顱內(nèi)大血管急性閉塞血栓病理學(xué)特征與病因相關(guān)性☆

邢瑩 朱良付 李天曉 王麗娜 劉秋雨 權(quán)曉強(qiáng) 周志龍 馬振凱 吳立恒 劉楊輝 張洋 周騰飛 管民 李強(qiáng) 孔令非

顱內(nèi)大血管閉塞急性缺血性卒中（acute ischemic stroke，AIS）發(fā)病率逐年上升，是導(dǎo)致人類殘死的主要疾病之一[1]。近年來，多項(xiàng)大型隨機(jī)對照臨床試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)了對AIS 行血管內(nèi)治療（endovascular treatment，EVT）的有效性[2]，并推薦將其作為大血管閉塞AIS 首選治療策略。盡管EVT 技術(shù)不斷進(jìn)步，但仍存在部分患者未能實(shí)現(xiàn)成功再通[3]。雖然明確病因?qū)IS 再通治療和預(yù)防至關(guān)重要，但研究顯示30%～40%AIS 是病因不明的[4]。EVT 使我們能獲得血栓標(biāo)本和觀察不同病因所致顱內(nèi)大血管急性閉塞血栓的組織學(xué)成分及病理特征。本研究通過回顧性分析我院卒中中心收治的行EVT的AIS 患者血栓標(biāo)本和臨床資料，對不同病因所致的顱內(nèi)大血管閉塞患者的血栓病理學(xué)特征進(jìn)行探究。

1 資料與方法

1.1 研究對象前瞻性收集2018 年12 月至2021 年2 月本中心收治的行EVT 的AIS。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥18 歲；②臨床診斷為AIS，發(fā)病到動脈穿刺時(shí)間前循環(huán)≤12 h、后循環(huán)≤24 h[5]；③數(shù)字減影血管成像（digital subtraction angioplasty，DSA）證實(shí)為顱內(nèi)大血管急性閉塞，包括頸內(nèi)動脈、大腦中動脈M1 和M2段、椎基底動脈；④本次發(fā)病前改良Rankin量表（modified Rankin scale，mRS）評分≤2 分；⑤術(shù)前美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表（the National Institutes of Health stroke scale，NIHSS）評分≥6 分；⑥獲得了可供病理學(xué)研究的顱內(nèi)血栓標(biāo)本；⑦獲得患者或家屬術(shù)前簽署的知情同意。

1.2 血栓標(biāo)本分析所有血栓標(biāo)本經(jīng)10%中性磷酸福爾馬林溶液中固定24 h，完成組織脫水，石蠟包埋，后沿血栓長軸方向做3 μm 厚的連續(xù)切片。常規(guī)HE染色，在顯微鏡（奧林巴斯BX-53，日本）下觀察其病理學(xué)特征并儲存圖像。應(yīng)用病理圖像分析軟件（Motic Images Plus 3.0，廈門）進(jìn)行圖像分析，量化紅細(xì)胞（red blood cell,RBC）、纖維蛋白/血小板（fibrin and platelet,Fibrin/PLT）、白細(xì)胞（white blood cell,WBC）的面積，并計(jì)算出相應(yīng)的面積百分比。

根據(jù)RBC 在血栓病理組分構(gòu)成中的比例將血栓分為紅色血栓組、白色血栓組和混合性血栓組[6]，其中，RBC 含量比Fibrin/PLT 含量高15%以上為紅色血栓組，本研究將RBC 含量比Fibrin/PLT 含量高90%以上、鏡下幾乎全為RBC的血栓另行定義為泛紅細(xì)胞血栓（但不計(jì)入紅色血栓組）（圖1A）；Fibrin/PLT含量比RBC 含量高15%以上為白色血栓組，本研究將Fibrin/PLT 含量比RBC 含量高90%以上、鏡下幾乎無RBC的血栓另行定義為乏紅細(xì)胞血栓（但不計(jì)入白色血栓組）（圖1B）；其他病例歸類為混合性血栓組（表1）。

表1 血栓分組定義表

圖1 血栓病理圖片 A.泛紅細(xì)胞血栓（HE染色，200×）；B.乏紅細(xì)胞血栓（HE染色，200×）。

此外，本研究將顯微鏡下觀察到的“胭脂征”和“花豹征”2 種病理征象（典型圖像為100 倍鏡下）分別定義如下：①“胭脂征”，即在HE染色的白色血栓組中，RBC 細(xì)胞群以較規(guī)則的紅色片狀、條狀在白色血栓組中突兀出現(xiàn)，且界限分明，酷似胭脂（圖2D）；②“花豹征”，在HE染色的白色血栓組中，RBC與纖維蛋白交錯(cuò)分布，酷似豹紋（圖3D）。病理學(xué)征象由兩位從事顱內(nèi)血栓病理學(xué)研究的醫(yī)師獨(dú)立判斷，意見不一致時(shí)經(jīng)協(xié)商達(dá)成共識。

圖2 病例1 DSA、血栓大體和病理圖 患者男，69 歲，突發(fā)意識不清4 h，既往有高血壓、冠心病和房顫病史。A.再通治療前DSA 示基底動脈尖閉塞（紅色箭頭）；B.ACE 60 抽吸治療回收的大體血栓標(biāo)本；C.一次抽栓后造影示基底動脈全程通暢，TICI 3級；D.血栓病理示“胭脂征”（HE染色，100×）。

圖3 病例2 DSA、血栓大體和病理圖 患者男，36 歲，突發(fā)意識不清伴右側(cè)肢體活動不利5.5 h，既往有房顫病史。A.再通治療前DSA示左側(cè)大腦中動脈閉塞（紅色箭頭）；B.經(jīng)Solitaire FR（4 mm×20 mm）取栓后回收的大體血栓標(biāo)本；C.一次取栓后造影示左側(cè)大腦中動脈血流通暢，TICI 3級；D.血栓病理示“花豹征”（HE染色，100×）。

1.3 病因分型據(jù)改良TOAST（trial of Org 10 172 in acute stroke treatment，TOAST）分型[7]將納入的大血管閉塞患者病因分為大動脈粥樣硬化型（atherosclerotic，AT）組、心源性栓塞型（cardioembolism，CE）組、不明原因型（stroke of undetermined etiology，SUE）組3 組。分型由兩位高級職稱神經(jīng)介入專家獨(dú)立判斷，意見不一致時(shí)經(jīng)協(xié)商達(dá)成共識。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 26 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以百分比（n，%）描述，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s描述，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或單因素方差分析。非正態(tài)分布的計(jì)量資料，采用中位數(shù)和上下四分位數(shù)[M，（QL,QU）]描述，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，多項(xiàng)對比采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)。采用加權(quán)Kappa系數(shù)評估病因分型和病理學(xué)特征的兩位觀察者之間的一致性。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征共納入99例患者，男70例（70.7%），女29 例（29.3%），平均年齡（65.67±13.19）歲，25 例（25/99，25.3%）接受靜脈溶栓。其中30 例（30.3%）為AT 組，59 例（59.6%）為CE 組，10 例（10.1%）為SUE組（表2）。兩位觀察者對病因分型判斷結(jié)果具有高度一致性（加權(quán)Kappa=0.733）。見圖4。

表2 不同病因組血栓成分比較

圖4 入組流程圖

2.2 血栓病理學(xué)特征血栓的組織學(xué)成分主要由RBC、Fibrin/PLT及WBC構(gòu)成。根據(jù)血栓分組定義，其中44 例為白色血栓組（發(fā)現(xiàn)4 例有“花豹征”，23例有“胭脂征”），31例為紅色血栓組，9例為混合性血栓組，乏紅細(xì)胞血栓11例，泛紅細(xì)胞血栓4例。未發(fā)現(xiàn)含有膽固醇結(jié)晶、鈣化成分或粘液瘤細(xì)胞的血栓。

2.2.1不同血栓類型組基線資料比較 白色血栓組、混合性血栓組和紅色血栓組的基線資料比較顯示：三組血栓年齡、卒中高危因素、NIHSS 評分、橋接治療、血管內(nèi)治療時(shí)間節(jié)點(diǎn)、血管再通率等均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；但發(fā)現(xiàn)白色血栓組中可回收支架使用率高，紅色血栓組中抽吸裝置取栓使用率高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.031）。

2.2.2病因與病理學(xué)特征 不同卒中病因分型的血栓所含組分的百分比不同，CE 組和SUE 組的血栓中Fibrin/PLT 含量高，RBC 含量低，而AT 組的血栓中Fibrin/PLT 含量低，RBC 含量高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），WBC 含量在不同病因之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.768）（圖5 和表3）。乏紅細(xì)胞血栓僅出現(xiàn)在CE 組和SUE 組，分別占13.6%（8/59）和30%（3/10），而泛紅細(xì)胞血栓僅出現(xiàn)在AT 組，占13.3%（4/30）?！半僦鳌痹贑E 和SUE 中比例更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.037），而4 例（6.8%）“花豹征”僅在CE 組中發(fā)現(xiàn)（圖6 和表3）?！半僦鳌庇^察結(jié)果具有較高的一致性（加權(quán)Kappa=0.593）；“花豹征”觀察結(jié)果具有很高的一致性（加權(quán)Kappa=0.876）。

表3 不同血栓類型組基線資料比較

圖5 不同病因組血栓成分的對比箱式圖

圖6 不同病因組乏紅細(xì)胞、泛紅細(xì)胞、“花豹征”和“胭脂征”的對比柱狀圖

本研究發(fā)現(xiàn)白色血栓組和紅色血栓組在AT、CE 和SUE 三組病因中均可出現(xiàn)，但是在CE 組和SUE 組中白色血栓的比例高于AT 組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.020）?；旌闲匝ㄔ谌M病因間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.432）。

3 討論

既往探究血栓病理和卒中病因的研究有限，且結(jié)果頗具爭議[8-13]。本研究首次提出了乏紅細(xì)胞血栓、泛紅細(xì)胞血栓的定義和“花豹征”及“胭脂征”病理征象，這些定義和征象對大血管急性閉塞AIS 的病因診斷具有價(jià)值。

病因不同的血栓其RBC、Fibrin/PLT、WBC的組分含量差異既往報(bào)告不一。本研究結(jié)果顯示：與CE 和SUE 組相比，在AT 組中RBC 含量高而Fibrin/PLT 含量低，這與NIESTEN 等[10]研究結(jié)果一致，但和KIM 等[13]和SATO 等[14]的結(jié)論矛盾。我們推測這與樣本量的大小有關(guān)，樣本量越大，在CE 組中發(fā)現(xiàn)乏紅細(xì)胞血栓的比例會隨之增高（本研究中乏紅細(xì)胞血栓發(fā)現(xiàn)率為11.1%），而乏紅細(xì)胞血栓的比例對結(jié)果可有直接的影響。

本研究的CE 組內(nèi)含有較高的Fibrin/PLT 含量和較低的RBC 含量，推測可能是CE 組血栓多為栓齡較長的機(jī)化血栓，血栓中纖維蛋白的含量較高且結(jié)構(gòu)較致密，而RBC含量的不同可能與脫落的栓子的大小及栓子在顱內(nèi)血管部位孵育時(shí)間長短有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)“花豹征”僅發(fā)生在CE 組中，而“胭脂征”在AT 組和CE 組中均有發(fā)現(xiàn)，但是多發(fā)生于CE 組中（P=0.037）。本研究推測“花豹征”形成的原因是：此類栓子為栓齡較久的分層機(jī)化血栓，栓子中的纖維蛋白含量高且結(jié)構(gòu)更為致密，這種分層機(jī)化血栓可能易在心臟特定的血流動力學(xué)狀態(tài)下形成。有關(guān)“胭脂征”形成的原因，推測是心源性栓子栓塞至顱內(nèi)導(dǎo)致血管急性閉塞后，短時(shí)間內(nèi)RBC等雖能以栓子為核心孵育組成新鮮血栓，但是這些孵育生成的RBC不易和栓子有較完整的、緊密的粘附，更難與結(jié)構(gòu)致密栓子整合為一體，在后繼取栓操作過程中，栓子表面包裹的疏松紅色血栓多會散落，殘存的RBC細(xì)胞群則在顯微鏡下以較規(guī)則的紅色片狀、條狀在白色血栓組中突兀出現(xiàn)，且界限分明，形成了酷似“胭脂”的鏡下表現(xiàn)。

本研究中CE 組和SUE 組基線資料上未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，SUE 組的血栓組分表現(xiàn)出與CE 組相同的特點(diǎn)，F(xiàn)ibrin/PLT 含量較高和RBC 含量較低。在病理學(xué)特征方面，也觀察到SUE 組和CE 組之間的相似性以及與AT組的差異。提示SUE組具多來源于心源性栓塞，這與之前的研究結(jié)果一致[8-9]。

文獻(xiàn)報(bào)告SUE 組占AIS 的30%左右[4]。對于同時(shí)存在動脈粥樣硬化和栓塞兩種病因的SUE組，往往提示預(yù)后不良[15]。本文通過探究血栓病理特征有助于進(jìn)一步明確SUE組的原因，進(jìn)而對患者開展有針對性的二級預(yù)防，降低卒中復(fù)發(fā)率。

我國AT 患病率高達(dá)46.6%[16]，在臨床工作中仍存在不少不易確定的AT病例。本研究發(fā)現(xiàn)泛紅細(xì)胞血栓僅出現(xiàn)在AT 組，這對AT 病因確定具有特異性。推測泛紅細(xì)胞血栓的原因是不穩(wěn)定動脈粥樣硬化性斑塊病變多形成的新鮮血栓，這些血栓在顱內(nèi)血管孵育時(shí)間較短時(shí)，纖維蛋白含量低，多含有豐富的RBC。

膽固醇結(jié)晶是膽固醇的固體晶體形式，存在于動脈粥樣硬化中，被認(rèn)為是動脈粥樣硬化斑塊中的特異成分。既往研究報(bào)告過AT組中發(fā)現(xiàn)膽固醇結(jié)晶，但是發(fā)現(xiàn)率較低[17]，本研究中未發(fā)現(xiàn)膽固醇結(jié)晶的存在。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)告顯示膽固醇結(jié)晶的血栓容易堵塞顱內(nèi)小血管使遠(yuǎn)端小血管閉塞，常導(dǎo)致分水嶺梗死[18]。本研究納入患者均為急診行EVT 治療的顱內(nèi)大血管閉塞，考慮這也是本研究未發(fā)現(xiàn)膽固醇結(jié)晶的原因之一。

本研究結(jié)果表明，組織病理學(xué)評估可以成為區(qū)分心源性和非心源性血栓發(fā)病機(jī)制的一個(gè)有價(jià)值的選擇。毫無疑問，對明確卒中病因的患者可進(jìn)行針對性的二級預(yù)防措施，降低卒中復(fù)發(fā)率[19-20]。目前對于SUE 組的二級預(yù)防的世界標(biāo)準(zhǔn)依賴于抗血小板聚集[21]，至少對大血管閉塞的患者群體來說，這是值得重新考慮的。因此，在常規(guī)檢查及術(shù)中發(fā)現(xiàn)不能明確卒中原因的情況下，回收血管內(nèi)治療中捕獲的血栓進(jìn)行病理學(xué)研究是有意義的。

本研究存在的局限性：首先，排除了無法完成病理切片制作及自發(fā)溶解或溶栓后再通的血栓；其次，本研究中有89.9%的患者成功實(shí)現(xiàn)了再通，我們無法評估未成功再通患者的完整血栓；最后，本文具有單中心研究固有的局限性，未來的前瞻性多中心研究可進(jìn)一步驗(yàn)證。