后火低溫大曲曲皮和曲心細菌多樣性及基因功能預(yù)測

劉忠軍，馮廷闖，劉繼明，鐘吉安，蔡文超，郭壯*

（1.湖北文理學(xué)院湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北 襄陽 441053；2.襄陽市釀酒生物技術(shù)與應(yīng)用企校聯(lián)合創(chuàng)新中心，湖北 襄陽 441053；3.清香型白酒生物技術(shù)襄陽市重點實驗室，湖北 襄陽 441053）

清香型白酒又稱汾香型白酒，是我國白酒的主要香型之一，具有清香純正、醇甜柔和、自然諧調(diào)和余味爽凈的特點，以山西汾酒、湖北黃鶴樓和霸王醉為代表，屬大曲酒類[1-2]。清香型白酒釀造使用低溫大曲，酒曲具有糖化、發(fā)酵和生香等作用，是釀酒必不可少的輔料之一[3]。低溫大曲微生物類群構(gòu)成直接影響了白酒的風味品質(zhì)，因而對低溫大曲微生物多樣性進行解析是極為必要的。張雙燕等[4]對北京地區(qū)低溫大曲中微生物多樣性進行分析發(fā)現(xiàn)，乳桿菌屬（Lactobacillus）、片球菌屬（Pediococcus）、乳球菌屬（Lactococcus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、醋桿菌屬（Acetobacter）和芽孢桿菌屬（Bacillus）為細菌優(yōu)勢類群，假絲酵母屬（Canndida）、曲霉屬（Aspergillus）、毛霉屬（Mucor）和維克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）為真菌優(yōu)勢類群。周森等[5]對5個不同地區(qū)的11種清香型低溫大曲微生物多樣性進行研究發(fā)現(xiàn)，Bacillus、放線菌（Actinomyces）、泛菌屬（Pantoea）和葡萄球菌（Staphylococcus）為其優(yōu)勢細菌類群。

低溫大曲可分為紅心曲、清茬曲和后火曲[6]，其中清茬曲斷面一般為灰黃色且無雜色，紅心曲斷面中間有一道紅，而后火曲斷面一般會出現(xiàn)兩道眉[7]。葉光斌等[8]采用指紋圖譜技術(shù)對汾酒3種低溫大曲的細菌群落結(jié)構(gòu)進行比較亦發(fā)現(xiàn)，不同類型低溫大曲的細菌群落結(jié)構(gòu)存在一定的差異。后火曲的制作工藝具有重排列、重翻曲以及重熱晾的特點，與清茬曲和紅心曲的工藝流程基本一致，主要區(qū)別為對醅曲的溫度要求不同，清茬曲中溫大晾，后火曲大熱大晾，而紅心曲多熱少晾[9]。有研究表明3種低溫大曲中后火曲的發(fā)酵率和產(chǎn)酯量最高[10]。目前關(guān)于后火低溫大曲中微生物群落的報道較少，關(guān)于后火低溫大曲曲皮與曲心中微生物多樣性的研究亦鮮見報道。

高通量測序技術(shù)具有成本低以及能快速實現(xiàn)多個樣本間的平行比較的特點，近年來在發(fā)酵乳制品[11]、發(fā)酵肉制品[12]、發(fā)酵豆制品[13]以及發(fā)酵蔬菜制品[14-15]中廣泛應(yīng)用，全面解析了其富含的微生物類群[16]。本研究以后火低溫大曲曲皮和曲心為試驗對象，通過高通量測序技術(shù)研究解析了其細菌多樣性，同時使用PICRUSt（phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states）軟件對其細菌類群的基因功能進行預(yù)測，以期為襄陽地區(qū)清香型白酒釀造微生物菌株的收集、保藏和篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

后火低溫大曲：采集自某酒廠曲庫。

DNA基因組提取試劑盒：德國QIAGEN公司；10×聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）緩沖液、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）酶、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs）：北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物27F、1495R、M13：武漢天一輝遠生物科技有限公司。

800Y粉碎機：永康市鉑歐五金制品有限公司；Illumina MiSeq高通量測序平臺：美國Illumina公司；R930機架式服務(wù)器：美國DELL公司；Veriti 96孔梯度PCR儀：美國AB公司；ND-2000C微量紫外分光光度計：美國Nano Drop公司；CR21N高速冷凍離心機：日本HITACHI公司；FluorChem FC3型化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)：美國Protein Simple公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集

2020年12 月于某酒廠曲庫中選取庫存30 d～35 d的低溫大曲，使用瓦刀將其從中部位置砍斷后，根據(jù)截面情況對其進行分類，典型的后火低溫大曲截面如圖1所示。

圖1 后火大曲Fig.1 Houhuo Daqu

共選擇10個典型的后火大曲，將圖1中淺色區(qū)域定義為曲皮，使用經(jīng)酒精擦拭后的刀片將其切下并打成粉，編號為QP1～QP10，將圖1中深色區(qū)域定義為曲心，亦使用經(jīng)酒精擦拭后的刀片將其切下并打成粉，編號為QX1～QX10。其中相同數(shù)字編號的曲皮和曲心樣品來自于同一塊后火低溫大曲。所采集的后火低溫大曲以小麥為主要原料，經(jīng)潤糧、粉碎、加水拌合后加入曲母，混合均勻后填充到模具（37 cm×18 cm×7 cm）中，然后入室發(fā)酵，酒曲從入庫到成熟經(jīng)歷上霉（35℃～37℃）、晾霉（24℃～28℃）、潮火（40℃～47℃）、大火（32℃～46℃）以及后火期（30℃～38℃）5個步驟，翻曲9次～13次，周期約為 24 d～26 d。

1.2.2 宏基因組DNA的提取、16S rRNA序列擴增及Illumina高通量測序

按照試劑盒中的方法分別對20份樣品進行宏基因組DNA提取，參照文獻[17]中的方法對細菌16S rRNA序列V4-V5進行擴增，合格的PCR產(chǎn)物進行清潔后寄送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行Illumina MiSeq高通量測序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析

參照Zhang等[18]和Wang等[19]的方法對序列進行拼接和質(zhì)控。使用QIIME（v1.9.1）分析平臺對質(zhì)控后的序列進行生物信息學(xué)分析。依次將序列利用PyNAST軟件對齊，構(gòu)建分類操作單元（operational taxonomic units，OTU），比對代表性序列。本研究對同一測序深度下的α多樣性指標進行分析，同時基于UniFrac距離的主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）和UPGMA聚類進行β多樣性解析。

若某一OTU在所有后火大曲樣品中均存在，則該OTU定義為核心OTU；將平均相對含量大于1.0%的門和屬定義為優(yōu)勢門和屬；若某一OTU在曲皮中均存在，而在曲心中均不存在，則將該OTU定義為曲皮中的特有OTU，反之亦然[20]。

1.2.4 PICRUSt基因功能預(yù)測

使用PICRUSt軟件對后火大曲曲皮和曲心中細菌的基因功能進行預(yù)測，并參照蛋白質(zhì)直系同源簇數(shù)據(jù)庫（clusters of orthologous groups of proteins，COG）進行注釋。

1.2.5 多元統(tǒng)計

使用Past3軟件中威爾科克森檢驗（Wilcoxon test）和多元方差分析（multivariate analysis of variance，MANOVA）對曲皮和曲心樣品的差異性進行分析，對關(guān)鍵細菌類群使用 LEfSe（linear discriminant analysis effect size）分析進行甄別。使用Excel 2016、R軟件（v4.0.3）、Origin 2017 以及在線網(wǎng)頁（https：//www.omicstudio.cn/tool/24）進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 α多樣性分析

本研究經(jīng)MiSeq高通量測序發(fā)現(xiàn)，20個樣品共得到989900條序列，每個樣品平均測序深度為49495條。在構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的基礎(chǔ)上，對曲皮和曲心細菌類群的α多樣性進行計算，結(jié)果如圖2所示。

圖2 曲皮和曲心α多樣性指標比較分析Fig.2 Comparative analysis of α diversity index in different parts of Houhuo Daqu

由圖2可知，當測序深度為40 010條序列時，曲皮和曲心細菌類群的發(fā)現(xiàn)物種數(shù)分別為1 416±419和1 036±141（平均值±標準差），香農(nóng)指數(shù)的值分別為5.30±0.45和3.55±0.48。使用Wilcoxon檢驗發(fā)現(xiàn)兩者的發(fā)現(xiàn)物種數(shù)差異非常顯著（P＜0.01），香農(nóng)指數(shù)差異極顯著（P＜0.001）。由此可見，低溫后火大曲曲皮中細菌類群豐度和物種多樣性均高于曲心。

2.2 基于門和屬水平的細菌群落結(jié)構(gòu)分析

納入本研究的曲皮中的細菌類群可鑒定為34個門和317個屬，而曲心中細菌類群僅鑒定為9個門和48個屬，低溫大曲不同部位優(yōu)勢門和屬相對含量比較分析如圖3所示。

圖3 曲皮和曲心中優(yōu)勢門和屬相對含量比較分析Fig.3 Comparative analysis of dominant phyla and genera in different parts of Houhuo Daqu

由圖3A可知，曲皮中的優(yōu)勢細菌門為Actinobacteria、Firmicutes和Proteobacteria，平均相對含量分別為58.61%、27.54%和12.94%；曲心中的優(yōu)勢細菌門為Actinobacteria和Firmicutes，平均相對含量分別為46.85%和52.47%。經(jīng)Wilcoxon檢驗發(fā)現(xiàn)，Proteobacteria在曲皮中的含量極顯著偏高（P＜0.001），其在曲心中的平均相對含量僅為0.079%，Actinobacteria在曲皮的含量顯著偏高（P＜0.05），而Firmicutes在曲心中的含量極顯著偏高（P＜0.001）。

由圖3B可知，曲皮中的優(yōu)勢細菌屬分別為隸屬于 Actinobacteria的鏈霉菌屬（Streptomyces，34.07%）、糖多孢菌屬（Saccharopolyspora，23.45%）和 Staphylococcus（1.14%），隸屬于 Firmicutes的 Lactobacillus（12.18%）、Bacillus（10.60%）和 Weissella（1.23%），隸屬于 Proteobacteria的 Pantoea（4.12%）、歐氏桿菌屬（Erwinia，3.96%）和腸桿菌屬（Enterobacter，3.67%）。曲心中的優(yōu)勢細菌屬分別為隸屬于Actinobacteria的Saccharopolyspora（38.79%）和 Streptomyces（5.68%），隸屬于Firmicutes的Bacillus（49.58%）和 Thermoactinomyces（2.36%）。經(jīng) Wilcoxon 檢驗發(fā)現(xiàn)，Streptomyces、Lactobacillus、Pantoea、Erwinia 和 Enterobacter含量在曲皮中極顯著偏高（P＜0.001），平均相對含量分別為34.07%、12.18%、4.12%、3.96%和 3.67%；Saccharopolyspora和Thermoactinomyces含量在曲心中顯著偏高（P＜0.05），相對含量分別為38.79%和2.36%；Bacillus在曲心中極顯著偏高（P＜0.001），相對含量為49.58%。由此可見，低溫后火大曲曲皮和曲心細菌群落結(jié)構(gòu)存在一定差異，而造成這種差異的原因可能在于制曲過程中兩個部位所接觸的溫度、水分以及空氣環(huán)境有所不同。

2.3 β多樣性分析

進一步采用基于UniFrac距離的PCoA和UPGMA聚類對曲皮和曲心細菌類群的β多樣性進行分析，結(jié)果如圖4所示。

圖4 基于主坐標分析和聚類分析的β多樣性分析Fig.4 Beta diversity analysis based on principal coordinate analysis and cluster analysis

由圖4A和圖4B可知，曲皮和曲心樣品均呈現(xiàn)明顯的分離趨勢，經(jīng)MANOVA分析發(fā)現(xiàn)，曲皮和曲心樣品間差異極顯著（P＜0.001），這說明后火低溫大曲曲皮和曲心樣品間細菌類群存在顯著差異。由圖4B可知，曲皮QP5樣品單獨一個分支，其余9個樣品形成一個聚類，曲心10個樣品形成一個聚類，說明QP5細菌類群與其他樣品存在較大差異。

2.4 曲皮和曲心OTU水平的細菌群落結(jié)構(gòu)分析

本研究經(jīng)過100%和97%相似度進行OTU劃分后共得到23 124個OTU，研究發(fā)現(xiàn)核心OTU有95個，平均相對含量僅為0.41%。其中平均相對含量＞1.0%的OTU如圖5所示。

圖5 核心OTU相對含量的瀑布圖Fig.5 Waterfall plot of relative content of core OTU

由圖5可知，平均相對含量＞1.0%的核心OTU有7個，包含的序列數(shù)占總序列數(shù)的67.89%。由此可見，曲皮和曲心中共有大量的核心OTU細菌類群。其相對含量分別為 OTU13549（28.34%）、OTU12521（16.64%）、OTU20433（6.46%）、OTU16513（7.82%）、OTU21812（4.97%）、OTU16195（2.42%）和 OTU21622（1.24%），其中OTU13549隸屬于Bacillus，OTU12521和OTU20433隸屬于 Saccharopolyspora，OTU16513、OTU21812 以及OTU16195 隸屬于 Streptomyces，OTU21622 隸屬于Thermoactinomyces。進一步說明了Bacillus、Saccharopolyspora、Streptomyces和 Thermoactinomyces為后火低溫大曲中的優(yōu)勢屬。

本研究發(fā)現(xiàn)后火低溫大曲曲皮和曲心中均存在特有OTU，結(jié)果如表1所示。

表1 曲皮和曲心特有OTU的相對含量Table 1 Relative abundance of unique OTU in different parts of Houhuo Daqu

續(xù)表1 曲皮和曲心特有OTU的相對含量Continue table 1 Relative abundance of unique OTU in different parts of Houhuo Daqu

由表1可知，曲皮中存在13個特有OTU，包含序列數(shù)占總序列數(shù)的比例為0.37%，其中各有2個鑒定為Lactobacillus和Streptomyces，各有1個鑒定為Kocuria、Paenibacillus、Sphingomonas、Staphylococcus和Weissella，而其余4個OTU無法鑒定到屬水平。曲心中存在7個特有OTU，包含序列數(shù)占總序列數(shù)的比例僅為0.07%，其中2個鑒定為Bacillus，1個鑒定為Thermoactinomyces，其余4個OTU亦無法鑒定到屬水平。由此可見，后火低溫大曲曲皮和曲心均存在部分獨特的細菌類群，但其含量較少。

2.5 關(guān)鍵細菌類群甄別

LEfSe分析常用于分類學(xué)水平物種特征及差異的認識與揭示[21]。為進一步揭示后火低溫大曲曲皮和曲心中菌群的結(jié)構(gòu)差異，本研究使用LEfSe分析進行了甄別，結(jié)果如圖6所示。

圖6 細菌類群的LEfSe分析Fig.6 LEfSe analysis of bacterial taxa

由圖6可知，檢測到27個（LDA評分在4以上）在曲皮和曲心樣品中差異顯著（P＜0.05）的分類單元。由圖6A可知，曲皮中特定細菌的系統(tǒng)分類地位主要為隸屬于放線菌綱（Actinobacteria）和變形菌綱（Gammaproteobacteria），曲心中主要隸屬于芽孢桿菌綱（Bacilli）。由圖6B可知，有8個豐度差異顯著的菌屬，其中曲皮中關(guān)鍵細菌類別明顯多于曲心樣品。曲皮中差異顯著的菌屬有 5 個，分別為 Streptomyces、Lactobacillus、Erwinia、Enterobacter和Pantoea。曲心中有3個，分別為Thermoactinomyces、Saccharopolyspora和 Bacillus。由此可見，導(dǎo)致后火低溫大曲曲皮和曲心細菌群落結(jié)構(gòu)存在差異的主要為Streptomyces和Bacillus等優(yōu)勢細菌屬。

2.6 基于PICRUSt功能預(yù)測分析

納入本研究的20個樣品共注釋到隸屬于23個功能大類的4412個COG，結(jié)果如圖7所示。

圖7 基因功能預(yù)測熱圖Fig.7 The heatmap of gene functional prediction

由圖7可知，氨基酸轉(zhuǎn)運和代謝、碳水化合物運輸和代謝以及轉(zhuǎn)錄在后火低溫大曲中細菌類群中有較高表達，而在RNA的處理與修飾、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與動力學(xué)及細胞骨架的表達較低。Weissella有一定的耐酸性，能分解葡萄糖產(chǎn)生乳酸，有利于乳酸乙酯的形成[22]。Bacillus可產(chǎn)生蛋白酶、乳酸以及淀粉酶等，可有效降解大分子蛋白為肽類和氨基酸，從而促進人體消化吸收[23]。Saccharopolyspora能產(chǎn)生酶類、維生素降解促進因子[24]，Thermoactinomyces可產(chǎn)蛋白酶和纖維素酶[25]，而這些因素可能是造成后火低溫大曲中氨基酸轉(zhuǎn)運和代謝、碳水化合物運輸和代謝等功能較強的原因。經(jīng)Wilcoxon檢驗發(fā)現(xiàn)，曲皮中細菌在細胞骨架的表達上非常顯著偏高（P＜0.01）。

3 結(jié)論

后火低溫大曲曲皮和曲心中細菌類群差異顯著，曲皮中細菌豐富度及多樣性均顯著偏高，曲皮中以Streptomyces、Lactobacillus、Saccharopolyspora 和 Bacillus等為主，曲心中以Bacillus和Saccharopolyspora為主。此外，PICRUSt功能預(yù)測發(fā)現(xiàn)后火低溫大曲具有較強的氨基酸轉(zhuǎn)運和代謝、碳水化合物運輸和代謝以及轉(zhuǎn)錄等功能，曲皮中的細菌類群在細胞骨架的表達上非常顯著偏高（P＜0.01）。