苗藥了哥王提取物對(duì)斑馬魚(yú)的毒性作用Δ

何正艷，馮 果，鄭傳奇，李 瑋，劉 文，朱光林，王文靜，蘇紅梅，宋學(xué)麗，張 菊（.貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴陽(yáng) 550025；2.國(guó)家苗藥工程技術(shù)研究中心，貴陽(yáng) 550025）

了哥王始載于《嶺南采藥錄》，來(lái)源于瑞香科植物南嶺蕘花Wikstroemia indica（Linn.）C. A. Mey.的根及根皮，是貴州地區(qū)常用苗藥之一。了哥王味苦、微辛，性寒，有毒，歸肺、肝經(jīng)，具有清熱解毒、消腫散結(jié)、止痛的功效，常用于瘰疬、癰腫、跌打損傷、急性扁桃體炎、慢性支氣管炎、乳腺癌、惡性淋巴癌、肺癌等疾病的臨床治療[1-5]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，了哥王具有抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗炎、鎮(zhèn)咳袪痰等藥理作用[6-7]。該藥療效確切，臨床應(yīng)用價(jià)值和市場(chǎng)潛力較大，但因毒性作用較強(qiáng)，使得其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用受限。《生草藥性備要》《湖南藥物志》中均有了哥王“大毒”或“有毒”的毒性記載[8-9]。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)了哥王的毒性研究大多基于大鼠和小鼠模型[10-12]，具有成本高、周期長(zhǎng)、不便于觀察等缺點(diǎn)。斑馬魚(yú)作為一種新的模式生物，其幼魚(yú)及胚胎通體透明，且繁殖率高、生長(zhǎng)發(fā)育周期短，加之其與人類基因的相似度高達(dá)87%，故在篩選和評(píng)價(jià)藥物毒性方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[13]?；诖耍疚臄M利用斑馬魚(yú)模型，探討了哥王提取物對(duì)斑馬魚(yú)胚胎、斑馬魚(yú)的毒性作用，以期為其毒性的深入研究提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有MULTISKAN SKY 1530型全自動(dòng)酶標(biāo)儀[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司]、SMZ18型體視熒光顯微鏡（日本Nikon公司）、CKX53型倒置相差顯微鏡（上海蠻吉光電科技有限公司）、PCO-1500型立體顯微鏡及成像系統(tǒng)（武漢鑫力鈞生物科技有限公司）、ESENAWS1型斑馬魚(yú)養(yǎng)殖系統(tǒng)（北京愛(ài)生科技發(fā)展有限公司）、SLI700型生化培養(yǎng)箱（天津信睿生物科技有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

了哥王藥材購(gòu)自廣西壯族自治區(qū)玉林市玉州區(qū)玉林銀豐國(guó)際中藥港，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院李瑋教授鑒定為瑞香科蕘花屬植物了哥王W. indica（Linn.）C.A.Mey.的干燥根或根皮。

吖啶橙（批號(hào)325E043）、油紅O染液（批號(hào)20190910）、PBS（批號(hào)20190517）、DMSO（批號(hào)821D0311）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；4%多聚甲醛（批號(hào)190620）購(gòu)自上海尚寶生物科技有限公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)均為20191118）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；NaCl、KCl、K2HPO4、Na2HPO4、NaHCO3、MgSO4、CaCl2等試劑均為分析純，水為純凈水。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

AB系野生型斑馬魚(yú)，雌雄各半，購(gòu)自國(guó)家斑馬魚(yú)資源中心，4～6 月齡（繁育、培養(yǎng)方法參照The Zebrafish Book），其相關(guān)質(zhì)量控制項(xiàng)（微生物學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè)、寄生蟲(chóng)學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè)、遺傳質(zhì)量控制、病理診斷、配合飼料、環(huán)境條件）均符合北京市實(shí)驗(yàn)用魚(yú)質(zhì)量控制地方標(biāo)準(zhǔn)。所有斑馬魚(yú)均飼養(yǎng)于貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院斑馬魚(yú)飼養(yǎng)中心的養(yǎng)殖房[光照14 h、黑暗10 h 交替，水溫（28.0±0.5）℃，水pH6.8～7.5，室溫26 ℃]內(nèi)。

2 方法

2.1 斑馬魚(yú)胚胎培養(yǎng)液的配制

按照The Zebrafish Book標(biāo)準(zhǔn)配制斑馬魚(yú)胚胎培養(yǎng)液，其中NaCl、KCl、Na2HPO4、K2HPO4、CaCl2、MgSO4、NaHCO3的濃度分別為0.14、5.40、0.25、0.44、1.30、1.00、4.20 mol/L。

2.2 了哥王提取物的制備

參照課題組前期研究方法制備了哥王提取物并進(jìn)行相關(guān)分析：取了哥王藥材粗粉5 kg，以14 倍量的70%乙醇按5 mL/（min·kg）的速度進(jìn)行滲漉提?。皇占瘽B漉提取液，回收乙醇至提取液無(wú)醇味，采用低壓真空濃縮干燥法（溫度60 ℃，真空度0.07～0.08 MPa）進(jìn)行濃縮、干燥后，粉碎成細(xì)粉，得了哥王提取物粉末（傘形花內(nèi)酯和西瑞香素的含量分別為0.067、2.263 mg/g，浸膏得率為10.08%，每1 g了哥王提取物相當(dāng)于生藥9.92 g）[14]。

2.3 了哥王提取物藥液的配制

精密稱取“2.2”項(xiàng)下了哥王提取物粉末適量，溶于一定量的DMSO 中，渦旋溶解后，再加入胚胎培養(yǎng)液配制成1 mg/mL的母液，于實(shí)驗(yàn)前加胚胎培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。

2.4 了哥王提取物對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育的影響

于實(shí)驗(yàn)前一天晚上，將健康成年的斑馬魚(yú)按雌雄比例1∶1放入產(chǎn)卵缸中，使其自然受精產(chǎn)卵。隨機(jī)選取受精后6～8 h（6-8 hours post fertilization，6～8 hpf）、發(fā)育正常且無(wú)畸形的斑馬魚(yú)胚胎，轉(zhuǎn)移至12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中（每孔20 枚胚胎），并加入適量胚胎培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)溫度為（28.0±0.5）℃。

2.4.1 藥物暴露質(zhì)量濃度的選取與藥液的配制 設(shè)置暴露質(zhì)量濃度為10、20、40 μg/mL（質(zhì)量濃度參考課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置），并按照“2.3”項(xiàng)下方法配制質(zhì)量濃度分別為10、20、40 μg/mL的了哥王提取物藥液。

2.4.2 暴露處理 設(shè)置了哥王提取物10、20、40 μg/mL組和空白組（每孔20 枚胚胎，每組設(shè)置2 個(gè)復(fù)孔），緩慢吸出各孔中的胚胎培養(yǎng)液，各藥物組分別按4 mL/孔加入“2.4.1”項(xiàng)下不同質(zhì)量濃度的了哥王提取物藥液進(jìn)行暴露，空白組加入等體積的胚胎培養(yǎng)液和等量的DMSO作為對(duì)照。加蓋標(biāo)記后，將培養(yǎng)板置于生化培養(yǎng)箱中孵育72 h，每24 h更換藥液1次。

2.4.3 斑馬魚(yú)胚胎自主抽動(dòng)次數(shù)、心率及其畸形率、死亡率的測(cè)定 暴露24 h后，使用立體顯微鏡及成像系統(tǒng)觀察各組斑馬魚(yú)1 min 內(nèi)的胚胎自主抽動(dòng)次數(shù)（每組選取10枚胚胎）；暴露48 h后，使用立體顯微鏡及成像系統(tǒng)觀察各組斑馬魚(yú)10 s 內(nèi)的胚胎心率（每組選取10 枚胚胎）；暴露72 h后，計(jì)算各組斑馬魚(yú)胚胎的畸形率和死亡率：畸形率（%）＝某一時(shí)間點(diǎn)幼魚(yú)的畸形數(shù)/某一時(shí)間點(diǎn)全部存活的幼魚(yú)數(shù)×100%，死亡率（%）＝死亡胚胎數(shù)/總胚胎數(shù)×100%。

2.5 了哥王提取物對(duì)斑馬魚(yú)的急性毒性作用

參照文獻(xiàn)方法[15]繁育斑馬魚(yú)，于實(shí)驗(yàn)前一天晚上，將健康成年的斑馬魚(yú)按雌雄比例1∶1放入產(chǎn)卵缸中，使其自然受精。取受精卵，經(jīng)清洗消毒后放入生化培養(yǎng)箱中孵育96 h。隨機(jī)選取96 hpf、發(fā)育正常且無(wú)畸形的斑馬魚(yú)，轉(zhuǎn)移至12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中（每孔20尾斑馬魚(yú)），并加入適量的胚胎培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)溫度為（28.0±0.5）℃。

2.5.1 藥物暴露質(zhì)量濃度的選取與藥液的配制 根據(jù)課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置10、20、27、37、51、72、90、100 μg/mL藥物暴露濃度組，并按照“2.3”項(xiàng)下方法配制質(zhì)量濃度分別為10、20、27、37、51、72、90、100 μg/mL 的了哥王提取物藥液。

2.5.2 暴露處理 慢慢吸出各孔中的胚胎培養(yǎng)液，分別加入“2.5.1”項(xiàng)下不同質(zhì)量濃度的了哥王提取物藥液進(jìn)行暴露，其余操作同“2.4.2”項(xiàng)下。

2.5.3 半數(shù)致死濃度的計(jì)算 當(dāng)暴露24、48、72 h時(shí)，統(tǒng)計(jì)各個(gè)藥物暴露濃度組死亡的斑馬魚(yú)數(shù)量，按“2.4.3”項(xiàng)下方法計(jì)算死亡率，并運(yùn)用SPSS 26.0 軟件繪制其急性毒性線性回歸方程并計(jì)算半數(shù)致死濃度（LC50）。

2.6 了哥王提取物對(duì)斑馬魚(yú)肝臟的毒性作用

2.6.1 藥物暴露質(zhì)量濃度的選取和暴露處理 根據(jù)“2.5”項(xiàng)下急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置藥物低、中、高質(zhì)量濃度組，并設(shè)置含等體積胚胎培養(yǎng)液的空白組作為對(duì)照（每組設(shè)置2 個(gè)復(fù)孔）。隨機(jī)選取96 hpf、發(fā)育正常且無(wú)畸形的斑馬魚(yú)，轉(zhuǎn)移至12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中（每孔20尾斑馬魚(yú)）。經(jīng)培養(yǎng)后，各藥物組分別按4 mL/孔加入不同質(zhì)量濃度的了哥王提取物藥液，空白組加入等體積的胚胎培養(yǎng)液和等量的DMSO，置于（28.0±0.5）℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

2.6.2 斑馬魚(yú)肝臟表型的觀察 按“2.6.1”項(xiàng)下方法暴露處理后，吸去藥液，每組選取10尾幼魚(yú)進(jìn)行表型觀察：將斑馬魚(yú)用胚胎培養(yǎng)液清洗3次，以側(cè)躺姿態(tài)固定于涂布有3%甲基纖維素凝膠的載玻片上，在體視熒光顯微鏡下依次觀察各組斑馬魚(yú)的肝臟表型變化并拍照記錄。

2.6.3 斑馬魚(yú)肝臟細(xì)胞凋亡的評(píng)價(jià) 按“2.6.1”項(xiàng)下方法暴露處理后，吸去藥液，每組選取10尾幼魚(yú)進(jìn)行細(xì)胞凋亡評(píng)價(jià)：將各孔斑馬魚(yú)用胚胎培養(yǎng)液清洗后，于避光條件下按2 mL/孔加入2.5 μg/mL吖啶橙染色液（以胚胎培養(yǎng)液配制[16]）進(jìn)行染色；染色完成后，將斑馬魚(yú)用PBS反復(fù)清洗，以側(cè)躺姿態(tài)固定于涂布有3%甲基纖維素凝膠的載玻片上，在體視熒光顯微鏡下觀察斑馬魚(yú)肝臟細(xì)胞的凋亡情況，并拍照記錄。

2.6.4 斑馬魚(yú)肝臟脂質(zhì)沉積的評(píng)價(jià) 按“2.6.1”項(xiàng)下方法暴露處理后，吸去藥液，每組選取10尾幼魚(yú)進(jìn)行脂質(zhì)沉積評(píng)價(jià)：將各孔斑馬魚(yú)用胚胎培養(yǎng)液清洗，再以4%多聚甲醛固定過(guò)夜，依次用PBS和漂白液清洗3次；分別用85%、100%丙二醇脫水，用0.5%油紅O染液染色3 h；染色完成后，依次用100%、85%丙二醇脫色30 min，用PBS清洗后于顯微鏡下觀察油紅O染液的染色情況，以評(píng)價(jià)斑馬魚(yú)的肝臟脂質(zhì)沉積情況。

2.6.5 斑馬魚(yú)ALT、AST、LDH 活性的測(cè)定 按“2.6.1”項(xiàng)下方法暴露處理后，吸去藥液，每組選取10尾幼魚(yú)進(jìn)行ALT、AST、LDH活性測(cè)定：將各孔斑馬魚(yú)用生理鹽水清洗，以濾紙吸干水分后稱定質(zhì)量；加入9倍量的生理鹽水，于冰浴中充分研磨，所得勻漿產(chǎn)物于4 ℃下以3 500 r/min 離心10 min，取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)各組上清液中ALT、AST、LDH活性。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 26.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)（方差齊）或非參數(shù)秩和檢驗(yàn)（方差不齊）。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 了哥王提取物對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育影響的測(cè)定結(jié)果

當(dāng)斑馬魚(yú)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)未發(fā)育完全時(shí)，會(huì)不受控制地發(fā)生胚胎自主抽動(dòng)；隨著運(yùn)動(dòng)神經(jīng)的逐漸發(fā)育，這種自主抽動(dòng)的次數(shù)將會(huì)減少[17]。與空白組比較，各藥物組斑馬魚(yú)胚胎的自主抽動(dòng)次數(shù)均顯著增加，了哥王提取物40 μg/mL組斑馬魚(yú)胚胎的心率顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同質(zhì)量濃度了哥王提取物對(duì)斑馬魚(yú)胚胎自主抽動(dòng)次數(shù)、胚胎心率、畸形率、死亡率影響的測(cè)定結(jié)果（±s，n＝10）

表1 不同質(zhì)量濃度了哥王提取物對(duì)斑馬魚(yú)胚胎自主抽動(dòng)次數(shù)、胚胎心率、畸形率、死亡率影響的測(cè)定結(jié)果（±s，n＝10）

a：與空白組比較，P＜0.05

畸形率/%組別空白組了哥王提取物10 μg/mL組了哥王提取物20 μg/mL組了哥王提取物40 μg/mL組1 min內(nèi)自主抽動(dòng)/次4.28±0.38 5.37±0.32a 8.28±0.45a 8.78±0.15a暴露48 h后10 s內(nèi)胚胎心率/次21.60±0.87 20.80±0.44 20.60±0.54 19.20±0.92a 0 0 31.25±6.25a 99.00±1.00a死亡率/%0 7.66±2.51a 28.33±2.88a 76.66±2.88a

空白組斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育正常，未見(jiàn)發(fā)育畸形和死亡。與空白組比較，了哥王提取物10 μg/mL 組斑馬魚(yú)的胚胎形態(tài)相似且無(wú)明顯變化，了哥王提取物20、40 μg/mL 組斑馬魚(yú)胚胎可見(jiàn)畸形（表現(xiàn)為心包腫大、卵黃囊畸形、體長(zhǎng)變短等）；各藥物組斑馬魚(yú)胚胎畸形率（了哥王提取物10 μg/mL 組除外）和死亡率均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

3.2 了哥王提取物對(duì)斑馬魚(yú)急性毒性作用的測(cè)定結(jié)果

空白組斑馬魚(yú)發(fā)育正常，72 h 內(nèi)無(wú)死亡；藥物暴露24、48、72 h 后，LC50分別為39.850、28.300、21.490 μg/mL。24、48、72 h的線性回歸方程（式中，y為死亡率，x為藥物質(zhì)量濃度）和LC50見(jiàn)表2。根據(jù)LC50檢測(cè)結(jié)果，本文以27、37、51 μg/mL 作為了哥王提取物低、中、高質(zhì)量濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表2 不同時(shí)間點(diǎn)了哥王提取物對(duì)斑馬魚(yú)急性毒性作用的線性回歸方程和LC50

3.3 了哥王提取物對(duì)斑馬魚(yú)肝臟毒性影響的測(cè)定結(jié)果

3.3.1 肝臟表型 空白組斑馬魚(yú)肝臟表型正常，肝臟形態(tài)完整、清晰，卵黃囊基本吸收完全，不存在肝臟變性。與空白組比較，了哥王提取物低、中、高質(zhì)量濃度組斑馬魚(yú)的肝臟區(qū)域均有不同程度的透明度降低、形態(tài)膨大現(xiàn)象，且有隨藥物暴露質(zhì)量濃度增加而肝臟區(qū)域逐漸模糊的趨勢(shì)；當(dāng)藥物暴露質(zhì)量濃度為51 μg/mL時(shí)，斑馬魚(yú)卵黃囊吸收不完全，且部分魚(yú)體肝臟輪廓模糊。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同質(zhì)量濃度了哥王提取物對(duì)斑馬魚(yú)肝臟表型的影響（×3.2）

3.3.2 肝臟區(qū)域細(xì)胞凋亡情況 吖啶橙染色結(jié)果顯示，空白組斑馬魚(yú)肝臟區(qū)域未出現(xiàn)黃綠色亮點(diǎn)，提示空白組斑馬魚(yú)肝臟基本無(wú)細(xì)胞凋亡；而了哥王提取物中、高質(zhì)量濃度組斑馬魚(yú)的肝臟區(qū)域均可見(jiàn)致密透亮的黃綠色亮點(diǎn)，且有藥物暴露質(zhì)量濃度越高、熒光強(qiáng)度越強(qiáng)的趨勢(shì)。結(jié)果見(jiàn)圖2。

3.3.3 肝臟脂質(zhì)沉積 經(jīng)油紅O染液染色后，空白組斑馬魚(yú)肝臟區(qū)域橘紅色較淺；而了哥王提取物高質(zhì)量濃度組斑馬魚(yú)肝臟區(qū)域的顏色明顯加深，提示其肝臟存在脂質(zhì)沉積。結(jié)果見(jiàn)圖3（了哥王提取物低、中質(zhì)量濃度組經(jīng)油O染液染色后，與空白組比較無(wú)明顯差異，故圖略）。

3.3.4 肝組織中ALT、AST、LDH活性 與空白組比較，了哥王提取物低、中、高質(zhì)量濃度組斑馬魚(yú)肝組織中ALT、AST、LDH活性均顯著升高（P＜0.05），且有隨藥物暴露質(zhì)量濃度增加而增強(qiáng)的趨勢(shì)。結(jié)果見(jiàn)表3。

圖2 不同質(zhì)量濃度了哥王提取物對(duì)斑馬魚(yú)肝臟區(qū)域細(xì)胞凋亡的影響（吖啶橙染色，×3.2）

圖3 不同質(zhì)量濃度了哥王提取物對(duì)斑馬魚(yú)肝臟脂質(zhì)沉積的影響（油紅O染色，×3.2）

表3 不同質(zhì)量濃度了哥王提取物對(duì)斑馬魚(yú)肝組織中ALT、AST、LDH 活性影響的測(cè)定結(jié)果（±s，n＝10）

表3 不同質(zhì)量濃度了哥王提取物對(duì)斑馬魚(yú)肝組織中ALT、AST、LDH 活性影響的測(cè)定結(jié)果（±s，n＝10）

a：與空白組比較，P＜0.05

組別空白組了哥王提取物低質(zhì)量濃度組了哥王提取物中質(zhì)量濃度組了哥王提取物高質(zhì)量濃度組ALT/（U/g prot）14.98±3.11 32.51±5.45a 36.17±4.73a 49.89±4.72a AST/（U/g prot）37.28±1.98 55.41±3.78a 66.17±4.68a 90.56±4.60a LDH/（U/g prot）37.67±3.37 48.40±2.47a 52.31±3.86a 71.18±6.75a

4 討論

了哥王作為一種民族藥，具有較大的臨床應(yīng)用價(jià)值，但其毒性限制了該藥的后續(xù)開(kāi)發(fā)及利用。有研究表明，了哥王的不同提取物對(duì)正常大鼠具有明顯的肝毒性，其中了哥王乙醇提取物的毒性作用較為明顯[10]。斑馬魚(yú)的每個(gè)發(fā)育時(shí)間段都有不同的生理生化指標(biāo)，且易于體外觀察，適用于藥物毒性評(píng)價(jià)[16]。因此，本實(shí)驗(yàn)利用斑馬魚(yú)模型，對(duì)了哥王提取物的毒性作用進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)。

為探究了哥王提取物對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育的毒性作用，本研究以6～8 hpf 斑馬魚(yú)胚胎為對(duì)象，記錄了其1 min 內(nèi)自主抽動(dòng)次數(shù)、10 s 內(nèi)心率及畸形、死亡發(fā)生情況。結(jié)果表明，與空白組比較，經(jīng)了哥王提取物暴露后，斑馬魚(yú)胚胎在發(fā)育過(guò)程中的自主抽動(dòng)次數(shù)增加、心率減慢，且出現(xiàn)心包腫大、卵黃囊腫大、體長(zhǎng)變短等畸形現(xiàn)象和死亡；同時(shí)，隨著藥物質(zhì)量濃度的增加，斑馬魚(yú)胚胎畸形和死亡的現(xiàn)象逐漸明顯，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[17]，提示了哥王提取物對(duì)斑馬魚(yú)胚胎具有一定的致畸和致死作用。

為探究了哥王提取物對(duì)斑馬魚(yú)肝臟的毒性作用，本研究在急性毒性實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用顯微鏡觀察了低、中、高質(zhì)量濃度藥物對(duì)斑馬魚(yú)肝臟表型及相關(guān)指標(biāo)的影響。結(jié)果表明，與空白組比較，了哥王提取物低、中、高質(zhì)量濃度組斑馬魚(yú)的肝臟均有不同程度的透明度降低、形態(tài)膨大現(xiàn)象，且有隨藥物暴露質(zhì)量濃度增加而肝臟區(qū)域逐漸模糊的趨勢(shì)。吖啶橙染色結(jié)果顯示，與空白組比較，中、高質(zhì)量濃度的了哥王提取物均能夠誘導(dǎo)斑馬魚(yú)肝臟細(xì)胞凋亡，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[16]。油紅O染色結(jié)果顯示，與空白組相比較，了哥王提取物高質(zhì)量濃度組斑馬魚(yú)的肝臟中存在脂質(zhì)沉積。這提示該提取物可誘導(dǎo)肝臟細(xì)胞凋亡，并可促進(jìn)肝臟脂質(zhì)沉積。

ALT、AST、LDH 常用以評(píng)價(jià)肝臟受到外源性物質(zhì)損傷的嚴(yán)重程度，當(dāng)肝細(xì)胞受損時(shí)，其活性會(huì)升高[18]。本研究采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)了斑馬魚(yú)中ALT、AST、LDH 的活性，結(jié)果表明，與空白組比較，了哥王提取物低、中、高質(zhì)量濃度組斑馬魚(yú)肝組織中ALT、AST、LDH活性均顯著升高，提示該提取物對(duì)斑馬魚(yú)肝臟具有損傷作用。有文獻(xiàn)報(bào)道，連續(xù)給予了哥王提取物后，大鼠血清中ALT、AST水平顯著升高，其肝細(xì)胞凋亡增加，從而造成肝臟損傷[10，19]，與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果基本一致。

綜上所述，了哥王提取物對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的發(fā)育毒性表現(xiàn)為自主抽動(dòng)次數(shù)增加，心率減慢，畸形率、死亡率升高等；同時(shí)，了哥王提取物可通過(guò)誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡、促進(jìn)肝臟脂質(zhì)沉積而誘發(fā)肝臟損傷。