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    基于代謝組學(xué)分析光照對油茶鮮果后熟過程代謝物的影響

    2022-10-31 11:26:46范興盧燕燕吳建文
    食品研究與開發(fā) 2022年21期
    關(guān)鍵詞:油茶籽鮮果黃酮類

    范興,盧燕燕,吳建文

    (1.廣西職業(yè)技術(shù)學(xué)院,廣西南寧530266;2.廣西特色經(jīng)濟林培育與利用重點實驗室,廣西 南寧 530002;3.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院,廣西 南寧 530002)

    油茶(Camellia oleifera Abel.)是我國重要的木本油料資源之一,油茶鮮果含有豐富的多酚類、黃酮類、多糖和茶皂素等物質(zhì),具有較好的經(jīng)濟價值[1]。油茶籽采收后有剝殼-攤曬、直接攤曬、堆漚-攤曬等處理方式,以提高含油率和油茶籽油的品質(zhì)。葛永金等[1]發(fā)現(xiàn),不同的后熟工藝對油茶籽油的品質(zhì)影響很大。羅凡等[2]通過比較3種不同干燥方式,發(fā)現(xiàn)微波干燥處理能夠有效提高油茶鮮果的出油率。劉曉晨等[3]發(fā)現(xiàn)光照萌發(fā)會增加亞麻籽油脂質(zhì)伴隨物的含量,進而提高亞麻籽油的營養(yǎng)品質(zhì)。近年來,油茶籽油生產(chǎn)的發(fā)展方向逐步趨于標(biāo)準(zhǔn)化和自動化,要求在生產(chǎn)過程中實現(xiàn)數(shù)據(jù)實時監(jiān)測,并據(jù)此形成信息化和智能化作業(yè)。因此,在油茶籽油加工過程中篩選特定的代謝產(chǎn)物,并將其作為判斷工序進程的候選關(guān)鍵標(biāo)志物,是今后實現(xiàn)油茶籽油連續(xù)化生產(chǎn)需要的理論基礎(chǔ)。

    代謝組學(xué)可定義為一種非選擇性的綜合分析復(fù)雜生物代謝網(wǎng)絡(luò)的方法,用于鑒定和量化生物系統(tǒng)中的代謝物,通常適用于分子量低于1 500 Da的小分子[4]。近年來,基于液相色譜-電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography electrospray ionisation tandem mass spectrometry,LC-ESI-MS/MS)的廣泛靶向代謝組學(xué)分析已越來越多地用于代謝物的分析和鑒定。目前,該分析方法已廣泛用于模式植物和作物,如玉米、水稻、番茄和馬鈴薯等[5]。Guo等[6]通過LC-ESI-MS/MS獲得了野生石榴的果皮和汁液中的次生代謝產(chǎn)物,發(fā)現(xiàn)石榴汁中黃酮類含量最高。Mctavish等[7]發(fā)現(xiàn)光照會改變果皮的新陳代謝,果皮通過產(chǎn)生黃酮醇糖苷等光保護化合物和改變脂質(zhì)水平來對光照作出反應(yīng)。酚類化合物是植物中重要的生物活性物質(zhì),主要是類黃酮。黃酮類化合物的含量和種類是植物顏色的主要決定因素。黃酮類化合物,包括花青素、兒茶素衍生物、黃酮類、黃烷酮類、黃酮醇類和異黃酮類,是構(gòu)成植物次生代謝產(chǎn)物的重要組別。黃酮類化合物大量存在于有色水果、葉子和花朵中,它們發(fā)揮著許多關(guān)鍵功能,如色素沉著、調(diào)節(jié)種子休眠,以及對生物和非生物脅迫的保護[8]。

    目前關(guān)于油茶鮮果在光照脅迫下代謝物的動態(tài)變化和生成途徑尚不清楚,關(guān)于光照對油茶鮮果代謝物變化影響的報道也很少。因此本研究以廣西地區(qū)油茶鮮果為試驗材料,采用LC-ESI-MS/MS和多元統(tǒng)計的方法分析油茶鮮果后熟過程中小分子物質(zhì)的代謝規(guī)律,識別差異代謝物,以期為油茶鮮果后熟加工工藝改良、油茶籽油品質(zhì)提升和功能性成分富集等研究提供理論參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    油茶鮮果由果皮和油茶籽組成,精選形態(tài)成熟、大小相近的“普通”油茶鮮果100 kg。

    甲醇、乙腈、甲酸(均為色譜純):CNW科技(香港)有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    超高效液相(ExionLC AD)、高靈敏度質(zhì)譜(QTrap 6500+):美國愛博才思公司;離心機(Heraeus Fresco17):賽默飛世爾科技公司;純水儀(明澈D24UV):美國默克密理博公司;色譜柱(T3,1.8 μm×2.1 mm×100 mm):美國沃特世公司;混勻儀(JCHY-100):中國聚創(chuàng)公司。

    1.3 方法

    1.3.1 樣品制備和代謝物提取

    采后油茶鮮果分別置于黑暗條件下35℃、白光輻照下35℃恒溫培養(yǎng)箱中進行后熟處理0、9、16 h。0 h設(shè)為對照組,光照組分別表示為LT_9、LT_16,無光照組分別表示為NLT_9、NLT_16。將不同后熟工藝處理后的油茶鮮果進行冷凍干燥處理后再進行研磨,稱取50 mg的樣品粉末至離心管中,加入提取液(甲醇與水體積比為 3 ∶1),渦旋 30 s,35 Hz研磨處理 4 min,冰水浴超聲 15 min(40 kHz、10℃),在混勻儀上 4℃混勻處理12 h,樣品在4℃條件下12 000 r/min離心15 min,取上清液,隨后用0.22 μm微孔濾膜過濾上清液;用提取液稀釋上清液5倍,渦旋30 s,每個樣品各取50 μL混合成質(zhì)控(quality control,QC)樣品;-80℃?zhèn)溆谩?/p>

    1.3.2 高效液相色譜條件

    液相色譜A相為0.1%甲酸水溶液、B相為乙腈。柱溫箱溫度為40℃、自動進樣器溫度為4℃、進樣體積為 2 μL。

    1.4 數(shù)據(jù)分析

    所有質(zhì)譜數(shù)據(jù)的采集及目標(biāo)化合物定量分析工作均通過SCIEX Analyst Work Station Software(Version 1.6.3)來完成。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

    所有QC樣品總離子流(total ion chromatogram,TIC)圖見圖1。

    圖1 所有QC樣品TIC圖Fig.1 Total ion chromatogram(TIC)diagram of all quality control(QC)samples

    由圖1可知,QC樣品TIC圖的出峰保留時間和峰面積重疊良好,說明儀器穩(wěn)定性好,測試結(jié)果可靠。

    2.2 油茶鮮果代謝物的鑒定

    為更好地解析光照對油茶鮮果后熟過程中的影響,采用LC-ESI-MS/MS對15個油茶鮮果樣品進行代謝物分析,總共檢測出739種代謝物。代謝物種類圖見圖2。

    圖2 代謝物種類Fig.2 Metabolite species

    由圖2可知,在正離子模式和負(fù)離子模式下鑒定的代謝物數(shù)量分別為711種和28種,其中主要有萜類118種、生物堿類97種、黃酮類88種、酚類53種、苯丙素類52種、類黃酮44種、氨基酸類38種、核苷酸類24種、木脂素22種、甾體類21種,糖類11種。

    2.3 代謝物主成分分析

    主成分分析(principal component analysis,PCA)是一種無監(jiān)督的多元數(shù)據(jù)分析方法,主要原理是采用投影法,以樣品中檢測到的化合物或光譜特征為維度,對多維空間中位置內(nèi)的樣本特征進行降維和表征。PCA常用于綜合分析多維數(shù)據(jù)的聚類趨勢[9],也是最早用于代謝組學(xué)研究的方法之一[10]。

    以5個樣品組(正離子模式和負(fù)離子模式檢測結(jié)果合并)的代謝物進行主成分分析,根據(jù)離散度分析樣品重復(fù)性及差異性,判斷儀器穩(wěn)定性和數(shù)據(jù)有效性。若樣品離散度小,則儀器穩(wěn)定、檢測結(jié)果可靠。全部樣品的PCA得分散點圖見圖3。

    圖3 油茶鮮果后熟過程中代謝物主成分分析得分Fig.3 Principal component analysis score of metabolites in postripening process of Camellia oleifera fresh fruits

    由圖3可知,5個樣品組明顯分開,每個樣品都能在同一個象限中,說明儀器具有較好的穩(wěn)定性。樣品組內(nèi)生物學(xué)重復(fù)樣品離散度小,表明生物學(xué)重復(fù)的重復(fù)性好,具有代表性,為后續(xù)代謝物分析結(jié)果的準(zhǔn)確提供依據(jù)。另外,由圖3可知,對照組在第一象限,與其它處理組距離較遠(yuǎn),而光照組基本位于第二象限,與無光照組分離,由此可見,油茶鮮果不同后熟處理中光照對其代謝物有明顯影響。

    2.4 代謝物聚類分析

    為進一步研究光照對油茶鮮果后熟的影響,并且能夠更全面地展示代謝物表達(dá)模式的差異,通過距離矩陣計算所有樣品和代謝物的表達(dá)水平。然后將層次聚類用于聚類分析并生成熱圖,從而顯示油茶鮮果樣品中代謝物在不同處理下的變化。不同后熟條件下油茶鮮果代謝物的聚類熱圖見圖4。

    圖4 不同后熟條件下油茶鮮果代謝物的聚類熱圖Fig.4 Cluster heatmap of metabolites of Camellia oleifera fresh fruits under different post-ripening conditions

    紅色方塊表示該樣品中代謝物的含量高于樣品的平均值,綠色方塊表示該樣品中該代謝物的含量低于該樣品的平均值,顏色越深表示代謝物差異越大。由圖4可知,代謝物一共分為10簇,不同的生物學(xué)重復(fù)之間也同樣聚成了1簇,表明生物學(xué)重復(fù)之間具有良好同質(zhì)性和數(shù)據(jù)的高可靠性。LT_9單獨形成1簇,LT_16與NLT_16形成1簇,說明光照處理對油茶果代謝物產(chǎn)生明顯影響,隨著后熟時間的推移,影響越來越小。因此,從聚類分析和主成分分析都可以表明油茶鮮果在不同的后熟處理中代謝物產(chǎn)生了明顯的差異。

    2.5 代謝物差異性比較

    正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)是一種具有監(jiān)督模式識別的多元統(tǒng)計分析方法,可以最大限度地提高群體分化并幫助發(fā)現(xiàn)差異代謝物。如張林祥等[11]的研究表明通過空固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用儀(headspace solidphase microextraction gas chromatograph,HS-SPME-GCMS)結(jié)合OPLS-DA可對多個產(chǎn)地玫瑰醋的風(fēng)味進行有效區(qū)分。黃曉欣等[12]的研究表明利用超高效液相色譜-線性離子阱/靜電場軌道阱組合式高分辨質(zhì)譜法代謝組學(xué)結(jié)合OPLS-DA可以對不同產(chǎn)地酸棗仁化學(xué)成分進行標(biāo)志物快速篩查。通過OPLS-DA模型進行樣本兩兩比較,得分圖如圖5所示。

    圖5 差異代謝物的OPLS-DA成對比較的得分圖Fig.5 Score plots of pairwise comparisons of differential metabolites by OPLS-DA

    由圖5可知,所有樣本兩兩差異明顯。

    兩個樣品組之間代謝物表達(dá)水平的差異可以通過火山圖來觀察,差異代謝物以差異倍數(shù)≥2和差異倍數(shù)≤0.5以及VIP≥1的作為篩選標(biāo)準(zhǔn)[13]。顯著差異代謝物統(tǒng)計表見表1。

    表1 顯著差異代謝物統(tǒng)計Table 1 Significant differential metabolites

    差異代謝物火山圖見圖6。

    圖6 差異代謝物火山圖(VIP≥1,F(xiàn)C≥2或≤0.5)Fig.6 Volcano map of differential metabolites(VIP≥1,F(xiàn)C ≥ 2 or≤0.5)

    如表1和圖6所示,對照組與LT_9、對照組與LT_16、對照組與 NLT_9、對照組與 NLT_16、LT_9 與 LT_16、LT_9 與 NLT_9、LT_16 與 NLT_16、NLT_9與NLT_16差異表達(dá)顯著的代謝物總數(shù)分別為159、164、173、176、144、173、121個和183個。NLT_9與NLT_16比較組中差異表達(dá)明顯的代謝物總數(shù)最多。

    為了清楚的展示有光和無光處理的差異,進一步探討LT_16與NLT_16中差異成分的變化,對變化前20(上調(diào)和下調(diào))的差異品質(zhì)成分進行倍數(shù)比較分析,LT_16與NLT_16的差異成分倍數(shù)分析圖見圖7。

    圖7 LT_16與NLT_16的差異成分倍數(shù)分析圖Fig.7 Plot of differential component ploidy analysis of LT_16 vs NLT_16

    如圖7所示,上調(diào)和下調(diào)前10的物質(zhì)主要為萜類、黃酮、生物堿和酚類。光是植物生長發(fā)育最重要的環(huán)境因子之一,直接參與植物最重要的生理進程——光合作用。項目組前期研究發(fā)現(xiàn),光照脅迫能夠激發(fā)光敏色素信號通路,調(diào)控脫落酸(abscisic acid,ABA)的代謝,圖7中3-甲基黃嘌呤的上調(diào)也可能與光照激發(fā)有關(guān),作為植物激素促進細(xì)胞的分裂。ABA合成的前體物質(zhì)法呢基焦磷酸(farnesyldiphosphate,F(xiàn)PP),也是角鯊烯合成前體物質(zhì),光照處理激發(fā)了ABA的合成,從而提升了角鯊烯含量,其與甾醇含量呈現(xiàn)“此消彼長”趨勢,而圖7中氫化可的松呈現(xiàn)的下調(diào)趨勢與“此消彼長”的現(xiàn)象相吻合。光照對不同植物的萜類含量積累具有較大影響,植物在最優(yōu)的光照下生長,萜類的物質(zhì)積累最豐富[14-15]。黃酮類物質(zhì)是一類以光合產(chǎn)物為基礎(chǔ)的次生代謝產(chǎn)物,光照對黃酮類物質(zhì)的合成產(chǎn)生影響,一般來說光照會增加黃酮類物質(zhì)的積累[16-17]。有研究表明,光照的強度與生物堿的積累成反比關(guān)系[18-19]。藍(lán)光連續(xù)照射顯著提高大豆芽苗中黃酮類化合物的含量[20]。常建偉等[21]發(fā)現(xiàn)不同光質(zhì)對植物的多酚類也有顯著性影響。因此,光照對油茶鮮果在后熟過程中的次生代謝產(chǎn)物積累有明顯影響。

    2.6 差異次生代謝產(chǎn)物功能注釋和富集分析

    使用KEGG數(shù)據(jù)庫對LT_16與NLT_16之間的121種差異次生代謝產(chǎn)物進行注釋。差異代謝物的KEGG通路富集圖見圖8。

    圖8 差異代謝物的KEGG通路富集圖(LT_16與NLT_16)Fig.8 KEGG pathway enrichment map of differential metabolites(LT_16 vs NLT_16)

    由圖8可知,每一個圓點表示一個KEGG通路,縱坐標(biāo)為通路名稱,橫坐標(biāo)為富集因子,表示LT_16與NLT_16之間差異的代謝物中注釋到該通路的比例與油茶果中代謝物注釋到該通路比例的比值,富集因子越大,表示差異代謝物在該通路的富集顯著性越可靠。LT_16與NLT_16主要參與了類黃酮、黃酮和黃酮醇的生物合成,主要體現(xiàn)在代謝通路中。LT_16與NLT_16的差異是由光照引起的,這與程佳麗等[22]發(fā)現(xiàn)的結(jié)果一致,光照可以調(diào)節(jié)苦蕎芽中苯丙氨酸解氨酶、黃酮醇合酶、查耳酮合成酶及查耳酮異構(gòu)酶的表達(dá)水平,這些酶與黃酮類物質(zhì)的合成有很大的關(guān)系,通過提高酶的表達(dá)水平來提升黃酮類物質(zhì)的富集。

    3 討論與結(jié)論

    本研究采用基于液相色譜-電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜平臺的廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù),對不同后熟處理條件下(有光和無光)油茶果的代謝物進行分析,總共檢測出739種代謝物,55個代謝物種類,主要有萜類118種、生物堿類97種、黃酮類88種、酚類53種、苯丙素類52種、類黃酮44種等。多元統(tǒng)計分析表明,光照對油茶鮮果后熟過程代謝物影響顯著,差異代謝物中上調(diào)和下調(diào)前10的物質(zhì)主要為萜類、黃酮、生物堿和酚類。將差異代謝物總數(shù)最多的比較組進行KEGG數(shù)據(jù)庫匹配,對注釋完的結(jié)果進行富集分析,發(fā)現(xiàn)差異代謝物主要注釋和富集在類黃酮、黃酮和黃酮醇的生物合成通路。油茶籽油脂溶性成分如角鯊烯、甾醇等是評價油脂品質(zhì)的重要指標(biāo),角鯊烯屬于三萜類物質(zhì),同時也是甾醇代謝的上游物質(zhì),光照對油茶果后熟過程萜類物質(zhì)代謝影響明顯,但其對角鯊烯、甾醇合成的影響尚不清楚,是否能夠遷移到油茶籽油中還需進一步確認(rèn)。

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