SIX4和miR-103a-3p在膽囊癌組織中的表達(dá)及其對膽囊癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響

陳超，李俊霖，朱朝庚

（1.永州市中心醫(yī)院 肝膽外科，湖南 永州 425100；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 肝膽外科，湖南長沙 410021）

膽囊癌作為膽囊上皮惡性腫瘤，約占全部膽道腫瘤的2/3，與其他消化道腫瘤相比，膽囊癌起病隱匿，但早期已通過淋巴結(jié)、血液擴(kuò)散轉(zhuǎn)移，危害嚴(yán)重[1]。多數(shù)膽囊癌患者在發(fā)現(xiàn)時已至晚期，因此盡早發(fā)現(xiàn)與膽囊癌有關(guān)的因子，對于治療具有重要意義。微小RNA（microRNA，miRNA）作為過度保守的短鏈非編碼RNA，在腫瘤中通過靶向目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，進(jìn)而調(diào)控癌癥發(fā)展[2]。研究顯示，miR-103a-3p在不同癌細(xì)胞中的作用不同，在前列腺癌中抑制癌癥進(jìn)展，而在結(jié)直腸癌中促進(jìn)癌癥進(jìn)展[3-4]。目前有關(guān)miR-103a-3p在膽囊癌中的作用尚未見相關(guān)研究。SIX同源盒蛋白4（SIX homeobox 4，SIX4）的表達(dá)異常參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，增強(qiáng)多種類型腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，同時SIX4亦是多種miRNA的靶基因[5-7]，但SIX4 在膽囊癌中的功能尚不清楚。本研究旨在了解膽囊癌組織中miR-103a-3p、SIX4的表達(dá)情況，觀察過表達(dá)miR-103a-3p對膽囊癌細(xì)胞SIX4表達(dá)及癌細(xì)胞增殖、侵襲的影響，初步探討其機(jī)制，以期為膽囊癌的靶向治療提供一定參考。

1 材料和方法

1.1 研究對象

組織：膽囊癌組織及癌旁組織（距離癌組織＞2 cm）取自永州市中心醫(yī)院2019 年10 月至2021 年9 月32 例接受手術(shù)治療的膽囊癌患者，患者術(shù)前均未接受化療等抗腫瘤治療。從癌癥體細(xì)胞突變目錄（COSMIC）數(shù)據(jù)庫（https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic）中下載膽囊癌組織樣本數(shù)據(jù)，包括樣本的基本信息和病理數(shù)據(jù)。

細(xì)胞：膽囊癌細(xì)胞系GBC-SD購自北納生物（產(chǎn)品編號：BNCC341817）。

1.2 試劑與儀器

引物由上海生工生物工程科技有限公司合成；SIX4 野生型（wild type，WT）、SIX4 突變型（mutant，MUT）、mimic NC、miR-103a-3p mimic、Lipofectamine?2000 試劑盒、pc DNA3.1 質(zhì)粒、pc DNA3.1-SIX4 質(zhì)粒均購自廣州銳博生物公司；CCK-8試劑盒購自碧云天生物科技有限公司（貨號：C0037）；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒、一抗兔源SIX4、增殖細(xì)胞核相關(guān)抗原Ki-67、增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）2、MMP9 以及內(nèi)參GAPDH、二抗羊抗兔，均購自英國Abcam公司（貨號分別為：ab228530、ab176713、ab16667、ab92552、ab92536、ab76003、ab9485、ab6721）。

實時熒光定量PCR（qRT-PCR）儀，美國Applied公司（型號：7500）；蛋白凝膠成像系統(tǒng)，上海天能科技有限公司（型號：Tanon 5200）；酶標(biāo)儀，深圳匯松生物科技發(fā)展有限公司（型號：MB-530）。

1.3 實驗方法

1.3.1 qRT-PCR檢測組織中SIX4 mRNA、miR-103a-3p水平：膽囊癌組織以及對應(yīng)癌旁組織分別取30 mg，冰上研磨充分，添加1 mL Trizol，提取組織中總RNA，分光光度計檢測RNA濃度和純度。RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，qRT-PCR儀檢測組織中SIX4、miR-103a-3p以及對應(yīng)內(nèi)參β-actin、U6。引物序列：SIX4 F：5’-TCTCGGGGTGATCGACAAGAA-3’，R：5’-CCC TTTGTTCATTCGTTCCTGG-3’；β-actin F：5’-CCTG GCACCCAGCACAAT-3’，R：5’-GCTGATCCACAT CTGCTGGAA-3’；miR-103a-3p F：5’-GAGCAGCAT TGTACAG-3’，R：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；U6 F：5’-CTCGCTTCGGCAGCAGCACA-3’，R：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。反應(yīng)條件：95 ℃、75 s；95 ℃、30 s，60 ℃、40 s，45個循環(huán)。2-ΔΔCT法對SIX4、miR-103a-3p表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。

1.3.2 雙熒光素酶鑒定miR-103a-3p與SIX4的靶向關(guān)系：TargetScan數(shù)據(jù)庫查找SIX4 mRNA的3’UTR與miR-103a-3p的結(jié)合位點。設(shè)計合成SIX4的3’UTR WT和3’UTR MUT（SIX4 3’UTR-WT、SIX4 3’UTRMUT），分別與miR-103a-3p mimic或mimic NC共轉(zhuǎn)染GBC-SD細(xì)胞中，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測各組熒光素酶活性。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)及分組：GBC-SD細(xì)胞用10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，將細(xì)胞置于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞狀態(tài)，在細(xì)胞密度85%左右傳代，細(xì)胞傳代3次進(jìn)行實驗。

實驗分五組：對照組、mimic NC組、miR-103a-3p mimic組、miR-103a-3p mimic+pc DNA3.1 組、miR-103a-3p mimic+SIX4組。對照組GBC-SD細(xì)胞正常培養(yǎng)，mimic NC組GBC-SD細(xì)胞Lipofectamine?2000試劑盒轉(zhuǎn)染50 nmol/L mimic NC，其余各組Lipofectamine?2000試劑盒轉(zhuǎn)染50 nmol/L miR-103a-3p mimic，miR-103a-3p mimic組轉(zhuǎn)染至正常培養(yǎng)GBCSD細(xì)胞，miR-103a-3p mimic+pc DNA3.1組轉(zhuǎn)染至已經(jīng)轉(zhuǎn)染過pc DNA3.1空載體且穩(wěn)定表達(dá)的GBC-SD細(xì)胞，miR-103a-3p mimic+SIX4組轉(zhuǎn)染至已經(jīng)轉(zhuǎn)染過pc DNA3.1-SIX4質(zhì)粒且穩(wěn)定表達(dá)的GBC-SD細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6 h，更換為10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，進(jìn)行后續(xù)研究。

1.3.4 qRT-PCR檢測細(xì)胞中SIX4 mRNA、miR-103a-3p水平：“1.3.3”細(xì)胞處理后，加1 mL Trizol，提取總RNA，參考“1.3.1”檢測細(xì)胞中SIX4 mRNA、miR-103a-3p水平。

1.3.5 蛋白印跡法檢測細(xì)胞中SIX4蛋白水平：“1.3.3”細(xì)胞處理后，添加蛋白裂解液，冰上孵育10 min，12 000 r/min 4 ℃離心20 min，上清為總蛋白，BCA蛋白試劑盒對總蛋白濃度進(jìn)行測定。25 μg蛋白上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；添加SIX4、GAPDH一抗，置于4 ℃孵育過夜；洗滌后添加對應(yīng)二抗，常溫下孵育1 h。DAB顯色試劑盒顯色，蛋白凝膠成像系統(tǒng)拍照和定量分析。

1.3.6 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖情況：按照1.3.3處理細(xì)胞后，離心收集細(xì)胞，細(xì)胞濃度稀釋成1×104個/mL，每孔100 μL接種于96孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，只添加培養(yǎng)液孔為空白組，培養(yǎng)相同時間，加入CCK-8試劑后繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀中450 nm處測定溶液吸光度（optical density，OD）值。

1.3.7 Transwell檢測細(xì)胞侵襲情況：Transwell小室經(jīng)基質(zhì)膠包被后放入24 孔板中。按照“1.3.3”處理細(xì)胞后，離心收集細(xì)胞，細(xì)胞用單純的RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋成5×103個/mL，每孔500 μL接種于Transwell小室上層，小室下層添加10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，24孔板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，取出細(xì)胞，結(jié)晶紫染色5 min，蒸餾水清除背景色，顯微鏡下拍照并計數(shù)。

1.3.8 蛋白印跡法檢測細(xì)胞中Ki-67、PCNA、MMP2、MMP9蛋白水平：按照“1.3.5”方法檢測細(xì)胞中Ki-67、PCNA、MMP2、MMP9蛋白水平，一抗為Ki-67、PCNA、MMP2、MMP9、GAPDH。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

統(tǒng)計學(xué)軟件GraphPad 9.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計量資料以（）描述，兩組間比較采用配對t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗；采用Person相關(guān)性分析檢測SIX4與miR-103a-3p的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膽囊癌及癌旁組織中SIX4 mRNA、miR-103a-3p表達(dá)情況

與癌旁組織相比，膽囊癌組織中SIX4 mRNA水平升高（t=21.795，P＜0.001），miR-103a-3p水平降低（t=20.753，P＜0.001），見圖1。SIX4與miR-103a-3p表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.419，P=0.017），見圖2。在癌癥體細(xì)胞突變目錄（COSMIC）數(shù)據(jù)庫的168個膽囊癌樣本中，SIX4 mRNA的平均水平為（2.87±0.64），miR-103a-3p的平均水平為（0.49±0.05）；Person分析結(jié)果顯示，SIX4與miR-103a-3p表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.154，P=0.046），見圖3。

圖1 膽囊癌（n=32）及癌旁組織（n=32）中SIX4 mRNA（A）、miR-103a-3p（B）水平比較

圖2 臨床膽囊癌組織樣本（n=32）中SIX4 mRNA與miR-103a-3p的相關(guān)性分析

圖3 COSMIC數(shù)據(jù)庫中膽囊癌樣本（n=168）SIX4 mRNA與miR-103a-3p的相關(guān)性分析

2.2 雙熒光素酶驗證miR-103a-3p與SIX4的靶向關(guān)系

TargetScan分析發(fā)現(xiàn)，SIX4 mRNA的3’UTR含有miR-103a-3p序列保守堿基，見圖4A。雙熒光素酶實驗驗證二者的靶向關(guān)系，結(jié)果顯示，與mimic NC+SIX4 3’UTR-WT相比，miR-103a-3p mimic+SIX4 3’UTR-WT細(xì)胞熒光素酶相對活性下降（F=48.728，P＜0.001），見圖4B。

圖4 miR-103a-3p與SIX4的靶點預(yù)測（A）和靶向關(guān)系驗證（B）

2.3 各組細(xì)胞中SIX4、miR-103a-3p表達(dá)情況

5組間比較，SIX4 mRNA（F=82.606，P＜0.001）和蛋白（F=229.772，P＜0.001）水平及miR-103a-3p水平（F=48.603，P＜0.001）差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。分別與對照組、mimic NC組相比，miR-103a-3p mimic組、miR-103a-3p mimic+pc DNA3.1組、miR-103a-3p mimic+SIX4組細(xì)胞中SIX4 mRNA和蛋白水平降低（P＜0.05），miR-103a-3p水平升高（P＜0.05）；分別與miR-103a-3p mimic組、miR-103a-3p mimic+pc DNA3.1組相比，miR-103a-3p mimic+SIX4組細(xì)胞中SIX4 mRNA和蛋白水平升高（P＜0.05），miR-103a-3p水平降低（P＜0.05），見圖5。

圖5 各組細(xì)胞中SIX4 mRNA（A）和蛋白（B）、miR-103a-3p（C）水平比較（n=6，）

2.4 各組細(xì)胞增殖情況

5 組細(xì)胞OD450值比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=25.985，P＜0.001）。分別與對照組、mimic NC組相比，miR-103a-3p mimic組、miR-103a-3p mimic+pc DNA3.1組細(xì)胞中OD450降低（P＜0.05）；分別與miR-103a-3p mimic組、miR-103a-3p mimic+pc DNA3.1組相比，miR-103a-3p mimic+SIX4組細(xì)胞中OD450升高（P＜0.05）。見圖6。

圖6 各組細(xì)胞增殖情況比較（n=6，）

2.5 各組細(xì)胞侵襲情況

5組細(xì)胞侵襲數(shù)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=96.255，P＜0.001）。分別與對照組、mimic NC組相比，miR-103a-3p mimic組、miR-103a-3p mimic+pc DNA3.1組、miR-103a-3p mimic+SIX4組細(xì)胞侵襲數(shù)量降低（P＜0.05）；分別與miR-103a-3p mimic組、miR-103a-3p mimic+pc DNA3.1組相比，miR-103a-3p mimic+SIX4組細(xì)胞侵襲數(shù)量升高（P＜0.05）。見圖7、圖8。

圖7 各組細(xì)胞侵襲情況（×200）

圖8 各組細(xì)胞侵襲數(shù)量比較（n=6，）

2.6 各組細(xì)胞中Ki-67、PCNA、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)情況

5組細(xì)胞中Ki-67、PCNA、MMP2、MMP9蛋白水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=18.133、80.484、27.124、68.126，均P＜0.001）。分別與對照組、mimic NC組相比，miR-103a-3p mimic組、miR-103a-3p mimic+pc DNA3.1組細(xì)胞中Ki-67、PCNA、MMP2、MMP9蛋白水平，miR-103a-3p mimic+SIX4 組細(xì)胞中PCNA蛋白水平降低（P＜0.05）；分別與miR-103a-3p mimic組、miR-103a-3p mimic+pc DNA3.1組相比，miR-103a-3p mimic+SIX4 組細(xì)胞中Ki-67、PCNA、MMP2、MMP9蛋白水平升高（P＜0.05）。見圖9。

圖9 各組細(xì)胞中Ki-67、PCNA、MMP2、MMP9蛋白水平比較（n=6，）

3 討論

目前治療膽囊癌的有效方法是膽囊癌根治性切除術(shù)，但只對早期膽囊癌有較好的治療效果，晚期（Ⅲ、Ⅳ期）患者尚無手術(shù)指征[8-9]。膽囊癌初期無明顯癥狀，發(fā)現(xiàn)時往往已至晚期，不再適合手術(shù)治療，且晚期患者常出現(xiàn)淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致其預(yù)后較差[10]。因此，尋找新的治療方法及靶點對于膽囊癌的治療具有較高意義。

目前，許多研究證明miRNA畸變與膽囊癌進(jìn)展有關(guān)。Jiang等[11]報道，與相鄰的正常組織相比，miR-365在人類膽囊癌組織中的表達(dá)降低，miR-365可能具有抑制腫瘤的作用。Li等[12]研究發(fā)現(xiàn)，miR-188-5p在人膽囊癌組織中表達(dá)下調(diào)，miR-188-5p通過靶向Wnt2b和Smad2 在膽囊癌中發(fā)揮抑癌作用。Zong等[13]發(fā)現(xiàn)，miR-125b在膽囊癌組織中下調(diào)，是膽囊癌進(jìn)展的抑制因子。以上研究均提示miRNAs可能被用作膽囊癌的治療標(biāo)志物。有研究已經(jīng)揭示miR-103a-3p在前列腺癌[14]、甲狀腺癌[15]中均影響癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移，為疾病治療提供新靶標(biāo)，但目前尚缺少其在膽囊癌中作用的研究。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-103a-3p在膽囊癌組織中低表達(dá)，推測低表達(dá)miR-103a-3p可能影響膽囊癌的發(fā)生發(fā)展。深入研究發(fā)現(xiàn)，在膽囊癌細(xì)胞中過表達(dá)miR-103a-3p可以抑制癌細(xì)胞的增殖和侵襲，這與其在非小細(xì)胞肺癌中的研究[16]正好相反，推測其可能是由于細(xì)胞類型不同導(dǎo)致miR-103a-3p的表達(dá)趨勢發(fā)生改變。本研究進(jìn)一步驗證了細(xì)胞增殖、侵襲的蛋白表達(dá)情況。Ki-67、PCNA作為增殖標(biāo)志蛋白，Ki-67高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞周期、腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，PCNA在細(xì)胞增殖啟動中發(fā)揮重要作用[17]；MMP2 作為重要的Ⅳ型膠原酶，分泌過多會促進(jìn)腫瘤擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移[18]；MMP9 參與腫瘤細(xì)胞穿透基底膜和血管，可促進(jìn)腫瘤發(fā)生和發(fā)展[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，在膽囊癌細(xì)胞中過表達(dá)miR-103a-3p可抑制細(xì)胞中Ki-67、PCNA、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)，與增殖、侵襲實驗結(jié)果一致，證實miR-103a-3p可通過下調(diào)相關(guān)蛋白表達(dá)抑制膽囊癌細(xì)胞增殖和侵襲。

miRNA通過結(jié)合靶基因的3’UTR調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，進(jìn)而調(diào)控疾病。既往研究揭示了miR-103a-3p在各種腫瘤中的多個靶點，如非小細(xì)胞肺癌中的CCNE1[20]、膠質(zhì)瘤中的PDK4[21]。在本研究中，生物信息學(xué)分析預(yù)測SIX4 3’UTR是miR-103a-3p的潛在結(jié)合位點，并經(jīng)雙熒光素酶驗證了這一預(yù)測。SIX4作為同源盒基因家族成員之一，最早發(fā)現(xiàn)其可調(diào)控Na+/K+-ATP酶亞基的表達(dá)[22]；SIX4在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)高于癌旁組織和遠(yuǎn)端正常組織，且其表達(dá)水平與預(yù)后關(guān)系密切，可作為臨床預(yù)測肝細(xì)胞癌預(yù)后的指標(biāo)[23]；食管鱗狀細(xì)胞癌中SIX4 表達(dá)上調(diào)，可促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌的腫瘤生長和細(xì)胞轉(zhuǎn)移[24]。上述研究說明SIX4可能是一種促癌因子。在本研究中，膽囊癌組織中SIX4 表達(dá)上調(diào)，推測SIX4 可能影響膽囊癌疾病進(jìn)展并參與介導(dǎo)miR-103a-3p抑制膽囊癌進(jìn)展的過程。此外，在miR-103a-3p過表達(dá)基礎(chǔ)上SIX4表達(dá)升高可促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲，并上調(diào)Ki-67、PCNA、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)，提示miR-103a-3p可能通過抑制靶基因SIX4 從而抑制膽囊癌細(xì)胞增殖、侵襲，實現(xiàn)對疾病的緩解。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)膽囊癌組織中miR-103a-3p低表達(dá)、SIX4 高表達(dá)，在膽囊癌細(xì)胞中過表達(dá)miR-103a-3p后能抑制SIX4的表達(dá)，從而降低膽囊癌細(xì)胞增殖、侵襲，發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究為膽囊癌的發(fā)生提供了可能的新機(jī)制，為膽囊癌患者提供了可能的治療靶點。越來越多的證據(jù)表明，miRNA替代療法（miRNA活性的提高）可以恢復(fù)失去的功能，是一種非常有前途的癌癥治療方法[25]。因此，本研究結(jié)果為miR-103a-3p膽囊癌替代治療研究提供了理論依據(jù)。然而，對于miR-103a-3p替代治療的臨床應(yīng)用，miRNA的體內(nèi)傳遞仍然是一個很大的挑戰(zhàn)。此外，還需要進(jìn)一步的實驗來分析miR-103a-3p在體內(nèi)對膽囊癌的抗腫瘤作用，以開發(fā)從實驗室到臨床的新的治療策略。再者，miR-103a-3p靶基因較多，亦可能通過別的基因發(fā)揮作用，發(fā)現(xiàn)更多與膽囊癌關(guān)系密切的靶基因也是本研究未來的重點。