多種高效能氨基酸檢測方法在飼料檢驗(yàn)中的對比研究

黎媚媚

（廣東省茂名市質(zhì)量計(jì)量監(jiān)督檢測所，廣東茂名 525000）

飼料中蛋白質(zhì)的含量與畜牧業(yè)的發(fā)展密切相關(guān)[1-3]。將飼料中的蛋白質(zhì)吸收為動物蛋白，可以大幅提高養(yǎng)殖的生長發(fā)育速度。蛋白質(zhì)是養(yǎng)殖過程中需要攝入的必需營養(yǎng)素，蛋白質(zhì)可以促進(jìn)組織的再生和生命的新陳代謝，是構(gòu)成生物組織細(xì)胞膜的重要部分。動物對蛋白質(zhì)的需求來源于對氨基酸的需求。因而，飼料中含有的氨基酸種類和數(shù)量無疑是決定飼料品質(zhì)的明顯標(biāo)志，對氨基酸的分析方法的研究一直受到高度重視。綜上所述，選取合適的方法[4-6]檢驗(yàn)飼料中的氨基酸成分刻不容緩。

目前，社會的發(fā)展對動物養(yǎng)殖的安全性提出了更嚴(yán)格的要求，必須掌握飼料中氨基酸和蛋白質(zhì)的最佳含量，精準(zhǔn)提高飼料中蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化率，促進(jìn)動物的養(yǎng)殖速度，降低飼料成本。在常用的動物養(yǎng)殖飼料中，魚粉含有的氨基酸含量和配比較高，且其氨基酸的種類與養(yǎng)殖動物的氨基酸較為類似，該食品安全性較好，易消化，是動物蛋白的重要來源。所以，此次研究選擇魚粉作為研究對象，用于測量動物飼料含有的氨基酸。

1 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

飼料樣品（大豆和魚粉等混合飼料）；蘇氨酸、脯氨酸、丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸和酪氨酸等氨基酸18 種，濃度均為99%。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

乙腈、甲醇、抗壞血酸、冰醋酸、草酸甲酯、苯酚、氯化鈉、茚三酮、過氧化氫、2,4-二硝基氯苯、氫氧化鋰、硝酸銀、乙酸鈉、醋酸-醋酸鈉混合溶液、苯酚、鹽酸、氫氧化鈉、甲酸、低速離心機(jī)、碳酸氫鈉。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

剪刀、飼料粉碎機(jī)、溫控儀、渦旋儀、氨基酸分析儀、天平、電子天平、真空泵、鑷子、培養(yǎng)箱、濃縮器、C18 色譜柱電烘箱、pH 酸度計(jì)、高效液相色譜儀、超聲波清洗機(jī)、萬能電烘箱、電加熱烘箱、水浴等。

2 氨基酸檢測方法

本次氨基酸檢測依據(jù)GB/T 18246-2019《飼料中氨基酸的測定》，該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了飼料中總氨基酸（肽鍵結(jié)合和游離的）和游離氨基酸（天然和添加的）測定方法，包括常規(guī)酸水解法、氧化酸水解法、堿水解法和酸提取法。

2.1 微波水解-氨基酸自動分析儀法

實(shí)際檢測中，微波技術(shù)以其響應(yīng)速度快、能量消耗低、操作較簡便等優(yōu)點(diǎn)逐漸進(jìn)入人們的視野。采用微波堿解法對樣品進(jìn)行水解，既可以規(guī)避常規(guī)堿解的缺點(diǎn)，又可以方便地控制堿解過程。具有過程安全、節(jié)省時間、容易操作的優(yōu)點(diǎn)。

2.1.1 樣品的處理

選用脂肪低于5% 的飼料樣品，精確稱取0.010 0 mg～0.050 0 mg（要求精確到0.000 1 mg 級別），將其放于PTFE 消解管中，加入氫氧化鈉溶液10 mL，然后充入氮?dú)? min。微波水解的堿濃度、水解溫度和水解時間選擇因子和正交試驗(yàn)條件。

取出PTFE 消解管，先將管置于常溫冷卻30 min，然后取出溶液放置于30 mL 容量瓶中，滴加5 mol/L 的HCl 溶液，中和溶液至中性狀態(tài)，用水稀釋至刻度。

2.1.2 分析統(tǒng)計(jì)方法

使用常見的SPSS 20.0 軟件，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析對比，多重對比時采用Duncan 法，將兩種方法的結(jié)果采用t 檢驗(yàn)進(jìn)行比較。當(dāng)P 小于0.01 時，認(rèn)為是顯著差異。

2.2 近紅外光譜分析法

2.2.1 樣品的處理

本實(shí)驗(yàn)的所有樣品均由食品研磨機(jī)研磨，然后混合并儲存在4℃的環(huán)境下保持。對于魚粉飼料樣品，進(jìn)行脫脂、干燥、粉碎，然后冷藏備用。

2.2.2 飼料中氨基酸的檢測

往飼料魚粉的樣品中添加一定量的蛋白質(zhì)裂解液，制作氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液[7-8]。將氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液置于氨基酸分析儀，梯度洗脫法把各種氨基酸洗脫于溶液中，同時設(shè)置一組氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行空白對照，利用濕法化學(xué)對所有樣品魚粉中的氨基酸進(jìn)行檢測。

2.2.3 樣品數(shù)據(jù)的驗(yàn)證

實(shí)驗(yàn)中近紅外光譜儀掃描分析魚粉樣品，通過對數(shù)據(jù)進(jìn)行推測，對比以往的數(shù)據(jù)，根據(jù)t 檢驗(yàn)方法，從而驗(yàn)證數(shù)據(jù)的科學(xué)性。

2.3 高效液相色譜法

2.3.1 樣品溶液的配制

稱量少許的動物飼料樣品中常見的18種氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)樣品，保證其中氨基酸含量控制在60 mg～80 mg，放入250 mL 容量瓶中，使用0.1 mol/L 鹽酸定容，搖勻溶解樣品或?qū)悠肪鶆蚍稚⒃谌芤褐?，得? 000 mg/L 20 種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)液，充入氮?dú)?，噴燈密封，然后放置烘箱?10±1）℃水解24 h，室溫環(huán)境下冷卻至常溫。使用試管準(zhǔn)確量取5 mL 該混合溶液，使用濃縮器對該試管濃縮處理，加入稀鹽酸水解，取出上層清液保存在冰箱中供實(shí)驗(yàn)備用。

2.3.2 高效液相色譜的調(diào)節(jié)條件

條件設(shè)置為C18 型色譜柱，A 相為CH3OH 溶液；B 相為乙酸混合溶液，控制流動相的速度為1.5 mol/min；進(jìn)樣量10 μL，設(shè)定柱溫32℃，選用紫外光的波長290 nm，等度洗脫，流動A 相:流動B 相=1:8。

2.3.3 飼料樣品曲線的制備

分別選取濃度為25 mg/L、50 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L、350 mg/L、450 mg/L、550 mg/L、650 mg/L 的氨基酸溶液各100 μL 的混合溶液，注入有機(jī)塑料膜處理，控制進(jìn)液量為5 μL，通過軟件測試。以鹽酸濃度為橫坐標(biāo)，以氨基酸的峰面積值為縱坐標(biāo)，作出魚粉飼料的相關(guān)氨基酸圖像。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 不同檢驗(yàn)方法下的水解條件對比

為研究分析不同檢測方法對飼料中含有的氨基酸水解時間的影響，選取魚粉和豆粕等測試樣品進(jìn)行預(yù)測試，按照定義的方法測試食品樣品的氨基酸水解方法。

飼料氨基酸樣品的微波水解處理溫度為160℃，設(shè)定處理的時間為30 min。采用高效液相色譜法測定時，設(shè)定水解的溫度控制在140℃，時間為15 min 時，魚粉水解氨基酸的結(jié)果值與正常條件下的胺值較為接近；采用近紅外光譜分析法測定時，設(shè)置水解的溫度170℃，設(shè)置處理時間在27 min，魚粉中水解氨基酸值遠(yuǎn)高于標(biāo)準(zhǔn)水解條件。綜合比較三種方法下飼料魚粉的氨基酸水解條件，認(rèn)為高效液相色譜法處理時，氨基酸的水解時間最小，溫度處理的時間也最短，水解效果也最好。

3.2 不同檢驗(yàn)方法對氨基酸峰面積的影響

將飼料樣品加入3 mol/L、5 mol/L、7 mol/L、9 mol/L、11 mol/L 不同濃度梯度的鹽酸溶液中，放入水浴中進(jìn)行水解，取上清液過濾，送入氨基酸分析或高效液相色譜法確定氨基酸的種類，以峰面積為指標(biāo)，確定鹽酸的最佳濃度。

如圖1 至圖3 所示，在各個氨基酸樣品放入不同濃度的鹽酸溶液，來檢驗(yàn)各個氨基酸面積峰值。通過實(shí)驗(yàn)曲線可以看出，隨著鹽酸的濃度從3 mol/L 增至7 mol/L，氨基酸峰面積隨著鹽酸濃度的增加呈上升趨勢。隨后鹽酸濃度逐漸增高，氨基酸峰面積逐漸減小。根據(jù)三種實(shí)驗(yàn)圖像曲線可以看出，使用高效液相色譜法測量的一組，結(jié)果氨基酸峰面積值較高，且檢測效果更好；而使用近紅外光譜分析法測量的一組，結(jié)果氨基酸峰面積值很少，檢測效果也相對更差。

圖1 微波水解-氨基酸自動分析儀法測量時的氨基酸峰面積

圖2 高效液相色譜分析法測量時的氨基酸峰面積

圖3 近紅外光譜分析法測量時的氨基酸峰面積

3.3 不同分析方法對飼料氨基酸測定結(jié)果的影響

如表1 所示，采用微波水解-氨基酸自動分析儀法時，檢測結(jié)果中飼料中氨基酸組成成分與實(shí)際組成結(jié)果差距很大，各種氨基酸相似度的偏差范圍在2.5%到 6.5%之間不等；采用近紅外光譜分析法時，檢測結(jié)果中飼料中氨基酸成分和含量與實(shí)際組成較為相似，各種氨基酸相似度的偏離范圍約為0.22%到1.25%之間；采用高效液相色譜分析法檢驗(yàn)時，檢測結(jié)果中飼料中氨基酸成分和含量與實(shí)際基本相同，各種氨基酸相似度的偏差范圍控制在0.02%～0.1%之間。根據(jù)實(shí)驗(yàn)檢測方法對氨基酸結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)高效液相色譜法進(jìn)行檢驗(yàn)時，飼料魚粉中的氨基酸與實(shí)際情況基本相同，檢驗(yàn)效果最小。

表1 不同分析方法對飼料氨基酸的組成影響（單位：mol/L）

3.4 不同檢驗(yàn)方法對氨基酸穩(wěn)定性的影響

如表2 所示，采用微波水解-氨基酸自動分析儀法時，檢測結(jié)果中飼料中氨基酸穩(wěn)定性與實(shí)際情況差距很大，各種氨基酸相似度的偏差范圍在1.52%到5.55%之間不等；采用近紅外光譜分析法時，檢測結(jié)果中飼料中氨基酸穩(wěn)定性與實(shí)際情況差距相對較小，各種氨基酸相似度的偏差范圍在0.25%到0.86%之間；采用高效液相色譜分析法檢驗(yàn)時，檢測結(jié)果魚粉飼料穩(wěn)定性與實(shí)際情況基本相同，氨基酸的偏離范圍控制在0.02%～0.11%之間。根據(jù)實(shí)驗(yàn)檢測方法對氨基酸穩(wěn)定性結(jié)果的影響，認(rèn)為采用高效液相色譜法檢驗(yàn)時，飼料魚粉中的氨基酸與實(shí)際結(jié)果基本相同，對氨基酸穩(wěn)定性影響最弱，結(jié)果偏差最小。

表2 不同分析方法對氨基酸穩(wěn)定性的影響（單位：mol/L）

3.5 不同檢驗(yàn)方法對氨基酸含量的影響

采用微波水解-氨基酸自動分析儀法時，檢測結(jié)果中氨基酸的檢驗(yàn)值大于實(shí)際正常值，各種氨基酸的變異系數(shù)較大；采用近紅外光譜分析法時，檢測結(jié)果中飼料中氨基酸的測量值略高于實(shí)際標(biāo)準(zhǔn)值，各種氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)差在0.15%～0.25%之間；采用高效液相色譜法時，檢測結(jié)果中飼料中氨基酸的測量值與實(shí)際標(biāo)準(zhǔn)值基本相似，各種氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)最小。

綜合分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，三種測定方法檢驗(yàn)達(dá)到了檢測飼料中氨基酸含量和組分的標(biāo)準(zhǔn)。

4 結(jié)論

（1）本次研究通過開展實(shí)驗(yàn)，采用了微波水解-氨基酸自動分析儀法、近紅外光譜分析法和高效液相色譜法等三種檢測方法對飼料中氨基酸的含量和組分進(jìn)行了測量。

（2）通過對比不同檢測方法下水解條件、氨基酸峰面積、氨基酸測量結(jié)果、氨基酸的穩(wěn)定性等，對三種方法的優(yōu)劣勢進(jìn)行了分析。

（3）綜合分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，三種測定方法都滿足實(shí)際需求，但高效液相色譜法具有操作方便、檢測準(zhǔn)確度高、檢測效率高等優(yōu)點(diǎn)，適用于動物飼料中氨基酸含量的批量檢測。