干姜和炮姜對(duì)脾胃虛寒型胃潰瘍大鼠藥效學(xué)指標(biāo)及腸道菌群的影響Δ

余凌英，李 星，蔡平君，強(qiáng)夢(mèng)琴，東寶花，蔣云秀，黃勤挽，陳志敏（成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院/西南特色中藥資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 611137）

胃潰瘍是臨床常見(jiàn)的消化道疾病，是多種因素?fù)p害胃黏膜致人體胃酸、胃蛋白酶增多而引起的黏膜損傷及黏膜免疫失衡性疾病，其主要誘因包括幽門(mén)螺桿菌感染、藥物濫用、飲食不節(jié)、心理壓力劇增等[1]。西醫(yī)臨床常用的治療藥物有抑酸劑、黏膜保護(hù)劑、抗菌藥物等，側(cè)重于胃潰瘍的局部治療；中醫(yī)治療則遵循辨證論治原則，強(qiáng)調(diào)整體與局部相結(jié)合[2]。脾胃虛寒是胃潰瘍的常見(jiàn)證型之一。研究表明，中藥可用于脾胃虛寒型胃潰瘍的治療[3]。

干姜為姜科植物姜Zingiber officinaleRosc.的干燥根莖。炮姜是干姜的砂燙炮制品，具有溫經(jīng)止血、溫中止痛的作用，主要含有姜辣素、揮發(fā)油和二苯基庚烷等成分[4]。研究表明，干姜制成炮姜后，其姜酚類(lèi)成分含量降低，姜烯酚、姜酮等成分含量增加[5]。其中，姜烯酚類(lèi)成分的抗炎作用強(qiáng)于姜酚類(lèi)成分[6]，姜酮對(duì)潰瘍具有一定的保護(hù)作用[7]。腸道菌群的平衡是脾臟正常發(fā)揮生理作用的重要因素，腸道菌群紊亂與中醫(yī)脾虛具有共同的生物學(xué)基礎(chǔ)，且脾虛患者普遍存在腸道菌群失調(diào)的情況[8]。為進(jìn)一步探究干姜砂燙前后的藥效差異，本研究基于炮姜的溫經(jīng)止血功效，以食醋加無(wú)水乙醇復(fù)制脾胃虛寒型胃潰瘍大鼠模型，研究干姜、炮姜對(duì)大鼠凝血、黏膜修復(fù)功能及腸道菌群的影響，從不同角度分析炮制的影響，為干姜炮制品的合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有RAC-030 型全自動(dòng)凝血分析儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）、DNM-9602G型酶標(biāo)儀（北京普朗新技術(shù)有限公司）、CX31 型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）、Ministar型低溫離心機(jī)（湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

干姜飲片（批號(hào)20050103）購(gòu)自四川國(guó)強(qiáng)中藥飲片有限公司，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院蘭志瓊副教授鑒定為姜科植物姜Z.officinaleRosc.的干燥根莖。炮姜為實(shí)驗(yàn)室自制品[參照2020年版《中國(guó)藥典》（一部）“炮姜”項(xiàng)下炮制方法并結(jié)合本課題組前期篩選工藝，控制砂燙溫度為195 ℃，砂燙時(shí)間為7.5 min]。復(fù)方田七胃痛膠囊[陽(yáng)性對(duì)照，批號(hào)201103，規(guī)格每粒裝0.5 g（相當(dāng)于原藥材0.73 g）]購(gòu)自桂林三金藥業(yè)股份有限公司。

胃泌素（gastrin，GAS）、胃動(dòng)素（motilin，MTL）、表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（批號(hào)分別為42Q392KMS6、IBTT5FPHVX、XKWK1TTDZP）均購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；活化部分凝血活酶時(shí)間（activated partial thromboplastin time，APTT）、凝血酶原時(shí)間（prothrombin time，PT）、凝血酶時(shí)間（thrombin time，TT）、纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)IB）試劑盒（批號(hào)分別為20200827M、2020072902M、20200821M、2019120201M）均購(gòu)自深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司；食醋（批號(hào)20210716）購(gòu)自四川保寧醋有限公司；無(wú)水乙醇（批號(hào)2021091002）購(gòu)自成都科隆化學(xué)品有限公司；其余試劑均為分析純，水為純凈水。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠70只，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（川）2020-030。本研究的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為T(mén)CM-2016-312。

2 方法

2.1 供試液的制備

2.1.1 干姜、炮姜供試液 取干姜和炮姜，分別打成粗粉，置于圓底燒瓶?jī)?nèi)，加10倍量水，浸泡0.5 h，回流提取2 h，收集提取液，藥渣加8倍量水，回流提取1.5 h，合并2次提取液，減壓濃縮，制成質(zhì)量濃度分別為1.50、0.75 g/mL（以生藥量計(jì)）的供試液[9]。

2.1.2 復(fù)方田七胃痛膠囊供試液 取一定量的復(fù)方田七胃痛膠囊內(nèi)容物，用水配制成質(zhì)量濃度為0.045 g/mL的供試液[9]。

2.2 分組、造模與給藥

將大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為正常組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（復(fù)方田七胃痛膠囊供試液0.45 g/kg）、炮姜高劑量組（15.0 g/kg）、炮姜低劑量組（7.5 g/kg）、干姜高劑量組（15.0 g/kg）、干姜低劑量組（7.5 g/kg），每組10 只，各給藥組劑量參考預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置。除正常組外，其余各組參考相關(guān)文獻(xiàn)[10-11]采用食醋聯(lián)合無(wú)水乙醇灌胃法建立脾胃虛寒型胃潰瘍大鼠模型。模型組和各給藥組大鼠于每天上午灌胃4 ℃的食醋（10 mL/kg），連續(xù)10 d，正常組灌胃等量水；第5～10 天，各給藥組大鼠每天下午灌胃相應(yīng)藥物，正常組、模型組大鼠灌胃水；第10 天給藥結(jié)束后，所有大鼠均禁食不禁水；第11 天，除正常組外，其余各組大鼠均灌胃無(wú)水乙醇（1 mL/只）。若大鼠精神萎靡，動(dòng)作遲緩無(wú)力，背毛疏散無(wú)澤，漸見(jiàn)體型瘦弱，大便溏泄且肛門(mén)附近出現(xiàn)污物，胃組織有潰瘍，說(shuō)明脾胃虛寒型胃潰瘍模型復(fù)制成功[10-11]。實(shí)驗(yàn)期間有動(dòng)物死亡，故每組選用6只大鼠進(jìn)行后續(xù)研究。

2.3 樣本采集與處理

灌胃無(wú)水乙醇1 h后，于大鼠股動(dòng)脈取血，一部分靜置后以3 000 r/min 離心15 min，取血清；另一部分置于含枸櫞酸鈉的試管內(nèi)，以3 000 r/min 離心15 min，取血漿。然后，剖取大鼠胃組織，置于10%甲醛溶液中浸泡20 min 后取出備用；取大鼠糞便，置于密封的無(wú)菌凍存管內(nèi)，于-80 ℃下凍存。

2.4 大鼠血清中MTL、GAS、EGF含量的測(cè)定

采用ELISA 法進(jìn)行測(cè)定。取“2.3”項(xiàng)下各組大鼠的血清適量，按相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)其MTL、GAS、EGF含量。

2.5 大鼠凝血4項(xiàng)的測(cè)定

采用凝固法進(jìn)行測(cè)定。取“2.3”項(xiàng)下各組大鼠的血漿適量，按相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)其APTT、PT、TT和FIB含量。

2.6 大鼠胃潰瘍指數(shù)和潰瘍抑制率的測(cè)定

取“2.3”項(xiàng)下各組大鼠胃組織適量，沿胃大彎剪開(kāi)，用生理鹽水洗凈胃內(nèi)容物，觀察黏膜面潰瘍的形成情況，用游標(biāo)卡尺測(cè)量出血區(qū)域的長(zhǎng)度和寬度，以相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)（表1）進(jìn)行評(píng)分，所得總積分即為該動(dòng)物的潰瘍指數(shù)；同時(shí)，計(jì)算各組大鼠的潰瘍抑制率。總積分＝出血點(diǎn)分值+出血帶長(zhǎng)度分值+出血帶寬度分值×2（因?qū)挾人从硴p傷的嚴(yán)重程度強(qiáng)于長(zhǎng)度，故雙倍積分），潰瘍抑制率（%）＝（模型組潰瘍指數(shù)-實(shí)驗(yàn)組潰瘍指數(shù)）/模型組潰瘍指數(shù)×100%[11]。

表1 直觀觀察評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2.7 大鼠胃組織病理形態(tài)學(xué)的觀察

取“2.3”項(xiàng)下各組大鼠的胃組織適量，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，經(jīng)蘇木精-伊紅（HE）染色后，于光學(xué)顯微鏡下觀察各組胃組織的病理形態(tài)學(xué)變化并拍照，記錄胃黏膜糜爛灶數(shù)量：平均每個(gè)視野下糜爛灶數(shù)量＝切面內(nèi)糜爛灶數(shù)量/計(jì)數(shù)視野個(gè)數(shù)。利用Olympus Cellsens Dimension 軟件測(cè)量糜爛灶面積：平均糜爛灶面積＝切面內(nèi)糜爛灶面積總和/切面內(nèi)糜爛灶數(shù)量。

2.8 大鼠腸道菌群的檢測(cè)

取“2.3”項(xiàng)下正常組、模型組、干姜高劑量組（結(jié)果中簡(jiǎn)稱(chēng)“干姜組”）、炮姜高劑量組（結(jié)果中簡(jiǎn)稱(chēng)“炮姜組”）大鼠的糞便樣品適量，委托北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行DNA 提取和16S V3+V4 區(qū)擴(kuò)增子信息采集、分析?；贗llumina Nova測(cè)序平臺(tái)測(cè)序，構(gòu)建PCR-free文庫(kù)，然后進(jìn)行雙末端測(cè)序。通過(guò)對(duì)reads拼接，按97%的一致性將序列聚類(lèi)成操作分類(lèi)單元（operational taxonomic units，OTUs）。結(jié) 合Silva138 數(shù) 據(jù) 庫(kù)，對(duì) 所 得OTUs（共4 060 個(gè)）序列進(jìn)行物種注釋。根據(jù)物種注釋結(jié)果，進(jìn)一步計(jì)算α多樣性與β多樣性，取不同分類(lèi)水平上相對(duì)豐度排名前10位的物種進(jìn)行分析，揭示各組大鼠糞便樣本物種組成和群落結(jié)構(gòu)的差異。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)均以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 大鼠血清中MTL、GAS、EGF含量的測(cè)定結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠血清中MTL、GAS、EGF含量均顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和炮姜高劑量組大鼠血清中MTL、GAS、EGF含量，干姜低、高劑量組MTL、GAS 含量，以及炮姜低劑量組EGF含量均顯著升高（P＜0.05）；與相同劑量干姜組比較，炮姜低劑量組大鼠血清中MTL、GAS含量均顯著降低，炮姜低、高劑量組EGF 含量均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清中MTL、GAS、EGF 含量的測(cè)定結(jié)果（±s，n＝6）

表2 各組大鼠血清中MTL、GAS、EGF 含量的測(cè)定結(jié)果（±s，n＝6）

a：與正常組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與相同劑量干姜組比較，P＜0.05

組別正常組模型組陽(yáng)性對(duì)照組干姜低劑量組干姜高劑量組炮姜低劑量組炮姜高劑量組MTL/（pg/mL）302.79±53.15 249.76±42.00a 334.98±75.25b 314.17±42.43b 324.00±68.39b 280.61±33.99c 328.26±39.31b GAS/（pg/mL）293.18±40.84 247.99±15.57a 326.42±29.84b 304.06±20.74b 311.57±46.34b 256.89±20.98c 298.56±39.61b EGF/（ng/mL）24.69±5.74 14.14±3.71a 29.35±2.85b 16.74±5.64 17.34±4.35 26.68±3.31bc 28.47±2.91bc

3.2 大鼠凝血4項(xiàng)的測(cè)定結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠的TT 顯著延長(zhǎng)，F(xiàn)IB 含量顯著下降（P＜0.05），APTT 和PT 有升高趨勢(shì)但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和炮姜低、高劑量組大鼠的APTT、TT 以及炮姜高劑量組大鼠的PT均顯著縮短，陽(yáng)性對(duì)照組和炮姜低、高劑量組大鼠的FIB 含量均顯著升高（P＜0.05）。與相同劑量干姜組比較，炮姜低劑量組大鼠APTT、炮姜高劑量組凝血4項(xiàng)均顯著縮短或升高（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠凝血4項(xiàng)的測(cè)定結(jié)果（±s，n＝6）

表3 各組大鼠凝血4項(xiàng)的測(cè)定結(jié)果（±s，n＝6）

a：與正常組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與相同劑量干姜組比較，P＜0.05

組別正常組模型組陽(yáng)性對(duì)照組干姜低劑量組干姜高劑量組炮姜低劑量組炮姜高劑量組APTT/s 30.3±3.4 32.8±1.2 28.6±3.2b 32.6±2.8 32.3±2.2 29.4±3.2bc 27.2±2.9bc PT/s 31.9±2.3 34.5±2.8 32.4±3.5 32.2±3.3 33.3±2.3 32.0±2.1 30.2±2.8bc TT/s 42.0±3.5 45.7±3.3a 40.8±2.6b 43.3±3.4 42.8±3.2 41.6±3.8b 38.8±3.0bc FIB/（mg/dL）0.4±0.2 0.2±0.1a 0.6±0.3b 0.3±0.2 0.3±0.1 0.4±0.2b 0.7±0.2bc

3.3 大鼠胃潰瘍指數(shù)和潰瘍抑制率的測(cè)定結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠的胃潰瘍指數(shù)顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和炮姜低、高劑量組大鼠的胃潰瘍指數(shù)均顯著降低，陽(yáng)性對(duì)照組大鼠的潰瘍抑制率顯著升高（P＜0.05）；與相同劑量干姜組比較，炮姜高劑量組大鼠的潰瘍指數(shù)顯著降低，炮姜低、高劑量組大鼠的潰瘍抑制率均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表4。

3.4 大鼠胃組織的病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

正常組大鼠胃黏膜腺體細(xì)胞排列整齊，未見(jiàn)黏膜細(xì)胞壞死、水腫及間質(zhì)充血、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等。模型組大鼠胃組織可見(jiàn)多個(gè)糜爛灶分布，灶內(nèi)淺表黏膜上皮細(xì)胞腫脹、壞死，毛細(xì)血管擴(kuò)張，部分上皮細(xì)胞及紅細(xì)胞裂解成細(xì)顆粒狀；糜爛灶中部黏膜細(xì)胞及固有層水腫，細(xì)胞排列疏松、紊亂，少量糜爛灶中部可見(jiàn)明顯出血；糜爛灶炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)不明顯，黏膜底部及黏膜下層可見(jiàn)少量嗜酸性粒細(xì)胞分布；肌層及漿膜層未見(jiàn)明顯異常。與模型組比較，各給藥組大鼠糜爛灶水腫均有所好轉(zhuǎn)，糜爛灶數(shù)量和面積均有不同程度減少，其中陽(yáng)性對(duì)照組和炮姜低、高劑量組大鼠上述指標(biāo)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)果見(jiàn)表5和圖1。

表4 各組大鼠胃潰瘍指數(shù)和潰瘍抑制率的測(cè)定結(jié)果（±s，n＝6）

表4 各組大鼠胃潰瘍指數(shù)和潰瘍抑制率的測(cè)定結(jié)果（±s，n＝6）

a：與正常組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與相同劑量干姜組比較，P＜0.05

潰瘍抑制率/%組別正常組模型組陽(yáng)性對(duì)照組干姜低劑量組干姜高劑量組炮姜低劑量組炮姜高劑量組潰瘍指數(shù)/分0 26.33±6.80a 5.00±3.03b 19.83±6.01 18.17±6.24 13.17±4.58b 6.17±2.64bc 0 81.75±6.68b 25.37±6.09 31.94±8.90 51.07±5.05c 77.09±4.53c

表5 各組大鼠胃黏膜糜爛灶數(shù)量和面積的測(cè)定結(jié)果（±s，n＝6）

表5 各組大鼠胃黏膜糜爛灶數(shù)量和面積的測(cè)定結(jié)果（±s，n＝6）

a：與模型組比較，P＜0.05

組別正常組模型組陽(yáng)性對(duì)照組干姜低劑量組干姜高劑量組炮姜低劑量組炮姜高劑量組糜爛灶數(shù)量/個(gè)0 1.83±0.40 0.83±0.40a 1.50±0.58 1.33±0.52 1.00±0.63a 0.83±0.40a糜爛灶面積/mm2 0 0.30±0.15 0.04±0.04a 0.13±0.19 0.10±0.07 0.07±0.04a 0.04±0.03a

圖1 各組大鼠胃組織病理形態(tài)學(xué)觀察的顯微圖（HE染色，×100）

3.5 大鼠腸道菌群的測(cè)定結(jié)果

3.5.1 α多樣性分析 對(duì)各組大鼠腸道菌群的整體群落結(jié)構(gòu)差異進(jìn)行α 多樣性分析，結(jié)果見(jiàn)表6。Chao1、ACE指數(shù)用來(lái)評(píng)價(jià)菌群的豐度；Shannon、Simpson 指數(shù)則用來(lái)評(píng)價(jià)菌群多樣性的豐富度[12]。由表6 可知，與正常組比較，模型組大鼠的Chao1、ACE 指數(shù)均顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，炮姜組大鼠的ACE、Shannon、Simpson指數(shù)均顯著升高（P＜0.05）。與干姜組比較，炮姜組大鼠的Shannon指數(shù)顯著升高（P＜0.05）。

表6 各組大鼠腸道菌群α 多樣性相關(guān)指數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果（±s，n＝6）

表6 各組大鼠腸道菌群α 多樣性相關(guān)指數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果（±s，n＝6）

a：與正常組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與干姜組比較，P＜0.05

組別正常組模型組干姜組炮姜組Chao1指數(shù)1 446.52±344.59 934.59±248.89a 1 033.37±168.49 1 233.37±280.28 ACE指數(shù)1 435.95±338.67 912.21±209.59a 1 043.45±161.65 1 245.44±277.60b Shannon指數(shù)6.57±0.92 6.03±0.64 6.07±0.67 6.96±0.41bc Simpson指數(shù)0.94±0.05 0.93±0.03 0.92±0.07 0.97±0.01b

3.5.2 β多樣性分析 對(duì)各組大鼠腸道菌群的整體群落結(jié)構(gòu)差異進(jìn)行β 多樣性分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，模型組樣本點(diǎn)與正常組樣本點(diǎn)完全分開(kāi)，距離較遠(yuǎn)且差異較大；炮姜組樣本點(diǎn)與正常組樣本點(diǎn)的距離比干姜組樣本點(diǎn)與正常組樣本點(diǎn)的距離更近。上述結(jié)果說(shuō)明，脾胃虛寒型胃潰瘍可導(dǎo)致大鼠腸道菌群組成及結(jié)構(gòu)發(fā)生變化；經(jīng)過(guò)干姜、炮姜干預(yù)后，可改善脾胃虛寒型胃潰瘍大鼠腸道菌群的組成及結(jié)構(gòu)變化，且炮姜的改善效果相對(duì)較好。

圖2 各組大鼠腸道菌群的β多樣性分析圖

3.5.3 腸道菌群門(mén)水平分析 在門(mén)水平，相對(duì)豐度排名前10 位的物種以厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、變形菌門(mén)為主。與正常組比較，模型組大鼠的擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度顯著降低（P＜0.05），變形菌門(mén)相對(duì)豐度顯著升高（P＜0.05）。與模型組、干姜組比較，炮姜組擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度均顯著升高（P＜0.05），變形菌門(mén)變形菌門(mén)相對(duì)豐度均顯著降低（P＜0.05），結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 各組大鼠腸道菌群門(mén)水平主要差異物種相對(duì)豐度的測(cè)定結(jié)果（±s，n＝6，%）

表7 各組大鼠腸道菌群門(mén)水平主要差異物種相對(duì)豐度的測(cè)定結(jié)果（±s，n＝6，%）

a：與正常組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與干姜組比較，P＜0.05

組別正常組模型組干姜組炮姜組厚壁菌門(mén)51.67±4.48 56.43±10.91 47.04±5.70 49.27±5.78擬桿菌門(mén)41.05±6.10 25.06±8.04a 28.41±3.90 35.49±5.64bc變形菌門(mén)2.44±2.54 11.80±5.04a 14.75±3.15 7.99±2.94bc

3.5.4 腸道菌群屬水平分析 在屬水平，相對(duì)豐度排名前10位的物種包括乳酸桿菌屬、粘液乳酸桿菌屬、羅姆布茨菌屬、聯(lián)合乳酸桿菌屬、普雷沃菌屬、支原體屬、埃希氏-志賀菌屬等。與正常組比較，模型組大鼠的聯(lián)合乳酸桿菌屬相對(duì)豐度顯著降低，羅姆布茨菌屬相對(duì)豐度顯著增加（P＜0.05）。與模型組比較，干姜組大鼠的粘液乳酸桿菌屬相對(duì)豐度顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 各組大鼠腸道菌群屬水平主要差異物種相對(duì)豐度的測(cè)定結(jié)果（±s，n＝6，%）

表8 各組大鼠腸道菌群屬水平主要差異物種相對(duì)豐度的測(cè)定結(jié)果（±s，n＝6，%）

a：與正常組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05

組別正常組模型組干姜組炮姜組聯(lián)合乳酸桿菌屬16.01±8.11 0.54±0.44a 0.52±0.29 0.99±1.01粘液乳酸桿菌屬2.61±1.77 3.56±1.88 0.66±0.32b 1.90±1.25羅姆布茨菌屬0.51±0.40 3.42±1.04a 4.46±3.45 3.84±1.34

4 討論

飲食偏酸可損傷脾胃，長(zhǎng)時(shí)間給予大量低溫食醋會(huì)導(dǎo)致泄瀉、體質(zhì)量減輕等癥狀，符合中醫(yī)脾胃虛寒的臨床表現(xiàn)，因此可采用冷食醋灌胃法復(fù)制脾胃虛寒動(dòng)物模型[13]。攝入過(guò)量乙醇可導(dǎo)致胃黏膜損傷，是急性胃潰瘍的常見(jiàn)病因，因此可采用無(wú)水乙醇灌胃法復(fù)制胃潰瘍動(dòng)物模型[14]?；诖?，本研究采用食醋聯(lián)合無(wú)水乙醇灌胃法復(fù)制脾胃虛寒型胃潰瘍模型。

GAS 和MTL 是重要的消化道胃腸激素，與脾胃虛寒密切相關(guān)，臨床實(shí)踐證實(shí)，脾胃虛寒患者多表現(xiàn)為GAS 和MTL 分泌過(guò)少[15]。研究指出，GAS 正常分泌可促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)，其異常表達(dá)可導(dǎo)致胃酸分泌增多，胃腸道黏膜屏障受損，從而加重潰瘍出血癥狀；MTL 可促進(jìn)胃腸排空及胃酸分泌，其異常表達(dá)會(huì)加重胃腸黏膜損傷[16]。本研究結(jié)果顯示，脾胃虛寒型胃潰瘍模型大鼠血清中GAS和MTL含量均顯著降低，經(jīng)干姜、炮姜干預(yù)后均有不同程度的升高，但炮姜低劑量組大鼠血清中GAS、MTL 含量均明顯低于干姜低劑量組，表明干姜和炮姜用于治療脾胃虛寒證可能與促進(jìn)GAS和MTL的分泌有關(guān)，而低劑量炮姜對(duì)上述指標(biāo)的干預(yù)作用較弱。

正常生理?xiàng)l件下，胃黏膜依賴(lài)多種保護(hù)機(jī)制以維持結(jié)構(gòu)的完整性，并通過(guò)黏膜防御系統(tǒng)來(lái)抵御外界有害刺激。EGF 可促進(jìn)細(xì)胞增生，抑制胃酸、胃蛋白酶分泌以減輕后者對(duì)黏膜的損傷作用，增加胃黏膜黏液及糖蛋白的合成和分泌而對(duì)胃黏膜起保護(hù)作用；還可以增加上皮細(xì)胞的合成，促進(jìn)胃黏膜損傷修復(fù)和潰瘍愈合等[17]。本研究中，炮姜低、高劑量組大鼠的潰瘍抑制率均顯著高于相同劑量干姜組，干姜砂燙后抗?jié)冏饔玫脑鰪?qiáng)可能與血清中EGF 含量顯著增加而使胃黏膜保護(hù)作用有所增強(qiáng)有關(guān)。因黏膜受損，胃潰瘍常伴有出血現(xiàn)象，凝血4項(xiàng)可反映機(jī)體的止血功能。與模型組比較，炮姜能使脾胃虛寒型胃潰瘍大鼠的APTT、TT、PT 均明顯縮短，而FIB 含量明顯升高，表明炮姜能增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)源性和外源性凝血功能，有助于提升潰瘍治療的臨床效果。

研究指出，調(diào)控腸道菌群水平、增加菌群多樣性與抗胃潰瘍作用的發(fā)揮密切相關(guān)[18]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，炮姜組ACE、Shannon、Simpson指數(shù)均顯著升高，表明炮姜能更好地改善腸道菌群的相對(duì)豐度、多樣性及均勻度。厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)細(xì)菌參與了機(jī)體能量代謝、脂肪存儲(chǔ)等過(guò)程，二者比值（F/B）反映了機(jī)體能量吸收與貯存的能力，是腸道穩(wěn)態(tài)的生理性指標(biāo)之一，該比值越低則腸道菌群越穩(wěn)定；變形菌門(mén)包含了很多潛在的致病菌，其相對(duì)豐度的升高可增加腸道對(duì)炎癥的敏感性，同時(shí)也是腸道菌群失調(diào)的標(biāo)志[12]。與正常組比較，模型組大鼠的擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度降低，厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)相對(duì)豐度升高，提示腸道菌群發(fā)生紊亂；給予干姜、炮姜干預(yù)后，擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度升高，厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)相對(duì)豐度（炮姜組）降低，說(shuō)明干姜、炮姜均可改善腸道微生態(tài)，且炮姜效果更好。從屬水平對(duì)大鼠腸道菌群組成結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，與正常組相比，模型組大鼠的羅姆布茨菌屬相對(duì)豐度顯著增加。聯(lián)合乳酸桿菌屬、粘液乳酸桿菌屬對(duì)胃腸道有潛在保護(hù)作用，可降低炎癥的發(fā)生[19-20]。炮姜組大鼠的聯(lián)合乳酸桿菌屬、粘液乳酸桿菌屬相對(duì)豐度較干姜組有一定升高，說(shuō)明炮姜的胃腸道保護(hù)作用相對(duì)更強(qiáng)?？梢?jiàn)，干姜和炮姜能一定程度地調(diào)節(jié)脾胃虛寒型胃潰瘍大鼠腸道菌群的相對(duì)豐度和多樣性，改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，炮姜的作用優(yōu)于干姜。

綜上所述，干姜和炮姜可通過(guò)提高GAS、MTL含量來(lái)改善脾胃虛寒型胃潰瘍大鼠的脾胃虛寒癥狀，增強(qiáng)其胃腸功能；與干姜比較，炮姜能明顯抑制脾胃虛寒型胃潰瘍，且這種作用與促進(jìn)黏膜修復(fù)、改善凝血功能、調(diào)整腸道菌群紊亂等有關(guān)。本研究雖然從胃潰瘍黏膜保護(hù)、腸道菌群等方面探究了干姜和炮姜對(duì)脾胃虛寒胃潰瘍的作用，但僅初步探討了藥物對(duì)腸道菌群種類(lèi)的影響，體內(nèi)細(xì)胞因子（如炎癥因子）與腸道菌群的關(guān)系及對(duì)黏膜屏障的影響、抗?jié)冏饔脵C(jī)制等還需要進(jìn)一步研究。