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    基于RT-ddPCR技術(shù)的食品中諾如病毒定量檢測(cè)

    2022-10-31 08:56:48徐蕾蕊魏詠新魏海燕趙曉娟張西萌
    食品科學(xué) 2022年20期
    關(guān)鍵詞:拷貝噬菌體探針

    徐蕾蕊,李 丹,汪 琦,馬 丹,魏詠新,魏海燕,趙曉娟,張西萌,曾 靜

    (中國(guó)海關(guān)科學(xué)技術(shù)研究中心,北京 100026)

    諾如病毒(norovirus,NoV)為正向單鏈RNA病毒,分為5 個(gè)基因型(GI~GV),大多數(shù)感染人類的NoV屬于GI型和GII型,引起腹瀉嘔吐等急性癥狀,嚴(yán)重可致死亡。NoV主要通過污染食品進(jìn)行傳播,食品中含有微量NoV即可引起感染。因此需要建立科學(xué)、高效的食品中NoV檢測(cè)手段,控制NoV引起的疾病,保障人民健康。

    數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)技術(shù)通過將反應(yīng)體系無限稀釋,可使PCR擴(kuò)增的熒光信號(hào)由指數(shù)形式轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào),檢測(cè)靈敏度提高到單分子水平。目前,微滴式數(shù)字PCR平臺(tái)中的逆轉(zhuǎn)錄微滴式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcriptase droplet digital polymerase chain reaction,RT-ddPCR)無需單獨(dú)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),直接定量RNA,可作為食品中NoV定量檢測(cè)的有效技術(shù)手段。

    食品中NoV定量需要病毒濃縮、核酸提取純化等前處理過程,但此過程中病毒回收率未知,故RT-ddPCR定量結(jié)果不等于食品中NoV實(shí)際載量。需要建立簡(jiǎn)便操作性強(qiáng)的過程控制程序,指示NoV回收率,換算食品中NoV實(shí)際載量。MS2噬菌體是一種無包膜+ssRNA病毒,大小和結(jié)構(gòu)與NoV比較接近,可作為過程控制模式病毒添加到食品樣品中。

    本研究擬以RT-ddPCR檢測(cè)體系為基礎(chǔ),建立NoV定量檢測(cè)方法,探索MS2噬菌體的過程控制程序,構(gòu)建基于RT-ddPCR技術(shù)的食品中NoV定量檢測(cè)方法。

    1 材料與方法

    1.1 材料、試劑與儀器

    牡蠣、蘋果、羽葉生菜和草莓 市購。

    GI、GII型NoV、星狀病毒(humanastrovirus,HastV)、甲肝病毒(hepatitis A virus,HAV)、輪狀病毒(rotavirus,RV)RNA,MS2噬菌體懸液(效價(jià)7.2×10PFU/mL),本實(shí)驗(yàn)室保存;GI型NoV RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(特性值(5.4±1.2)×10拷貝/μL)和GII型NoV RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(特性值(5.9±1.2)×10拷貝/μL),本實(shí)驗(yàn)室研制保存;GII型NoV陽性糞便樣品,由北京兒童醫(yī)院贈(zèng)送。

    焦碳酸二乙酯(diethyl paracanbonate,DEPC)處理水、蛋白酶K 天根生化科技(北京)有限公司;總RNA提取試劑Trizol、SuperScript III Platinum One-Step Quantitative RT-PCR system 美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司;無水乙醇、異丙醇、氯仿 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司;QIAamp Virial RNA Mini Kit 德國(guó)QIAGEN公司;Dynadbeads mRNA Purification Kit 美國(guó)Life Technology公司;One-Step RT-ddPCR Advanced Kit for Probes 美國(guó)伯樂公司。

    熱循環(huán)儀、實(shí)時(shí)熒光PCR儀 美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司;QX-200數(shù)字PCR系統(tǒng)、微滴生成儀 美國(guó)伯樂公司;微定量核酸蛋白分析儀 美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

    1.2 方法

    1.2.1 引物探針設(shè)計(jì)和篩選

    根據(jù)NoV基因型分型保守區(qū)域:編碼RNA依賴的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase,RdRp)區(qū)域和開放閱讀框2(Open Reading Frame 2,ORF2)編碼主要結(jié)構(gòu)蛋白VP1區(qū)域,通過NCBI在線工具進(jìn)行序列分析和比對(duì),利用Prime Express軟件V4.0(ABI,Foster City,CA,USA)分別設(shè)計(jì)GI型和GII型NoV引物和探針;對(duì)于MS2噬菌體,選取Dreier等設(shè)計(jì)的引物和探針,通過NCBI在線工具BLAST進(jìn)行序列分析和比對(duì),確定目的片段同源性。分別取實(shí)驗(yàn)室保存的GI、GII型NoV RNA和提取的MS2噬菌體RNA為模板,首先采用熒光PCR方法對(duì)設(shè)計(jì)的引物探針進(jìn)行篩選和特異性驗(yàn)證,再采用RT-ddPCR體系進(jìn)一步驗(yàn)證篩選的引物探針的特異性。反應(yīng)參數(shù):熒光PCR:50 ℃反轉(zhuǎn)錄15 min,95 ℃熱啟動(dòng)2 min,95 ℃變性15 s、60 ℃退火延伸1 min、40 個(gè)循環(huán);RT-ddPCR:參照One-Step RT-ddPCR Advanced Kit for Probes試劑盒說明書配制反應(yīng)體系,60 ℃反轉(zhuǎn)錄60 min,95 ℃熱啟動(dòng)10 min,95 ℃變性30 s、60 ℃退火延伸1 min、40 個(gè)循環(huán),98 ℃酶失活10 min,4 ℃保持,升降溫速率2~3 ℃/s。

    1.2.2 RT-ddPCR體系擴(kuò)增溫度優(yōu)化

    分別以實(shí)驗(yàn)室保存的GI、GII型NoV RNA和提取的MS2噬菌體RNA為模板,按One-Step RT-ddPCR Advanced Kit for Probes試劑盒說明書,分別在不同退火溫度下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),以陽性微滴擴(kuò)增強(qiáng)度為標(biāo)準(zhǔn),對(duì)篩選出的引物探針退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。

    1.2.3 GI、GII型NoV和MS2噬菌體RT-ddPCR定量檢測(cè)方法學(xué)評(píng)估

    1.2.3.1 3 個(gè)RT-ddPCR定量檢測(cè)方法的定量限和準(zhǔn)確性分析

    MS2噬菌體核酸拷貝濃度測(cè)定:取MS2噬菌體懸液100 μL,提取RNA后溶于100 μL DEPC水,應(yīng)用微定量核酸蛋白分析儀測(cè)定其OD、OD/OD及核酸質(zhì)量濃度值,重復(fù)測(cè)定5 次,取平均值作為提取的RNA核酸質(zhì)量濃度值。計(jì)算提取的MS2噬菌體核酸拷貝濃度,公式如下:

    將保存的GI、GII型NoV RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和提取的MS2噬菌體RNA分別按多倍梯度稀釋,每個(gè)梯度各取2 μL,分別進(jìn)行RT-ddPCR檢測(cè),每個(gè)梯度重復(fù)檢測(cè)4 次,計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD),分別確定3 個(gè)RT-ddPCR定量檢測(cè)方法的定量限,分析檢測(cè)值與理論值之間的關(guān)系,確定檢測(cè)體系的準(zhǔn)確性。

    1.2.3.2 3 個(gè)RT-ddPCR定量檢測(cè)方法的重復(fù)性分析

    分別取GI、GII型NoV RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和提取的MS2噬菌體RNA為模板,按10 倍梯度稀釋,各取高、低兩個(gè)梯度進(jìn)行相應(yīng)的RT-ddPCR檢測(cè),每個(gè)梯度各取2 μL。每種模板分別各取3 個(gè)平行進(jìn)行稀釋,每個(gè)平行每個(gè)梯度重復(fù)檢測(cè)6 次,同時(shí)設(shè)置1 個(gè)空白對(duì)照(DEPC水)。計(jì)算各樣品各梯度的檢測(cè)值與其理論值的偏差,分析檢測(cè)方法的重復(fù)性。

    1.2.4 實(shí)際樣品中添加MS2噬菌體對(duì)NoV定量檢測(cè)結(jié)果的影響分析

    由于CEN ISO/TS 15216-2:2019中不同食品基質(zhì)的前處理方法不同,選擇貝類(牡蠣)、硬質(zhì)表面食品(蘋果)、生食蔬菜(羽葉生菜)以及軟質(zhì)水果(草莓)4 種食品基質(zhì)用于制備陽性樣品。根據(jù)CEN ISO/TS 15216-2:2019中不同食品基質(zhì)的檢測(cè)用量,分別向牡蠣消化腺2 g、蘋果(帶皮)表面100 cm、羽葉生菜25 g和草莓25 g樣品中添加100 μL實(shí)驗(yàn)室保存的NoV陽性糞便樣品(GII型NoV),靜置30 min,每種基質(zhì)制備兩份平行陽性樣品。制備的陽性樣品(包括牡蠣消化腺2 g、蘋果(帶皮)表面100 cm、羽葉生菜25 g和草莓25 g)全部用于RT-ddPCR定量檢測(cè)。各陽性樣品參照CEN ISO/TS 15216-2:2019中不同不同食品基質(zhì)的前處理方法進(jìn)行病毒洗脫和濃縮,其中一份陽性樣品在前處理過程中添加100 μL MS2噬菌體懸液,另一份平行的陽性樣品不添加MS2噬菌體懸液。病毒洗脫和濃縮后,提取RNA溶于100 μL DEPC處理水中。將提取的陽性樣本RNA分別進(jìn)行GII型NoV和MS2噬菌體RT-ddPCR定量檢測(cè),每份樣品重復(fù)檢測(cè)6 次,分析添加MS2噬菌體對(duì)陽性樣品中NoV定量檢測(cè)結(jié)果的影響。

    1.2.5 基于RT-ddPCR技術(shù)的食品中NoV定量檢測(cè)方法的實(shí)際應(yīng)用

    從超市或市場(chǎng)購入貝類樣品23 份、硬表面食品8 份、生食蔬菜9 份、軟質(zhì)水果15 份,共計(jì)55 份樣品。硬表面食品和生食蔬菜購入后立即進(jìn)行檢測(cè)或保存于4 ℃,貝類和軟質(zhì)水果可立即進(jìn)行檢測(cè),或者保存于-80 ℃。參考CEN ISO/TS 15216-2:2019中對(duì)不同食品基質(zhì)的檢測(cè)用量的規(guī)定,分別取貝類消化腺2 g、硬表面食品表面積100 cm、生食蔬菜25 g、軟質(zhì)水果25 g,采用基于RT-ddPCR技術(shù)的食品中NoV定量檢測(cè)方法進(jìn)行NoV篩查和定量檢測(cè),且每份實(shí)際樣品在檢測(cè)前,均添加100 μL實(shí)驗(yàn)室保存的MS2噬菌體懸液作為過程質(zhì)控,分析不同食品基質(zhì)中MS2噬菌體的回收率,并計(jì)算陽性樣品中NoV實(shí)際載量。

    1.3 統(tǒng)計(jì)分析

    采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析各組之間的差別,統(tǒng)計(jì)方法采用檢驗(yàn)和單因素方差分析,檢驗(yàn)水平=0.05。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 引物探針篩選結(jié)果

    根據(jù)NoV基因型分型保守區(qū)域分別設(shè)計(jì)出3 組GI型NoV引物、探針和4 組GII型NoV引物、探針,引物探針序列未給出。熒光PCR篩選結(jié)果表明,針對(duì)GI型和GII型NoV的各組引物探針均能有效擴(kuò)增出靶基因,其中來源于GB 4789.42—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 諾如病毒檢驗(yàn)》的引物探針COG1-F/R/RING1-P和COG2-F/R/RING2-P具有較高的擴(kuò)增效率,可篩選分別用于構(gòu)建GI、GII型NoV RT-ddPCR體系。對(duì)其特異性進(jìn)行驗(yàn)證(圖1)。熒光PCR特異性驗(yàn)證結(jié)果表明,篩選的GI型NoV特異性COG1-F/COG1-R/RING1-P、GII型NoV引物探針COG2-F/COG2-R/RING2-P和MS2噬菌體引物探針MS2-TM3-F/R/P特異性良好(圖2),各篩選的引物探針序列見表1。

    圖1 熒光PCR篩選引物探針Fig.1 Screening of primers and probes by fluorescence PCR assay

    圖2 熒光PCR驗(yàn)證引物探針特異性Fig.2 Specificity of selected primers and probes verified by fluorescence PCR assay

    表1 篩選的RT-ddPCR引物探針序列Table 1 Sequences of selected primers and probes for RT-ddPCR assay

    RT-ddPCR特異性驗(yàn)證結(jié)果表明,3 個(gè)RT-ddPCR體系只有各自對(duì)應(yīng)目的片段特異性擴(kuò)增,其余病毒經(jīng)檢測(cè)均呈陰性,證明篩選的3 組引物探針在RT-ddPCR體系中特異性良好(圖3)。

    圖3 RT-ddPCR檢測(cè)方法特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Specificity of RT-ddPCR assay

    2.2 RT-ddPCR檢測(cè)體系優(yōu)化結(jié)果

    由圖4A、B可見,50 ℃條件下GI、GII型NoV目的基因片段的擴(kuò)增效率均偏低,陽性微滴和陰性微滴分界不明顯;55 ℃和60 ℃條件下目的基因片段擴(kuò)增效率較高,可出現(xiàn)比較明顯的陽性微滴簇,且55 ℃條件下擴(kuò)增的熒光信號(hào)略高于60 ℃,因此,將55 ℃作為GI和GII型NoV RT-ddPCR檢測(cè)體系的最佳最火溫度;由圖4C可見,55 ℃條件下MS2噬菌體目的片段的擴(kuò)增效率偏低,陽性微滴和陰性微滴分界不明顯;57.5、60 ℃和62.5 ℃條件下目的基因片段擴(kuò)增效率較高,陽性微滴和陰性微滴可明顯分解,且62.5 ℃條件下擴(kuò)增的熒光信號(hào)略高于57.5 ℃和60 ℃,因此,將62.5 ℃作為最佳退火溫度。

    圖4 RT-ddPCR檢測(cè)體系在不同退火溫度下擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 Amplification efficiencies of RT-ddPCR assay at different annealing temperatures

    2.3 RT-dd PCR檢測(cè)體系的定量限和準(zhǔn)確度

    對(duì)于MS2噬菌體RNA,5 次重復(fù)測(cè)量得到的核酸濃度平均值為1.269 μg/mL(測(cè)量結(jié)果未給出)。MS2噬菌體為單鏈RNA病毒,基因組由3 569 個(gè)核苷酸組成,故計(jì)算得到的MS2噬菌體RNA拷貝濃度為6.29×10拷貝/μL。

    將GI、GII型NoV RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和MS2噬菌體RNA分別按多倍梯度稀釋,直至稀釋濃度分別為5.4、5.9 拷貝/μL和6.29 拷貝/μL,每個(gè)梯度4 個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn),分別進(jìn)行RT-ddPCR檢測(cè)。結(jié)果表明,GI和GII型NoV的RT-ddPCR檢測(cè)最后兩個(gè)稀釋倍數(shù)的RSD均較大,但是均在25%以內(nèi),表明這兩個(gè)檢測(cè)體系的絕對(duì)定量檢測(cè)靈敏度均可達(dá)到5 拷貝/μL;而MS2噬菌體RT-ddPCR檢測(cè)RSD為4.5%~42.0%,對(duì)單個(gè)拷貝濃度樣品的4 次重復(fù)的RSD達(dá)到42%,故MS2噬菌體RT-ddPCR檢測(cè)的絕對(duì)定量檢測(cè)靈敏度可達(dá)到10 拷貝/μL梯度(表2)。

    表2 RT-ddPCR檢測(cè)體系的定量限和準(zhǔn)確度(n=4)Table 2 Limits of quantitation and accuracy of RT-ddPCR assays (n=4)

    3 個(gè)體系所檢測(cè)的濃度值與相應(yīng)的理論濃度值均具有很好的線性關(guān)系,并且與理論拷貝數(shù)相符,3 個(gè)RT-ddPCR檢測(cè)體系分別能夠?qū)I、GII型NoV和MS2噬菌體進(jìn)行準(zhǔn)確定量(圖5)。

    圖5 RT-ddPCR檢測(cè)體系的線性關(guān)系Fig.5 Linear relationship of RT-ddPCR assays

    2.4 RT-dd PCR檢測(cè)體系的重復(fù)性

    對(duì)于高濃度樣品和低濃度樣品,3 個(gè)RT-ddPCR檢測(cè)體系的RSD 均小于25%,與理論值的偏差為0.34%~15.63%,單因素方差分析發(fā)現(xiàn),各RT-ddPCR檢測(cè)體系的3 個(gè)重復(fù)檢測(cè)值之間無顯著差異(>0.05),可見RT-ddPCR檢測(cè)體系的重復(fù)性均較好(表3)。進(jìn)一步分析數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),高濃度樣品3 個(gè)平行樣品的測(cè)定RSD總體上低于低濃度樣品,可見模板的濃度對(duì)RT-ddPCR檢測(cè)體系的重復(fù)性影響較大,樣品濃度范圍在10~10數(shù)量級(jí)范圍內(nèi)時(shí),RT-ddPCR檢測(cè)體系能夠較好地對(duì)目的模板進(jìn)行定量檢測(cè)。

    表3 RT-ddPCR檢測(cè)體系的重復(fù)性(n=6)Table 3 Repeatability of RT-ddPCR assays (n=6)

    2.5 MS2噬菌體對(duì)食品中NoV RT-ddPCR定量檢測(cè)結(jié)果的影響

    貝類消化腺(牡蠣消化腺)、硬表面食品(蘋果)、生食蔬菜(羽葉生菜)和軟質(zhì)水果(草莓)4 種食品基質(zhì)中,添加與未添加MS2噬菌體過程控制的平行樣品,GII型NoV定量檢測(cè)結(jié)果相近,檢驗(yàn)結(jié)果值均大于0.05,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表4)。4 種食品基質(zhì)過程控制回收率分別均大于1%,均符ISO/TS要求。添加了MS2噬菌體的樣品可通過將GII型NoV定量檢測(cè)結(jié)果除以回收率,得到NoV載量,均達(dá)到了10拷貝數(shù)量級(jí),RSD為2.4%。

    表4 不同食品基質(zhì)中NoV樣品定量檢測(cè)結(jié)果(n=6)Table 4 Results of quantitative detection of norovirus in different food matrixes (n=6)

    2.6 食品中NoV RT-ddPCR定量檢測(cè)方法的應(yīng)用

    實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果表明(具體數(shù)據(jù)未給出),在23 份貝類樣品中有2 份檢出GII型NoV RNA,檢出率為8.70%。硬表面食品、生食蔬菜和軟質(zhì)水果樣品中均未檢出食源性病毒。不同的食品基質(zhì)中MS2噬菌體作為過程控制的回收率不同,貝類消化腺中的過程控制回收率在18.2%~78.6%之間,硬表面食品中的過程控制回收率在9.4%~58.2%之間,生食蔬菜中的過程控制回收率在8.5%~32.2%之間,軟質(zhì)水果中的過程控制回收率在1.7%~19.9%之間。

    3 討論

    NoV是引起急性暴發(fā)非細(xì)菌性胃腸炎的首要致病原體,美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心監(jiān)測(cè)研究估計(jì)30%~50%的食物源性胃腸炎暴發(fā)與NoV有關(guān)。NoV通過污染肥料或水體進(jìn)入食物鏈,被污染的水體中生長(zhǎng)的濾食性貝類,可濃縮水體中的NoV,當(dāng)人類生食來自被NoV污染水體中的貝類或者食用未熟透的貝類時(shí),可感染NoV;此外攜帶了NoV的食品加工者也可能將病毒顆粒轉(zhuǎn)移到食品上。由此可見,被NoV污染的食物是其傳播的關(guān)鍵,建立科學(xué)、高效的食品中NoV檢測(cè)手段,對(duì)控制NoV引起的疾病,保障人民健康具有重要意義。

    數(shù)字PCR技術(shù)將PCR體系分割為許多獨(dú)立的反應(yīng)單元,模板在獨(dú)立的反應(yīng)單元中進(jìn)行PCR擴(kuò)增,檢測(cè)每個(gè)反應(yīng)單元是否有熒光信號(hào)判斷是否含有擴(kuò)增模板,通過泊松統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,不依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線和循環(huán)閾值可直接定量核酸拷貝數(shù)。定量檢測(cè)RNA時(shí),需要將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。Kiselinova等在兩步法反轉(zhuǎn)錄數(shù)字PCR對(duì)定量檢測(cè)HIV RNA時(shí),仍然需要依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算RNA的拷貝濃度。RT-ddPCR可避免反轉(zhuǎn)錄給定量結(jié)果帶來的偏倚,目前已有研究成功利用RT-ddPCR實(shí)現(xiàn)水體中的RV RNA直接定量檢測(cè),靈敏度與real-time PCR相當(dāng)。

    本研究以實(shí)驗(yàn)室保存的GI、GII型NoV RNA標(biāo)準(zhǔn)樣品為模板,分析構(gòu)建的NoV RT-ddPCR檢測(cè)體系的檢出限包括10~10拷貝/μL 5 個(gè)數(shù)量級(jí)。RT-ddPCR對(duì)高濃度模板樣本檢測(cè)能力受限,主要原因是ddPCR平臺(tái)僅可生成小于20 000 個(gè)微滴,當(dāng)模板濃度達(dá)到10拷貝/μL數(shù)量級(jí),不能通過泊松分布計(jì)算模板含量。但是對(duì)于低濃度模板樣本,RT-ddPCR具有較小的變異系數(shù)和更高的靈敏度,Tang Hui等結(jié)果表明,ddPCR具有更好的可重復(fù)性,對(duì)低拷貝的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的定量檢測(cè)優(yōu)于實(shí)時(shí)熒光PCR。Yan Yong等發(fā)現(xiàn),dd PCR能夠從real-time PCR檢測(cè)陰性的咽拭子標(biāo)本中檢測(cè)出流感病毒載量,其檢測(cè)靈敏度更高。

    基于RT-ddPCR技術(shù)的食品中NoV定量檢測(cè)方法,需要構(gòu)建過程控制程序,采用的模式病毒應(yīng)具備以下條件:1)可建立RT-ddPCR檢測(cè)體系,具有與NoV相當(dāng)?shù)臏?zhǔn)確性、靈敏度和變異性;2)容易培養(yǎng),無生物危害,能夠確定效價(jià);3)與NoV基因有明顯區(qū)別,不影響檢測(cè)結(jié)果;4)在自然狀態(tài)中不出現(xiàn),只能人為添加到被檢測(cè)食品中。MS2噬菌體是一種無包膜+ssRNA病毒,侵染宿主為F+(雄株)大腸埃希氏菌,大小和結(jié)構(gòu)與NoV比較接近,可通過計(jì)數(shù)噬菌斑確定其效價(jià),對(duì)人體沒有致病性,基因組不含NoV的靶基因序列。本研究建立了MS2噬菌體RT-ddPCR檢測(cè)體系,準(zhǔn)確性、定量限和重復(fù)性與NoV RT-ddPCR檢測(cè)體系相當(dāng),且不影響食品中NoV的RT-ddPCR定量結(jié)果,因此,可作為過程控制的模式病毒被添加到食品中指示回收率,計(jì)算食品中NoV的實(shí)際載量。

    采用本研究建立的基于RT-ddPCR技術(shù)的食品中NoV定量檢測(cè)方法,對(duì)市售的食品樣品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果僅在貝類樣品中檢出NoV,檢出率為8.7%,與Cheng等的研究中的檢出率相近,而在硬表面食品、生食蔬菜和軟質(zhì)水果樣品中均未檢出NoV。出現(xiàn)以上結(jié)果與不同食品基質(zhì)中NoV污染方式不同有關(guān)。貝類為濾食性動(dòng)物,可將被NoV污染水體中的病毒顆粒富集到消化腺中。有研究表明,被NoV污染的水體中,貝類經(jīng)過4~5 h的生物富集作用,每個(gè)貝類消化腺中可達(dá)到>1 000 NoV載量,貝類消化腺中的NoV濃度可高于周圍水體數(shù)十倍至數(shù)千倍,而且在凈化后的貝類中也常常檢出NoV。硬質(zhì)表面食品、生食蔬菜和軟質(zhì)水果沒有生物蓄積過程,即使被NoV污染,其污染水平可能遠(yuǎn)達(dá)不到貝類消化腺中的NoV濃度。

    本研究建立了基于RT-ddPCR技術(shù)的食品中NoV定量檢測(cè)方法,可定量檢測(cè)單個(gè)拷貝數(shù)量級(jí)的NoV核酸。NoV通常富集或吸附于不同食品基質(zhì)內(nèi)部或者表面,需要經(jīng)過病毒洗脫濃縮、核酸提取純化等前處理,才能對(duì)食品中的NoV進(jìn)行定量檢測(cè),但是前處理過程往往可導(dǎo)致NoV顆粒大量損失,造成RT-ddPCR定量結(jié)果與食品中NoV實(shí)際載量不匹配的現(xiàn)象。由此可見,后續(xù)需要針對(duì)優(yōu)化NoV洗脫濃縮,改善核酸提取效率,提高NoV整體回收率等方面進(jìn)一步研究,以提升RT-ddPCR檢測(cè)體系對(duì)食品中NoV定量檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

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