水稻DUF761基因家族的鑒定及在非生物逆境中的表達(dá)分析

張應(yīng)新，盛鋒，杜雪竹，胡琴

(湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 湖北 武漢 430062)

0 引言

我國是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國，農(nóng)業(yè)安全和糧食安全對維持社會穩(wěn)定，保障人民利益，推動國家發(fā)展具有重要的意義[1-2].水稻(OryzasativaL.)是我國最重要的糧食作物，水稻高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、綠色是育種家追求的重要目標(biāo).近年來，因?yàn)檗r(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境的日益惡化、耕地面積減少、極端氣候多發(fā)等因素，對水稻生產(chǎn)造成了重大的損失[3].干旱、高溫、鹽害等非生物逆境是限制水稻高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的主要因素[4-6].進(jìn)一步挖掘和鑒定水稻抗逆相關(guān)基因資源，結(jié)合分子育種技術(shù)，推動水稻抗逆品種(系)的開發(fā)與培育，對保障水稻產(chǎn)業(yè)的綠色可持續(xù)發(fā)展具有重大的意義.

未知功能域蛋白(Domain of unknown Function，DUF)是一大類功能尚未被表征的蛋白家族，目前在蛋白家族 Pfam(http://pfam.xfam.org/)數(shù)據(jù)庫中已收錄超過5 000種含有DUF結(jié)構(gòu)域的蛋白家族，約占所有已知蛋白家族的27%[7].隨著分子生物學(xué)研究方法的不斷創(chuàng)新，大量未知功能基因被分離鑒定，其生物學(xué)功能也得到了初步驗(yàn)證.但是，即便是擬南芥、水稻等模式植物，也依舊有著大量功能未知的基因.近年來，迅速發(fā)展的基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的為研究DUF家族基因功能提供了有力的生物學(xué)信息支撐，有關(guān)DUF參與植物生長發(fā)育和逆境應(yīng)答方面的研究報(bào)道越來越多，表明DUF家族在植物生命活動中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[8].

模式植物擬南芥和水稻中的研究表明，大量DUF基因家族在植物響應(yīng)非生物逆境脅迫中發(fā)揮重要作用.Xin等發(fā)現(xiàn)，擬南芥DUF231家族成員ESK1(At3g55990)負(fù)調(diào)控植物對冷脅迫的適應(yīng)性，該基因突變后對冷脅迫的耐受性明顯增強(qiáng)，且不依賴于傳統(tǒng)的冷適應(yīng)機(jī)制[9].在擬南芥中超量表達(dá)DUF966基因家族成員AtAuxRP3(At3g46110)后，轉(zhuǎn)基因材料表現(xiàn)出葉片畸形、花序異常等生長素異位積累相關(guān)表型；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥中生長素含量增加，下游生長素響應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)量也明顯上調(diào)表達(dá)，同時(shí)對NaCl和滲透脅迫更加敏感，表明AtAuxRP3可能通過調(diào)控生長素的合成以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)協(xié)同調(diào)控植物的生長發(fā)育以及對非生物逆境的抗性[10].Yang等對擬南芥DUF4228基因家族進(jìn)行非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)模式分析以及互作蛋白研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，幾乎所有的擬南芥DUF4228基因成員都不同程度受到非生物逆境脅迫(NaCl、冷和干旱脅迫)的誘導(dǎo)差異表達(dá)，且在部分基因在地上和地下部分的表達(dá)模式存在明顯差異；蛋白互作實(shí)驗(yàn)證實(shí)部分DUF4228成員能夠與已報(bào)道的非生物逆境調(diào)控因子發(fā)生互作，如AT1G21010和AT1G29195能夠與PP2A互作[11-13], AT1G28190能夠與WRKY15和ATL6互作[14], AT1G76660能夠與WRKY40和CML38互作[15]，暗示擬南芥DUF4228蛋白可能通過上述逆境調(diào)控因子參與植物對非生物脅迫的應(yīng)答[16].在水稻中，Luo等發(fā)現(xiàn)水稻DUF966基因家族成員OsDSR2顯著受到鹽、干旱、高溫等逆境脅迫誘導(dǎo)下調(diào)表達(dá)，OsDSR2超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因水稻對高鹽和干旱脅迫的耐受性明顯降低，抗逆相關(guān)基因如OsNCED4、SNAC1、OsbZIP23的表達(dá)量也顯著減少[17].Cui 等發(fā)現(xiàn)超量表達(dá)水稻DUF1 645家族成員OsSGL能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因水稻對干旱的耐受性，轉(zhuǎn)基因材料中脯氨酸和可溶性糖含量明顯增加，丙二醛含量降低，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)也表明在超量表達(dá)材料中逆境響應(yīng)相關(guān)基因明顯上調(diào)表達(dá)，說明OsSGL正向調(diào)控水稻對干旱脅迫耐受性[18].以上研究結(jié)果表明，DUF基因家族在植物響應(yīng)非生物逆境脅迫中發(fā)揮重要作用，且相關(guān)成員通常會在轉(zhuǎn)錄水平上對各種脅迫做出響應(yīng)，為利用反向遺傳學(xué)的研究方法篩選植物非生物逆境相關(guān)基因提供了便利.

DUF761基因家族起源于裸子植物并廣泛存在于維管植物中.近年來在棉花纖維細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)一類新的微絲結(jié)合蛋白GhCFE1，該結(jié)合蛋白含有DUF761和DUF4408結(jié)構(gòu)域,超量表達(dá)該基因后出現(xiàn)抑制棉纖維細(xì)胞的起始和伸長[19]，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域均可在擬南芥DUF761家族中發(fā)現(xiàn)，但其具體的生物學(xué)功能尚未可知.本研究利用生物信息學(xué)的研究方法對 DUF76家族進(jìn)行了系統(tǒng)的分析同時(shí)結(jié)合非生物逆境誘導(dǎo)表達(dá)模式鑒定水稻中與非生物逆境響應(yīng)相關(guān)的DUF761成員，為后續(xù)進(jìn)一步開展DUF761基因功能研究奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)搜索和OsDUF761基因的鑒定以“DUF761”為關(guān)鍵詞在國家水稻數(shù)據(jù)庫RGAP(http://rice.plantbiology.msu.edu/)中檢索水稻DUF761基因成員并下載其DNA序列、編碼區(qū)序列和蛋白質(zhì)序列以及染色體位置.分別使用在線分析軟件ExPASyProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)對OsDUF761s蛋白質(zhì)理化性質(zhì)進(jìn)行分析；利用CELLOv.2.5(http://cello.life.nctu.edu.tw/)和PSORT(https://psort.hgc.jp/)軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測.

1.2 水稻DUF761的染色體定位以及蛋白質(zhì)進(jìn)化分析從RGAP database下載OsDUF761家族成員的物理位置信息并繪制染色體物理定位圖.分別從RGAP database和中TAIR(https://www.arabidopsis.org)下載水稻和擬南芥 DUF761家族成員蛋白質(zhì)序列，利用MEGA6.0軟件，采用 NJ (neighbor-joining)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹.

1.3 水稻DUF761基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域分析從RGAP database中下載水稻DUF761的基因組信息以及外顯子-內(nèi)含子分布數(shù)據(jù)，利用GSDS 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)繪制DUF761家族基因結(jié)構(gòu)分布圖.利用在線軟件Pfam(http://pfam.janelia.org/)進(jìn)行蛋白質(zhì)保守域分析.

1.4 水稻DUF761基因啟動子順式作用元件分析利用RGAP database獲取了7個(gè)OsDUF761基因 (起始密碼子ATG)上游序列的1 500 bp基因組片段作為啟動子區(qū)段，通過在線分析軟件PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)進(jìn)行OsDUF761家族成員啟動子順式作用元件分析.

1.5 植物材料與處理本研究選用野生型日本晴水稻幼苗進(jìn)行非生物脅迫研究來明確OsDUF761基因家族逆境脅迫應(yīng)答機(jī)制.具體操作參照本實(shí)驗(yàn)室前人研究進(jìn)行[20].

1.6 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄利用Eastep? Super Total RNA Extraction試劑盒(Promega)抽提上述試驗(yàn)葉片總RNA，具體步驟參照說明書進(jìn)行.RNA于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?利用Go ScriptTMReverse Transcription Kit (Promega) 進(jìn)行cDNA合成，cDNA于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?RT-qPCR分析利用qPrimerDB-qPCR Primer Database(https://biodb.swu.edu.cn/qprimerdb/)設(shè)計(jì)RT-qPCR引物，以Ubiquitin7(UB7, LOC_Os03g13170)作為內(nèi)參基因，引物序列如表2所示.參照Power Up SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems)試劑盒說明書，于CFX ConnectTMReal-Time System(BIO-RAD)進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng),并采用 2-ΔΔCT計(jì)算基因的相對表達(dá)水平.

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻DUF761鑒定以7個(gè)擬南芥DUF761蛋白為探針，在水稻全基因組(Oryzasativa)中共檢索到7個(gè)編碼包含DUF761結(jié)構(gòu)域的水稻OsDUF761成員，進(jìn)一步利用 Pfam 數(shù)據(jù)庫搜索 DUF761 結(jié)構(gòu)域證實(shí)這7個(gè)成員都屬于DUF761 家族，并將這些基因命名為OsDUF761.01～OsDUF761.07.對其基因和蛋白質(zhì)序列進(jìn)行初步分析發(fā)現(xiàn)，OsDUF761所編碼的蛋白質(zhì)含有696～1 002個(gè)氨基酸殘基，相對分子量為25.50～36.66 kD，等電點(diǎn)為3.87～10.2.蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示部分OsDUF761蛋白在兩種軟件(CELLO v.2.5和PSORT)下的預(yù)測結(jié)果有明顯差異，其中OsDUF761.01和OsDUF761.07定位于質(zhì)膜，OsDUF761.02定位于線粒體內(nèi)膜或葉綠體類囊膜，OsDUF761.03定位于質(zhì)膜或細(xì)胞核，OsDUF761.04定位于質(zhì)膜或細(xì)胞質(zhì)，OsDUF761.05和OsDUF761. 06定位于質(zhì)膜或葉綠體類囊體膜(表1).亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明水稻DUF761蛋白有著非常復(fù)雜的亞細(xì)胞定位，但是均含有生物膜定位信號，暗示其生物學(xué)功能可能依賴其膜定位特征實(shí)現(xiàn).

表1 水稻DUF761s基因的序列特征

亞細(xì)胞定位，“A”和“B”表示分別通過軟件CELLO v.2.5(http://cello.life.nctu.edu.tw/)和PSORT(https://psort.hgc.jp/)預(yù)測蛋白的亞細(xì)胞定位的結(jié)果；P.M：質(zhì)膜；Nucl：細(xì)胞核；Cyto：細(xì)胞質(zhì)；C.t.m：葉綠體類囊體膜；M.t.m：線粒體內(nèi)膜.

2.2 OsDUF761家族基因染色體定位從RGAP database中獲取OsDUF761s的物理位置信息，分析發(fā)現(xiàn)7個(gè)OsDUF761基因分別定位于3、 6、7、8、10和12號染色體上.除12號染色體上含有2個(gè)OsDUF761基因外，其他染色體上均只含有1個(gè)OsDUF761基因(圖1).

圖1 OsDUF761s基因在水稻染色體中定位和分布情況

2.3 水稻和擬南芥DUF761家族進(jìn)化樹分析為更加直觀地了解DUF761蛋白的進(jìn)化關(guān)系，利用MEGA 6.0軟件對水稻和擬南芥DUF761蛋白進(jìn)行親緣關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)擬南芥和水稻DUF761 蛋白成員可以劃分為3個(gè)亞族(Ⅰ～Ⅲ).其中AT2G26110與OsDUF761.01、OsDUF761.04、OsDUF761.05、OsDUF761.06和OsDUF761.07屬于亞族Ⅰ；AT5G54300、AT1G61260、AT1G11210、AT1G11220、AT1G11230與OsDUF761.03屬于亞族Ⅱ； AT4G04990、AT1G15385與OsDUF761.04屬于亞族Ⅲ(圖2).

2.4 水稻DUF761家族基因結(jié)構(gòu)和蛋白結(jié)構(gòu)域分析進(jìn)一步我們獲取了RGAP database中OsDUF761s的基因序列、編碼區(qū)(CDS)序列和蛋白序列.基因結(jié)構(gòu)分析顯示，OsDUF761s基因結(jié)構(gòu)相似，均只含有一個(gè)外顯子(圖3).蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測顯示，OsDUF761家族成員大多含有2個(gè)保守的DUF761結(jié)構(gòu)域(圖4).上述結(jié)果說明OsDUF761家族成員在基因結(jié)構(gòu)以及蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域在進(jìn)化上較為保守.

圖2 水稻和擬南芥DUF761蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖3 水稻OsDUF761s基因結(jié)構(gòu)

圖4 OsDUF761s蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域分析

圖5 水稻DUF761s家族啟動子區(qū)域分析

2.5 水稻DUF761家族順式作用元件分析為進(jìn)一步分析水稻OsDUF761s可能參與的生理過程，我們RGAP database獲取了OsDUF761s基因的啟動子序列，并對其所含的順式作用元件進(jìn)行預(yù)測分析.如圖5所示，除ProOsDUF761.02、ProOsDUF761.07外，其余ProOsDUF761s均含有厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件(A)和不同類型的光響應(yīng)元件，說明這兩類順式作用元件在ProOsDUF761s中保守存在.各個(gè)ProOsDUF761均含有多個(gè)逆境相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件(M、R、L、和K)、防御和逆境響應(yīng)元件(P)、低溫響應(yīng)元件(J)或缺氧響應(yīng)元件(H)；ProOsDUF761.03、ProOsDUF761.04、ProOsDUF761.05和ProOsDUF761.06含有干旱誘導(dǎo)相關(guān)MYB結(jié)合元件(L)；ProOsDUF761.01、ProOsDUF761.03、ProOsDUF761.04和ProOsDUF761.05含有WRKY轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件(I)；ProOsDUF761.02和ProOsDUF761.04含有逆境脅迫響應(yīng)元件(P)；ProOsDUF761.01和ProOsDUF761.02和ProOsDUF761.04含有低溫響應(yīng)元件(J).與植物激素響應(yīng)相關(guān)的順式元件有3類，ProOsDUF761.01、ProOsDUF761.02和ProOsDUF761.05含有水楊酸響應(yīng)元件(Q)；ProOsDUF761.03、ProOsDUF761.04、ProOsDUF761.06和ProOsDUF761.07含有茉莉酸甲酯響應(yīng)元件(G)；ProOsDUF761.01、ProOsDUF761.03、ProOsDUF761.04和ProOsDUF761.06脫落酸響應(yīng)元件(A).由此可見，每個(gè)ProOsDUF761啟動子含有不同功能的順式作用元件，說明它們可能通過不同的信號通路參與多種環(huán)境脅迫反應(yīng).

圖6 OsDUF761基因在10% PEG、4 ℃和NaCl處理下的表達(dá)模式分析

圖7 OsDUF761基因在脫水脅迫處理下的表達(dá)模式分析

2.6 OsDUF761s基因的非生物逆境表達(dá)模式分析為進(jìn)一步驗(yàn)證順勢作用元件預(yù)測的準(zhǔn)確性，同時(shí)明確OsDUF761s基因家族在水稻抵御非生物逆境脅迫中應(yīng)答機(jī)制，我們利用qRT-PCR分析7個(gè)OsDUF761在PEG、低溫、NaCl以及脫水脅迫下的誘導(dǎo)表達(dá)模式(圖6、圖7).OsDUF761.01在水稻苗期本底表達(dá)水平非常低，且在4種非生物逆境下都未能檢測到表達(dá)水平，因此對其表達(dá)模式不進(jìn)行探討.采用qPrimerDB-qPCR Primer Database設(shè)計(jì)RT-qPCR引物(表2)，以水稻OsActin(LOC_Os03g50885)為內(nèi)參基因進(jìn)行RT-qPCR分析.結(jié)果表明，OsDUF761.02在PEG和NaCl處理下表達(dá)水平較低，與Mock無明顯差異；但是顯著受到低溫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，在低溫處理24 h與Mock相比上調(diào)倍數(shù)達(dá)195.2倍.

表2 用于RT-qPCR分析的OsDUF761s基因和內(nèi)參基因的引物列表

OsDUF761.03在NaCl和低溫處理下先誘導(dǎo)上調(diào)達(dá)到峰值后逐漸下降至本底水平，其中在NaCl處理1 h與Mock相比誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)倍數(shù)最為顯著達(dá)34.3倍，在低溫處理6 h與Mock相比誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)倍數(shù)最為顯著達(dá)12.9倍；總體表現(xiàn)受NaCl和低溫處理誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，對PEG處理無明顯響應(yīng).OsDUF761.04在PEG和NaCl處理下與Mock相比無明顯差異，僅在個(gè)別時(shí)間點(diǎn)有明顯的上調(diào)表達(dá)，PEG處理下在1 h 和 12 h分別上調(diào)17.6倍和33.3倍，NaCl處理下在1 h上調(diào)18.5倍；在低溫處理下呈現(xiàn)出明顯的上調(diào)表達(dá)(6 h)再下調(diào)(12 h)再上調(diào)(24 h)的表達(dá)模式，在6 h 和24 h上調(diào)表達(dá)倍數(shù)為14.5和85.8倍；總體表現(xiàn)受PEG、NaCl和低溫處理誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，且對低溫處理響應(yīng)最顯著.OsDUF761.05在PEG處理下與Mock相比無明顯差異；在NaCl處理下僅在12 h 有明顯的下調(diào)表達(dá)，下調(diào)倍數(shù)約為3.5倍；在低溫處理下表現(xiàn)出先上調(diào)(3 h)再下調(diào)(12 h)再上調(diào)(24 h)的表達(dá)模式，其中在6 h和24 h上調(diào)表達(dá)倍數(shù)較高達(dá)48.9倍和62.6倍；總體表現(xiàn)對PEG和NaCl處理不明顯，受低溫處理顯著誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá).OsDUF761.06在PEG處理下表達(dá)模式較為復(fù)雜，先上調(diào)再下調(diào)再上調(diào)表達(dá)；但是差異表達(dá)倍數(shù)均在2倍左右；在NaCl處理下先上調(diào)表達(dá)然后逐漸降低至本底水平，在 1 h表達(dá)差異最大，差異倍數(shù)達(dá)4.4倍；在低溫處理下明顯下調(diào)表達(dá)，在 6 h表達(dá)量下調(diào)最為明顯，差異倍數(shù)達(dá)9.6倍；總體表現(xiàn)為對PEG和NaCl處理響應(yīng)不明顯，有略微上調(diào)表達(dá)，但受低溫處理顯著誘導(dǎo)下調(diào)表達(dá).OsDUF761.07在PEG處理下表現(xiàn)出先上調(diào)然后降低到本底水平的表達(dá)模式，但是對PEG處理響應(yīng)不顯著，在3 h差異倍數(shù)最大為2.6倍；受 NaCl處理下顯著下調(diào)表達(dá)，在12 h下調(diào)倍數(shù)最為顯著達(dá)7.6倍；在低溫處理整體表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)，僅在24 h 表達(dá)量有略微上調(diào)，在12 h下調(diào)倍數(shù)最為顯著達(dá)5.8倍，總體表現(xiàn)為受PEG處理誘導(dǎo)略微上調(diào)表達(dá)，受NaCl和低溫處理誘導(dǎo)下調(diào)表達(dá).

在脫水脅迫下，OsDUF761.03、OsDUF761.04和OsDUF761.05表現(xiàn)出受脫水脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的趨勢.其中OsDUF761.03在脫水處理6 h表達(dá)水平達(dá)到峰值上調(diào)倍數(shù)為17.9倍，OsDUF761.04在脫水處理3 h上調(diào)表達(dá)最為顯著，差異倍數(shù)達(dá)243倍，OsDUF761.05在脫水處理12 h表達(dá)量上調(diào)最為顯著達(dá)10.2倍；其余基因如OsDUF761.02、OsDUF761.06和OsDUF761.07均有不同程度受脫水脅迫誘導(dǎo)下調(diào)表達(dá)，其中OsDUF761.07下調(diào)表達(dá)最為顯著，在12 h下調(diào)倍數(shù)為61.8倍，OsDUF761.02在12 h下調(diào)倍數(shù)為19.1倍，OsDUF761.06在3 h下調(diào)倍數(shù)為2.4倍.

3 討論

水稻是我國重要的糧食作物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有舉足輕重的地位.保障水稻的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)，對維護(hù)社會安定和糧食安全具有重要意義.隨著社會經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展、全球人口的持續(xù)增長，糧食安全問題日益凸顯.此外，由于全球氣候變化導(dǎo)致極端天氣頻繁發(fā)生以及農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境的日益惡劣，進(jìn)一步加劇了糧食安全問題.植物對環(huán)境脅迫的抗性有著復(fù)雜的遺傳和分子基礎(chǔ)，形成了精細(xì)且嚴(yán)密的分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控對逆境的感知、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗性相關(guān)物質(zhì)積累以及抗性“記憶”等方面，最終在形態(tài)、生理和生化水平上發(fā)生一系列改變以抵御逆境[21].近年來，隨著功能基因組學(xué)的迅速發(fā)展，有關(guān)DUF基因的功能報(bào)道越來越多，也揭示了其在植物生長發(fā)育和逆境響應(yīng)中的重要調(diào)控作用[22].DUF761基因家族起源于裸子植物并廣泛存在于維管植物中.在模式植物擬南芥中的研究表明，含有DUF761結(jié)構(gòu)域的DUF761-1基因(At4G16790)可能參與了植物防御反應(yīng)以及細(xì)胞壁形態(tài)建成.超量表達(dá)該基因會導(dǎo)致植物葉片形態(tài)、花序以及角果形態(tài)異常，同時(shí)對丁香假單胞菌抗性增強(qiáng)[23].

目前，在水稻中尚無DUF761家族成員的功能報(bào)道.基于DUF761基因家族在植物生長發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)中的重要功能，本研究對水稻DUF761基因家族成員及其可能參與的逆境響應(yīng)進(jìn)行了初步的研究，為進(jìn)一步探討OsDUF761基因在水稻響應(yīng)非生物脅迫中的功能提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù).在水稻中鑒定出7個(gè)DUF761基因(OsDUF761.01-OsDUF761.02)，分布在水稻3、6、7、8、10和12號染色體上；來源于擬南芥和水稻的DUF761蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹表明， DUF761蛋白在進(jìn)化上能夠分為3個(gè)亞類，并且每一個(gè)亞類中都包含單、雙子葉植物的DUF761蛋白，說明DUF761蛋白的基本特征在單、雙子葉植物分化之前已經(jīng)形成.基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域分析表明，OsDUF761s基因結(jié)構(gòu)類似，均只有1個(gè)外顯子，其編碼蛋白包含有1～2個(gè)保守的DUF761結(jié)構(gòu)域，進(jìn)一步說明了DUF761成員間在進(jìn)化和功能上的保守性.OsDUF761s亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明，大多數(shù)OsDUF761蛋白都具有生物膜(細(xì)胞膜、線粒體膜、葉綠體膜等)定位特征，暗示其功能可能與生物膜相關(guān)生理生化過程有關(guān).

非生物脅迫誘導(dǎo)基因的表達(dá)受其上游啟動子順式作用元件及轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，對基因啟動子區(qū)段所含有的順式作用元件進(jìn)行分析，能夠初步預(yù)測該基因可能參與的脅迫響應(yīng)[24].在本研究中，利用PlantCARE對7個(gè)OsDUF761基因的啟動子區(qū)段(ProOsDUF761)進(jìn)行順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，OsDUF761啟動子區(qū)段所含有的順式作用元件可以分為3類.一類是與直接與非生物脅迫相關(guān)的順式作用元件，包括光響應(yīng)元件Box4(F)和G-Box(I)、厭氧誘導(dǎo)元件ARE(D)、低溫響應(yīng)元件LTR(J)和脅迫響應(yīng)元件TC-rich repeats(P)；第二類是參與脅迫相關(guān)激素響應(yīng)的順式作用元件，包括脫落酸響應(yīng)順式作用元件ABRE(A)、茉莉酸甲酯響應(yīng)順式作用元件TGACG-motif(H)、水楊酸響應(yīng)順式作用元件TCA-element(Q)；第三類是脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式作用元件，包括干旱誘導(dǎo)MYB結(jié)合位點(diǎn)MBS(K)、MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件(L)、MYC轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件(M)、WRKY轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件W box(R).這些非生物逆境相關(guān)順式作用元件在OsDUF761s啟動子區(qū)域的廣泛存在暗示OsDUF761s基因可能在水稻響應(yīng)非生物脅迫中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用.因此，本研究對OsDUF761s基因在PEG、4 ℃、NaCl和脫水脅迫下的時(shí)空表達(dá)模式進(jìn)行了分析.結(jié)果表明，6個(gè)OsDUF761s基因在PEG、4 ℃、NaCl和脫水脅迫下都有不同程度的差異表達(dá)，尤其是.在PEG處理下，只有OsDUF761.04和OsDUF761.07有不同程度的的上調(diào)表達(dá)；但是在脫水脅迫下，OsDUF761.04受脫水脅迫顯著誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，OsDUF761.07受脫水脅迫顯著誘導(dǎo)下調(diào)表達(dá)，說明OsDUF761.04和OsDUF761.07在水稻響應(yīng)滲透脅迫和極端干旱中存在明顯的功能分化，且水稻體內(nèi)存在不同的機(jī)制去調(diào)控OsDUF761.04在OsDUF761.07的表達(dá)以區(qū)分響應(yīng)這兩種脅迫類型.我們還發(fā)現(xiàn)除OsDUF761.02只對低溫和脫水脅迫有明顯響應(yīng)外，其余成員對低溫、NaCl和脫水脅迫下均有明顯的差異表達(dá)，說明OsDUF761基因家族成員主要參與水稻對低溫、NaCl和脫水脅迫等脅迫的抗逆調(diào)控.其中OsDUF761.03受NaCl處理誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)最為顯著，OsDUF761.07受NaCl處理誘導(dǎo)下調(diào)表達(dá)最為顯著；OsDUF761.02受低溫處理誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)最為顯著，OsDUF761.06受低溫處理誘導(dǎo)下調(diào)表達(dá)最為顯著；OsDUF761.04受脫水處理誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)最為顯著，OsDUF761.07受脫水處理誘導(dǎo)下調(diào)表達(dá)最為顯著.上述基因可以作為后續(xù)研究重點(diǎn)進(jìn)一步解析其在水稻抵御非生物逆境中的生物學(xué)功能，并為利用基因工程改良水稻的抗逆能力提供基因資源和參考依據(jù).

4 結(jié)論

基于DUF761基因家族在植物生長發(fā)育和非生物脅迫響應(yīng)中的重要作用，本研究鑒定出水稻中共有7個(gè)DUF761s基因，并對水稻DUF761s基因家族的染色體定位、進(jìn)化樹、基因結(jié)構(gòu)和蛋白功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了分析；對水稻DUF761s基因家族啟動子順式作用元件進(jìn)行了預(yù)測；對水稻DUFs家族基因在多種非生物脅迫下表達(dá)模式進(jìn)行了檢測，為后續(xù)研究水稻DUFs家族響應(yīng)非生物脅迫的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)，為進(jìn)一步研究水稻DUF761的功能提供了參考.