿菌AGL0通過浸花法侵染jaz1突變體，共侵染2次，間隔1周.收獲轉(zhuǎn)化植株的種子，以除草劑Basta為篩選標(biāo)記進(jìn)行篩選，獲得轉(zhuǎn)化子植株P(guān)hJAZ1/jaz1.以野生型擬南芥Col-0為陽性對(duì)照，以攜帶jaz1突變體的擬南芥為陰性對(duì)照,以GFP-PhJAZ1融合蛋白為目的條帶，通過Western Blotting驗(yàn)證擬南芥葉片,得到陽性植株.采取細(xì)胞穿透肽(cell-penetrating peptides, CPPs)介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系對(duì)幼年毛竹植株進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)化[24].將10 μg構(gòu)建好的過表達(dá)載體ACT2∷GFP-PhJAZ1與CPPs(1 mg·μL-1)等體積混合于15 mL離心管中，加入300 μL 1×PBS溶液，于37 ℃孵育30 min，之后加入超純水定容至5 mL，放入幼年毛竹植株至浸沒，持續(xù)5 min抽真空后，在人工溫室內(nèi)避光存放3 d.以野生型幼年毛竹植株WT為對(duì)照，以GFP-PhJAZ1融合蛋白為目的條帶，通過Western blotting驗(yàn)證毛竹幼苗全株,得到陽性植株.

1.5 突變體的鑒定

純合體鑒定引物序列：LB1.3為5′-ATTTTGCCGATTTCGGAAC-3′；LP為5′-AGGTAAATGCGGAGAGAGAGG-3′；RP為5′-AGGCACCGCTAATAGCTTAGC-3′；PS1為L(zhǎng)P+RP; PS2為L(zhǎng)B1.3+RP.使用2×Easy Taq酶通過PCR擴(kuò)增鑒定所用材料jaz1突變體為純合體.擴(kuò)增總體系為25 μL：2×Easy Taq Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL，模板1 μL.

反應(yīng)條件：

保溫16 ℃ +∞.

1.6 棉鈴蟲的飼養(yǎng)

選取棉鈴蟲的2齡幼蟲，飼喂不同處理的3周齡擬南芥葉片，每組15頭棉鈴蟲，每個(gè)處理3組重復(fù)，共45頭棉鈴蟲.從飼喂第1天開始記錄幼蟲的體重和存活率[22]，持續(xù)45 d.飼養(yǎng)條件：溫度25 ℃，相對(duì)濕度70%，光周期為14 h光照∶10 h黑暗.

1.7 擬南芥和毛竹中次生代謝物質(zhì)含量的測(cè)定

單寧含量的測(cè)定使用Solarbio公司生產(chǎn)的單寧含量檢測(cè)試劑盒(BC1390)；黃酮含量的測(cè)定使用格銳思生物科技有限公司的總黃酮(TF)試劑盒(G0118W)；生物堿含量的測(cè)定使用格銳思生物科技有限公司的總生物堿含量測(cè)定試劑盒(G0150W).

1.8 PhJAZ1過表達(dá)毛竹中PhSPL家族基因表達(dá)量的測(cè)定

使用總RNA提取試劑盒(RC401-01, Vazyme)對(duì)野生型毛竹植株WT與PhJAZ1過表達(dá)陽性毛竹植株全株進(jìn)行總RNA的提取.分別取1.0 μg各樣品的RNA，使用cDNA Synthesis SuperMix(11141ES60, YEASEN)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA.

根據(jù)已鑒定的15個(gè)擬南芥及19個(gè)水稻的SPL蛋白序列，在毛竹基因組數(shù)據(jù)庫Bamboo GBD(http://www.bamboogdb.org/)中對(duì)擬南芥、水稻和毛竹SPL家族基因的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)[21]，獲得PhSPL基因家族序列，不同PhSPL基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR的引物利用Primer3網(wǎng)站(http://primer3plus.com)設(shè)計(jì)(表1)，以TIP41作為內(nèi)參基因，使用Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix(Low Rox Plus)(11202ES08， YEASEN)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè).每個(gè)樣本做3個(gè)生物學(xué)重復(fù)、3個(gè)技術(shù)性重復(fù).

使用log22-ΔΔCt法對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算分析[25].ΔCt(實(shí)驗(yàn)組)=Ct(實(shí)驗(yàn)組目的基因)-CT(實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因)，ΔCt(對(duì)照組)=Ct(對(duì)照組目的基因)-CT(對(duì)照組內(nèi)參基因)，ΔΔCt=ΔCt(實(shí)驗(yàn)組)-ΔCt(對(duì)照組)，表達(dá)水平差異倍數(shù)Fold Change=2-ΔΔCt.

表1 毛竹實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences of real-time fluorescence quantitative PCR for moso bamboo

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法

數(shù)據(jù)的采集與整理使用Excel 2022軟件，數(shù)據(jù)的分析與制圖使用GraphPad Prism 8軟件，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 PhJAZ1/jaz1擬南芥植株的鑒定

在擬南芥中，JAZ家族表現(xiàn)抑制植物抗蟲性的作用[5].本研究選擇在擬南芥jaz1突變體的背景下過表達(dá)AtJAZ1的同源基因PhJAZ1,以檢測(cè)其是否能夠提高jaz1突變體植株對(duì)昆蟲危害的耐受性.通過Basta篩選得到T1代，收集T2代種子后，繼續(xù)通過Basta篩選，對(duì)T2代的植株進(jìn)行Western Blotting(圖1)，鑒定過表達(dá)植株中是否存在目的蛋白GFP-PhJAZ1，發(fā)現(xiàn)在眾多T2植株中PhJAZ1/jaz1#5的蛋白表達(dá)量最多，因此，后續(xù)的試驗(yàn)均使用PhJAZ1/jaz1#5.

圖1 PhJAZ1過表達(dá)擬南芥植株的Western blotting鑒定Fig.1 Western blotting verification of PhJAZ1 overexpression Arabidopsis

2.2 PhJAZ1對(duì)棉鈴蟲體重和存活率的影響

與取食攜帶jaz1突變體的擬南芥相比，取食PhJAZ1過表達(dá)擬南芥(PhJAZ1-OX/jaz1)的棉鈴蟲幼蟲的體重和存活率分別提高了195.8%和36.7%(P<0.01)，取食野生型擬南芥Col-0的棉鈴蟲幼蟲的體重和存活率分別提高了97.5%和41.6%(P<0.01)(圖2).

不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01).圖2 PhJAZ1對(duì)棉鈴蟲幼蟲體重和存活率的影響Fig.2 Effect of PhJAZ1 on weight and survival rate of H.armigera larvae

2.3 PhJAZ1對(duì)擬南芥中次生代謝物質(zhì)含量的影響

如圖3所示，攜帶jaz1突變體的擬南芥中黃酮含量與野生型擬南芥Col-0差異不顯著,但前者單寧和生物堿含量分別比后者提高了62.7%和103.8%(P<0.01).相比于攜帶jaz1突變體的擬南芥，PhJAZ1過表達(dá)擬南芥(PhJAZ1-OX/jaz1)中的黃酮含量變化不顯著；而單寧含量極顯著減少(P<0.01)，與野生型的單寧含量相當(dāng)；生物堿含量也極顯著減少(P<0.01)，且低于野生型的生物堿含量.

不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01).圖3 PhJAZ1對(duì)擬南芥中次生代謝物質(zhì)含量的影響Fig.3 Effect of PhJAZ1 on secondary metabolites contents in Arabidopsis

2.4 PhJAZ1瞬時(shí)表達(dá)毛竹的鑒定

毛竹中的PhJAZ1為擬南芥AtJAZ1的同源基因，對(duì)PhJAZ1瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的毛竹幼苗全株進(jìn)行Western blotting驗(yàn)證，結(jié)果表明PhJAZ1瞬時(shí)表達(dá)毛竹中存在目的蛋白GFP-PhJAZ1(圖4).

WT為野生型毛竹植株(全株)，GFP-PhJAZ1#1、GFP-PhJAZ1#2、GFP-PhJAZ1#3及GFP-PhJAZ1#4均為PhJAZ1瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的毛竹植株(全株).圖4 PhJAZ1過表達(dá)毛竹植株的Western blotting驗(yàn)證Fig.4 Western blotting verification of PhJAZ1 overexpression moso bamboo

2.5 PhJAZ1對(duì)毛竹中次生代謝物質(zhì)含量的影響

由圖5可以看出，與野生型毛竹WT相比，PhJAZ1過表達(dá)毛竹中單寧的含量降低了11.7%(P<0.05)，而黃酮和生物堿含量的差異不顯著(P>0.05).

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05).圖5 PhJAZ1對(duì)毛竹中次生代謝物質(zhì)含量的影響Fig.5 Effect of PhJAZ1 on secondary metabolites contents in moso bamboo

2.6 PhJAZ1過表達(dá)毛竹中PhSPL家族基因的表達(dá)量

通過定量分析(圖6)發(fā)現(xiàn)：相比于野生型毛竹，內(nèi)源PhJAZ1過表達(dá)材料中PhSPL6-2的相對(duì)表達(dá)量上調(diào)最高，接近5倍；PhSPL3-3、PhSPL9-1和PhSPL9-2的相對(duì)表達(dá)量均上調(diào)近4倍；PhSPL12-1、PhSPL11-1、PhSPL3-1、PhSPL10-1、PhSPL15-1的相對(duì)表達(dá)量均上調(diào)約3倍；而PhSPL19-1、PhSPL17-1、PhSPL17-2、PhSPL16-2、PhSPL11-2、PhSPL3-2、PhSPL16-1、PhSPL16-4、PhSPL2-2、PhSPL11-4、PhSPL16-3的相對(duì)表達(dá)量呈下調(diào)趨勢(shì).

圖6 PhJAZ1過表達(dá)毛竹植株中PhSPL家族基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.6 Relative expression of PhSPL family genes in PhJAZ1 overexpression moso bamboo

3 討論

有研究證明，植物體內(nèi)次生物質(zhì)含量的變化是抗蟲性變化的基礎(chǔ)[8].擬南芥中JAZ1蛋白能夠負(fù)調(diào)控下游靶基因的表達(dá)，抑制次生物質(zhì)的產(chǎn)生，進(jìn)而平衡植株生長(zhǎng)發(fā)育與免疫之間的關(guān)系[5].本研究發(fā)現(xiàn)，與飼喂jaz1基因缺失突變體相比，飼喂PhJAZ1過表達(dá)擬南芥(PhJAZ1-OX/jaz1)能夠顯著提高棉鈴蟲幼蟲的體重和存活率，表明PhJAZ1基因?qū)az1突變體擬南芥的抗蟲性有顯著抑制效果，能夠彌補(bǔ)jaz1突變體擬南芥中缺失的JAZ1的功能.這說明就抗蟲性而言，PhJAZ1與擬南芥的同源基因AtJAZ1的功能相似，能夠在一定程度上抑制擬南芥的抗蟲性.此外，PhJAZ1過表達(dá)能極顯著降低擬南芥中單寧和生物堿的含量，以及顯著降低毛竹中單寧的含量，這表明PhJAZ1對(duì)部分次生物質(zhì)的合成存在抑制作用，從而調(diào)節(jié)植物的抗蟲性.然而，PhJAZ1對(duì)毛竹中次生代謝物質(zhì)含量的影響與對(duì)擬南芥中次生代謝物質(zhì)含量的影響不同，可能是由于PhJAZ1過表達(dá)毛竹的構(gòu)建是采用瞬時(shí)表達(dá)的方式，且PhJAZ1對(duì)次生代謝物質(zhì)的表達(dá)起抑制作用，故次生代謝物質(zhì)在短期內(nèi)不會(huì)有明顯的變化，也可能是由于擬南芥與毛竹中的下游靶標(biāo)基因有差異，具體原因有待進(jìn)一步研究.

在毛竹中構(gòu)建PhJAZ1瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系，并對(duì)抗蟲相關(guān)PhSPL家族基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于野生型毛竹，PhJAZ1瞬時(shí)轉(zhuǎn)化毛竹中的部分PhSPL基因相對(duì)表達(dá)量呈上調(diào)趨勢(shì)，說明PhJAZ1對(duì)部分PhSPL基因的表達(dá)存在調(diào)控作用.基于擬南芥、水稻和毛竹SPL基因的同源性分析表明，PhSPL9-1和PhSPL3-1屬于類擬南芥AtSPL9/15基因，PhSPL12-1和PhSPL11-1屬于類擬南芥SPL2/6基因[21].在擬南芥中，SPL9、SPL15可以對(duì)黃酮類化合物(如花青素)的合成進(jìn)行負(fù)調(diào)控[14]；花青素能響應(yīng)低溫、生物、干旱和鹽脅迫，保護(hù)植物免受損害[25]；同時(shí)，SPL9可以結(jié)合到JAZ蛋白的N端，通過阻止其降解維持對(duì)JA信號(hào)途徑的負(fù)調(diào)控，從而降低植株的抗蟲性[19].本試驗(yàn)結(jié)果表明：在毛竹中構(gòu)建瞬時(shí)轉(zhuǎn)化PhJAZ1體系后，類擬南芥SPL9/15基因PhSPL9-1和PhSPL3-1的表達(dá)上調(diào)，可以防止PhJAZ1降解，從而持續(xù)對(duì)JA信號(hào)途徑進(jìn)行負(fù)調(diào)控.而結(jié)合對(duì)毛竹次生代謝物質(zhì)含量的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，類擬南芥SPL9/15基因PhSPL9-1和PhSPL3-1對(duì)黃酮類化合物合成的調(diào)控作用與擬南芥SPL9的作用[14]存在差異，這有待進(jìn)一步驗(yàn)證.另外，SPL6可以正調(diào)控?cái)M南芥的免疫反應(yīng)[26]，而在毛竹中過表達(dá)PhJAZ1后，類擬南芥SPL2/6基因PhSPL12-1和PhSPL11-1的表達(dá)呈上調(diào)趨勢(shì)，說明這兩個(gè)基因的作用可能與擬南芥SPL2/6基因的作用存在差異.

綜上所述，毛竹在受到食葉害蟲為害時(shí)能夠觸發(fā)JA信號(hào)通路調(diào)節(jié)抗蟲相關(guān)PhSPL家族基因的表達(dá)以抵御蟲害，而PhJAZ1是其中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)下游PhSPL家族基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而間接影響次生代謝物質(zhì)的表達(dá)，最終達(dá)到調(diào)節(jié)毛竹抗蟲性的目的.