• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于RT-ddPCR技術(shù)的食品中諾如病毒定量檢測(cè)

    2022-10-31 08:56:48徐蕾蕊魏詠新魏海燕趙曉娟張西萌
    食品科學(xué) 2022年20期
    關(guān)鍵詞:拷貝噬菌體探針

    徐蕾蕊,李 丹,汪 琦,馬 丹,魏詠新,魏海燕,趙曉娟,張西萌,曾 靜

    (中國(guó)海關(guān)科學(xué)技術(shù)研究中心,北京 100026)

    諾如病毒(norovirus,NoV)為正向單鏈RNA病毒,分為5 個(gè)基因型(GI~GV),大多數(shù)感染人類的NoV屬于GI型和GII型,引起腹瀉嘔吐等急性癥狀,嚴(yán)重可致死亡。NoV主要通過污染食品進(jìn)行傳播,食品中含有微量NoV即可引起感染。因此需要建立科學(xué)、高效的食品中NoV檢測(cè)手段,控制NoV引起的疾病,保障人民健康。

    數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)技術(shù)通過將反應(yīng)體系無限稀釋,可使PCR擴(kuò)增的熒光信號(hào)由指數(shù)形式轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào),檢測(cè)靈敏度提高到單分子水平。目前,微滴式數(shù)字PCR平臺(tái)中的逆轉(zhuǎn)錄微滴式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcriptase droplet digital polymerase chain reaction,RT-ddPCR)無需單獨(dú)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),直接定量RNA,可作為食品中NoV定量檢測(cè)的有效技術(shù)手段。

    食品中NoV定量需要病毒濃縮、核酸提取純化等前處理過程,但此過程中病毒回收率未知,故RT-ddPCR定量結(jié)果不等于食品中NoV實(shí)際載量。需要建立簡(jiǎn)便操作性強(qiáng)的過程控制程序,指示NoV回收率,換算食品中NoV實(shí)際載量。MS2噬菌體是一種無包膜+ssRNA病毒,大小和結(jié)構(gòu)與NoV比較接近,可作為過程控制模式病毒添加到食品樣品中。

    本研究擬以RT-ddPCR檢測(cè)體系為基礎(chǔ),建立NoV定量檢測(cè)方法,探索MS2噬菌體的過程控制程序,構(gòu)建基于RT-ddPCR技術(shù)的食品中NoV定量檢測(cè)方法。

    1 材料與方法

    1.1 材料、試劑與儀器

    牡蠣、蘋果、羽葉生菜和草莓 市購。

    GI、GII型NoV、星狀病毒(humanastrovirus,HastV)、甲肝病毒(hepatitis A virus,HAV)、輪狀病毒(rotavirus,RV)RNA,MS2噬菌體懸液(效價(jià)7.2×10PFU/mL),本實(shí)驗(yàn)室保存;GI型NoV RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(特性值(5.4±1.2)×10拷貝/μL)和GII型NoV RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(特性值(5.9±1.2)×10拷貝/μL),本實(shí)驗(yàn)室研制保存;GII型NoV陽性糞便樣品,由北京兒童醫(yī)院贈(zèng)送。

    焦碳酸二乙酯(diethyl paracanbonate,DEPC)處理水、蛋白酶K 天根生化科技(北京)有限公司;總RNA提取試劑Trizol、SuperScript III Platinum One-Step Quantitative RT-PCR system 美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司;無水乙醇、異丙醇、氯仿 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司;QIAamp Virial RNA Mini Kit 德國(guó)QIAGEN公司;Dynadbeads mRNA Purification Kit 美國(guó)Life Technology公司;One-Step RT-ddPCR Advanced Kit for Probes 美國(guó)伯樂公司。

    熱循環(huán)儀、實(shí)時(shí)熒光PCR儀 美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司;QX-200數(shù)字PCR系統(tǒng)、微滴生成儀 美國(guó)伯樂公司;微定量核酸蛋白分析儀 美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

    1.2 方法

    1.2.1 引物探針設(shè)計(jì)和篩選

    根據(jù)NoV基因型分型保守區(qū)域:編碼RNA依賴的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase,RdRp)區(qū)域和開放閱讀框2(Open Reading Frame 2,ORF2)編碼主要結(jié)構(gòu)蛋白VP1區(qū)域,通過NCBI在線工具進(jìn)行序列分析和比對(duì),利用Prime Express軟件V4.0(ABI,Foster City,CA,USA)分別設(shè)計(jì)GI型和GII型NoV引物和探針;對(duì)于MS2噬菌體,選取Dreier等設(shè)計(jì)的引物和探針,通過NCBI在線工具BLAST進(jìn)行序列分析和比對(duì),確定目的片段同源性。分別取實(shí)驗(yàn)室保存的GI、GII型NoV RNA和提取的MS2噬菌體RNA為模板,首先采用熒光PCR方法對(duì)設(shè)計(jì)的引物探針進(jìn)行篩選和特異性驗(yàn)證,再采用RT-ddPCR體系進(jìn)一步驗(yàn)證篩選的引物探針的特異性。反應(yīng)參數(shù):熒光PCR:50 ℃反轉(zhuǎn)錄15 min,95 ℃熱啟動(dòng)2 min,95 ℃變性15 s、60 ℃退火延伸1 min、40 個(gè)循環(huán);RT-ddPCR:參照One-Step RT-ddPCR Advanced Kit for Probes試劑盒說明書配制反應(yīng)體系,60 ℃反轉(zhuǎn)錄60 min,95 ℃熱啟動(dòng)10 min,95 ℃變性30 s、60 ℃退火延伸1 min、40 個(gè)循環(huán),98 ℃酶失活10 min,4 ℃保持,升降溫速率2~3 ℃/s。

    1.2.2 RT-ddPCR體系擴(kuò)增溫度優(yōu)化

    分別以實(shí)驗(yàn)室保存的GI、GII型NoV RNA和提取的MS2噬菌體RNA為模板,按One-Step RT-ddPCR Advanced Kit for Probes試劑盒說明書,分別在不同退火溫度下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),以陽性微滴擴(kuò)增強(qiáng)度為標(biāo)準(zhǔn),對(duì)篩選出的引物探針退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。

    1.2.3 GI、GII型NoV和MS2噬菌體RT-ddPCR定量檢測(cè)方法學(xué)評(píng)估

    1.2.3.1 3 個(gè)RT-ddPCR定量檢測(cè)方法的定量限和準(zhǔn)確性分析

    MS2噬菌體核酸拷貝濃度測(cè)定:取MS2噬菌體懸液100 μL,提取RNA后溶于100 μL DEPC水,應(yīng)用微定量核酸蛋白分析儀測(cè)定其OD、OD/OD及核酸質(zhì)量濃度值,重復(fù)測(cè)定5 次,取平均值作為提取的RNA核酸質(zhì)量濃度值。計(jì)算提取的MS2噬菌體核酸拷貝濃度,公式如下:

    將保存的GI、GII型NoV RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和提取的MS2噬菌體RNA分別按多倍梯度稀釋,每個(gè)梯度各取2 μL,分別進(jìn)行RT-ddPCR檢測(cè),每個(gè)梯度重復(fù)檢測(cè)4 次,計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD),分別確定3 個(gè)RT-ddPCR定量檢測(cè)方法的定量限,分析檢測(cè)值與理論值之間的關(guān)系,確定檢測(cè)體系的準(zhǔn)確性。

    1.2.3.2 3 個(gè)RT-ddPCR定量檢測(cè)方法的重復(fù)性分析

    分別取GI、GII型NoV RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和提取的MS2噬菌體RNA為模板,按10 倍梯度稀釋,各取高、低兩個(gè)梯度進(jìn)行相應(yīng)的RT-ddPCR檢測(cè),每個(gè)梯度各取2 μL。每種模板分別各取3 個(gè)平行進(jìn)行稀釋,每個(gè)平行每個(gè)梯度重復(fù)檢測(cè)6 次,同時(shí)設(shè)置1 個(gè)空白對(duì)照(DEPC水)。計(jì)算各樣品各梯度的檢測(cè)值與其理論值的偏差,分析檢測(cè)方法的重復(fù)性。

    1.2.4 實(shí)際樣品中添加MS2噬菌體對(duì)NoV定量檢測(cè)結(jié)果的影響分析

    由于CEN ISO/TS 15216-2:2019中不同食品基質(zhì)的前處理方法不同,選擇貝類(牡蠣)、硬質(zhì)表面食品(蘋果)、生食蔬菜(羽葉生菜)以及軟質(zhì)水果(草莓)4 種食品基質(zhì)用于制備陽性樣品。根據(jù)CEN ISO/TS 15216-2:2019中不同食品基質(zhì)的檢測(cè)用量,分別向牡蠣消化腺2 g、蘋果(帶皮)表面100 cm、羽葉生菜25 g和草莓25 g樣品中添加100 μL實(shí)驗(yàn)室保存的NoV陽性糞便樣品(GII型NoV),靜置30 min,每種基質(zhì)制備兩份平行陽性樣品。制備的陽性樣品(包括牡蠣消化腺2 g、蘋果(帶皮)表面100 cm、羽葉生菜25 g和草莓25 g)全部用于RT-ddPCR定量檢測(cè)。各陽性樣品參照CEN ISO/TS 15216-2:2019中不同不同食品基質(zhì)的前處理方法進(jìn)行病毒洗脫和濃縮,其中一份陽性樣品在前處理過程中添加100 μL MS2噬菌體懸液,另一份平行的陽性樣品不添加MS2噬菌體懸液。病毒洗脫和濃縮后,提取RNA溶于100 μL DEPC處理水中。將提取的陽性樣本RNA分別進(jìn)行GII型NoV和MS2噬菌體RT-ddPCR定量檢測(cè),每份樣品重復(fù)檢測(cè)6 次,分析添加MS2噬菌體對(duì)陽性樣品中NoV定量檢測(cè)結(jié)果的影響。

    1.2.5 基于RT-ddPCR技術(shù)的食品中NoV定量檢測(cè)方法的實(shí)際應(yīng)用

    從超市或市場(chǎng)購入貝類樣品23 份、硬表面食品8 份、生食蔬菜9 份、軟質(zhì)水果15 份,共計(jì)55 份樣品。硬表面食品和生食蔬菜購入后立即進(jìn)行檢測(cè)或保存于4 ℃,貝類和軟質(zhì)水果可立即進(jìn)行檢測(cè),或者保存于-80 ℃。參考CEN ISO/TS 15216-2:2019中對(duì)不同食品基質(zhì)的檢測(cè)用量的規(guī)定,分別取貝類消化腺2 g、硬表面食品表面積100 cm、生食蔬菜25 g、軟質(zhì)水果25 g,采用基于RT-ddPCR技術(shù)的食品中NoV定量檢測(cè)方法進(jìn)行NoV篩查和定量檢測(cè),且每份實(shí)際樣品在檢測(cè)前,均添加100 μL實(shí)驗(yàn)室保存的MS2噬菌體懸液作為過程質(zhì)控,分析不同食品基質(zhì)中MS2噬菌體的回收率,并計(jì)算陽性樣品中NoV實(shí)際載量。

    1.3 統(tǒng)計(jì)分析

    采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析各組之間的差別,統(tǒng)計(jì)方法采用檢驗(yàn)和單因素方差分析,檢驗(yàn)水平=0.05。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 引物探針篩選結(jié)果

    根據(jù)NoV基因型分型保守區(qū)域分別設(shè)計(jì)出3 組GI型NoV引物、探針和4 組GII型NoV引物、探針,引物探針序列未給出。熒光PCR篩選結(jié)果表明,針對(duì)GI型和GII型NoV的各組引物探針均能有效擴(kuò)增出靶基因,其中來源于GB 4789.42—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 諾如病毒檢驗(yàn)》的引物探針COG1-F/R/RING1-P和COG2-F/R/RING2-P具有較高的擴(kuò)增效率,可篩選分別用于構(gòu)建GI、GII型NoV RT-ddPCR體系。對(duì)其特異性進(jìn)行驗(yàn)證(圖1)。熒光PCR特異性驗(yàn)證結(jié)果表明,篩選的GI型NoV特異性COG1-F/COG1-R/RING1-P、GII型NoV引物探針COG2-F/COG2-R/RING2-P和MS2噬菌體引物探針MS2-TM3-F/R/P特異性良好(圖2),各篩選的引物探針序列見表1。

    圖1 熒光PCR篩選引物探針Fig.1 Screening of primers and probes by fluorescence PCR assay

    圖2 熒光PCR驗(yàn)證引物探針特異性Fig.2 Specificity of selected primers and probes verified by fluorescence PCR assay

    表1 篩選的RT-ddPCR引物探針序列Table 1 Sequences of selected primers and probes for RT-ddPCR assay

    RT-ddPCR特異性驗(yàn)證結(jié)果表明,3 個(gè)RT-ddPCR體系只有各自對(duì)應(yīng)目的片段特異性擴(kuò)增,其余病毒經(jīng)檢測(cè)均呈陰性,證明篩選的3 組引物探針在RT-ddPCR體系中特異性良好(圖3)。

    圖3 RT-ddPCR檢測(cè)方法特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Specificity of RT-ddPCR assay

    2.2 RT-ddPCR檢測(cè)體系優(yōu)化結(jié)果

    由圖4A、B可見,50 ℃條件下GI、GII型NoV目的基因片段的擴(kuò)增效率均偏低,陽性微滴和陰性微滴分界不明顯;55 ℃和60 ℃條件下目的基因片段擴(kuò)增效率較高,可出現(xiàn)比較明顯的陽性微滴簇,且55 ℃條件下擴(kuò)增的熒光信號(hào)略高于60 ℃,因此,將55 ℃作為GI和GII型NoV RT-ddPCR檢測(cè)體系的最佳最火溫度;由圖4C可見,55 ℃條件下MS2噬菌體目的片段的擴(kuò)增效率偏低,陽性微滴和陰性微滴分界不明顯;57.5、60 ℃和62.5 ℃條件下目的基因片段擴(kuò)增效率較高,陽性微滴和陰性微滴可明顯分解,且62.5 ℃條件下擴(kuò)增的熒光信號(hào)略高于57.5 ℃和60 ℃,因此,將62.5 ℃作為最佳退火溫度。

    圖4 RT-ddPCR檢測(cè)體系在不同退火溫度下擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 Amplification efficiencies of RT-ddPCR assay at different annealing temperatures

    2.3 RT-dd PCR檢測(cè)體系的定量限和準(zhǔn)確度

    對(duì)于MS2噬菌體RNA,5 次重復(fù)測(cè)量得到的核酸濃度平均值為1.269 μg/mL(測(cè)量結(jié)果未給出)。MS2噬菌體為單鏈RNA病毒,基因組由3 569 個(gè)核苷酸組成,故計(jì)算得到的MS2噬菌體RNA拷貝濃度為6.29×10拷貝/μL。

    將GI、GII型NoV RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和MS2噬菌體RNA分別按多倍梯度稀釋,直至稀釋濃度分別為5.4、5.9 拷貝/μL和6.29 拷貝/μL,每個(gè)梯度4 個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn),分別進(jìn)行RT-ddPCR檢測(cè)。結(jié)果表明,GI和GII型NoV的RT-ddPCR檢測(cè)最后兩個(gè)稀釋倍數(shù)的RSD均較大,但是均在25%以內(nèi),表明這兩個(gè)檢測(cè)體系的絕對(duì)定量檢測(cè)靈敏度均可達(dá)到5 拷貝/μL;而MS2噬菌體RT-ddPCR檢測(cè)RSD為4.5%~42.0%,對(duì)單個(gè)拷貝濃度樣品的4 次重復(fù)的RSD達(dá)到42%,故MS2噬菌體RT-ddPCR檢測(cè)的絕對(duì)定量檢測(cè)靈敏度可達(dá)到10 拷貝/μL梯度(表2)。

    表2 RT-ddPCR檢測(cè)體系的定量限和準(zhǔn)確度(n=4)Table 2 Limits of quantitation and accuracy of RT-ddPCR assays (n=4)

    3 個(gè)體系所檢測(cè)的濃度值與相應(yīng)的理論濃度值均具有很好的線性關(guān)系,并且與理論拷貝數(shù)相符,3 個(gè)RT-ddPCR檢測(cè)體系分別能夠?qū)I、GII型NoV和MS2噬菌體進(jìn)行準(zhǔn)確定量(圖5)。

    圖5 RT-ddPCR檢測(cè)體系的線性關(guān)系Fig.5 Linear relationship of RT-ddPCR assays

    2.4 RT-dd PCR檢測(cè)體系的重復(fù)性

    對(duì)于高濃度樣品和低濃度樣品,3 個(gè)RT-ddPCR檢測(cè)體系的RSD 均小于25%,與理論值的偏差為0.34%~15.63%,單因素方差分析發(fā)現(xiàn),各RT-ddPCR檢測(cè)體系的3 個(gè)重復(fù)檢測(cè)值之間無顯著差異(>0.05),可見RT-ddPCR檢測(cè)體系的重復(fù)性均較好(表3)。進(jìn)一步分析數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),高濃度樣品3 個(gè)平行樣品的測(cè)定RSD總體上低于低濃度樣品,可見模板的濃度對(duì)RT-ddPCR檢測(cè)體系的重復(fù)性影響較大,樣品濃度范圍在10~10數(shù)量級(jí)范圍內(nèi)時(shí),RT-ddPCR檢測(cè)體系能夠較好地對(duì)目的模板進(jìn)行定量檢測(cè)。

    表3 RT-ddPCR檢測(cè)體系的重復(fù)性(n=6)Table 3 Repeatability of RT-ddPCR assays (n=6)

    2.5 MS2噬菌體對(duì)食品中NoV RT-ddPCR定量檢測(cè)結(jié)果的影響

    貝類消化腺(牡蠣消化腺)、硬表面食品(蘋果)、生食蔬菜(羽葉生菜)和軟質(zhì)水果(草莓)4 種食品基質(zhì)中,添加與未添加MS2噬菌體過程控制的平行樣品,GII型NoV定量檢測(cè)結(jié)果相近,檢驗(yàn)結(jié)果值均大于0.05,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表4)。4 種食品基質(zhì)過程控制回收率分別均大于1%,均符ISO/TS要求。添加了MS2噬菌體的樣品可通過將GII型NoV定量檢測(cè)結(jié)果除以回收率,得到NoV載量,均達(dá)到了10拷貝數(shù)量級(jí),RSD為2.4%。

    表4 不同食品基質(zhì)中NoV樣品定量檢測(cè)結(jié)果(n=6)Table 4 Results of quantitative detection of norovirus in different food matrixes (n=6)

    2.6 食品中NoV RT-ddPCR定量檢測(cè)方法的應(yīng)用

    實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果表明(具體數(shù)據(jù)未給出),在23 份貝類樣品中有2 份檢出GII型NoV RNA,檢出率為8.70%。硬表面食品、生食蔬菜和軟質(zhì)水果樣品中均未檢出食源性病毒。不同的食品基質(zhì)中MS2噬菌體作為過程控制的回收率不同,貝類消化腺中的過程控制回收率在18.2%~78.6%之間,硬表面食品中的過程控制回收率在9.4%~58.2%之間,生食蔬菜中的過程控制回收率在8.5%~32.2%之間,軟質(zhì)水果中的過程控制回收率在1.7%~19.9%之間。

    3 討論

    NoV是引起急性暴發(fā)非細(xì)菌性胃腸炎的首要致病原體,美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心監(jiān)測(cè)研究估計(jì)30%~50%的食物源性胃腸炎暴發(fā)與NoV有關(guān)。NoV通過污染肥料或水體進(jìn)入食物鏈,被污染的水體中生長(zhǎng)的濾食性貝類,可濃縮水體中的NoV,當(dāng)人類生食來自被NoV污染水體中的貝類或者食用未熟透的貝類時(shí),可感染NoV;此外攜帶了NoV的食品加工者也可能將病毒顆粒轉(zhuǎn)移到食品上。由此可見,被NoV污染的食物是其傳播的關(guān)鍵,建立科學(xué)、高效的食品中NoV檢測(cè)手段,對(duì)控制NoV引起的疾病,保障人民健康具有重要意義。

    數(shù)字PCR技術(shù)將PCR體系分割為許多獨(dú)立的反應(yīng)單元,模板在獨(dú)立的反應(yīng)單元中進(jìn)行PCR擴(kuò)增,檢測(cè)每個(gè)反應(yīng)單元是否有熒光信號(hào)判斷是否含有擴(kuò)增模板,通過泊松統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,不依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線和循環(huán)閾值可直接定量核酸拷貝數(shù)。定量檢測(cè)RNA時(shí),需要將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。Kiselinova等在兩步法反轉(zhuǎn)錄數(shù)字PCR對(duì)定量檢測(cè)HIV RNA時(shí),仍然需要依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算RNA的拷貝濃度。RT-ddPCR可避免反轉(zhuǎn)錄給定量結(jié)果帶來的偏倚,目前已有研究成功利用RT-ddPCR實(shí)現(xiàn)水體中的RV RNA直接定量檢測(cè),靈敏度與real-time PCR相當(dāng)。

    本研究以實(shí)驗(yàn)室保存的GI、GII型NoV RNA標(biāo)準(zhǔn)樣品為模板,分析構(gòu)建的NoV RT-ddPCR檢測(cè)體系的檢出限包括10~10拷貝/μL 5 個(gè)數(shù)量級(jí)。RT-ddPCR對(duì)高濃度模板樣本檢測(cè)能力受限,主要原因是ddPCR平臺(tái)僅可生成小于20 000 個(gè)微滴,當(dāng)模板濃度達(dá)到10拷貝/μL數(shù)量級(jí),不能通過泊松分布計(jì)算模板含量。但是對(duì)于低濃度模板樣本,RT-ddPCR具有較小的變異系數(shù)和更高的靈敏度,Tang Hui等結(jié)果表明,ddPCR具有更好的可重復(fù)性,對(duì)低拷貝的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的定量檢測(cè)優(yōu)于實(shí)時(shí)熒光PCR。Yan Yong等發(fā)現(xiàn),dd PCR能夠從real-time PCR檢測(cè)陰性的咽拭子標(biāo)本中檢測(cè)出流感病毒載量,其檢測(cè)靈敏度更高。

    基于RT-ddPCR技術(shù)的食品中NoV定量檢測(cè)方法,需要構(gòu)建過程控制程序,采用的模式病毒應(yīng)具備以下條件:1)可建立RT-ddPCR檢測(cè)體系,具有與NoV相當(dāng)?shù)臏?zhǔn)確性、靈敏度和變異性;2)容易培養(yǎng),無生物危害,能夠確定效價(jià);3)與NoV基因有明顯區(qū)別,不影響檢測(cè)結(jié)果;4)在自然狀態(tài)中不出現(xiàn),只能人為添加到被檢測(cè)食品中。MS2噬菌體是一種無包膜+ssRNA病毒,侵染宿主為F+(雄株)大腸埃希氏菌,大小和結(jié)構(gòu)與NoV比較接近,可通過計(jì)數(shù)噬菌斑確定其效價(jià),對(duì)人體沒有致病性,基因組不含NoV的靶基因序列。本研究建立了MS2噬菌體RT-ddPCR檢測(cè)體系,準(zhǔn)確性、定量限和重復(fù)性與NoV RT-ddPCR檢測(cè)體系相當(dāng),且不影響食品中NoV的RT-ddPCR定量結(jié)果,因此,可作為過程控制的模式病毒被添加到食品中指示回收率,計(jì)算食品中NoV的實(shí)際載量。

    采用本研究建立的基于RT-ddPCR技術(shù)的食品中NoV定量檢測(cè)方法,對(duì)市售的食品樣品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果僅在貝類樣品中檢出NoV,檢出率為8.7%,與Cheng等的研究中的檢出率相近,而在硬表面食品、生食蔬菜和軟質(zhì)水果樣品中均未檢出NoV。出現(xiàn)以上結(jié)果與不同食品基質(zhì)中NoV污染方式不同有關(guān)。貝類為濾食性動(dòng)物,可將被NoV污染水體中的病毒顆粒富集到消化腺中。有研究表明,被NoV污染的水體中,貝類經(jīng)過4~5 h的生物富集作用,每個(gè)貝類消化腺中可達(dá)到>1 000 NoV載量,貝類消化腺中的NoV濃度可高于周圍水體數(shù)十倍至數(shù)千倍,而且在凈化后的貝類中也常常檢出NoV。硬質(zhì)表面食品、生食蔬菜和軟質(zhì)水果沒有生物蓄積過程,即使被NoV污染,其污染水平可能遠(yuǎn)達(dá)不到貝類消化腺中的NoV濃度。

    本研究建立了基于RT-ddPCR技術(shù)的食品中NoV定量檢測(cè)方法,可定量檢測(cè)單個(gè)拷貝數(shù)量級(jí)的NoV核酸。NoV通常富集或吸附于不同食品基質(zhì)內(nèi)部或者表面,需要經(jīng)過病毒洗脫濃縮、核酸提取純化等前處理,才能對(duì)食品中的NoV進(jìn)行定量檢測(cè),但是前處理過程往往可導(dǎo)致NoV顆粒大量損失,造成RT-ddPCR定量結(jié)果與食品中NoV實(shí)際載量不匹配的現(xiàn)象。由此可見,后續(xù)需要針對(duì)優(yōu)化NoV洗脫濃縮,改善核酸提取效率,提高NoV整體回收率等方面進(jìn)一步研究,以提升RT-ddPCR檢測(cè)體系對(duì)食品中NoV定量檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

    猜你喜歡
    拷貝噬菌體探針
    不同富集培養(yǎng)方法對(duì)噬菌體PEf771的滴度影響
    高效裂解多重耐藥金黃色葡萄球菌的噬菌體分離及裂解酶的制備
    中國(guó)生殖健康(2018年1期)2018-11-06 07:14:38
    多通道Taqman-探針熒光定量PCR鑒定MRSA方法的建立
    BOPIM-dma作為BSA Site Ⅰ特異性探針的研究及其應(yīng)用
    副溶血弧菌噬菌體微膠囊的制備及在餌料中的應(yīng)用
    透射電子顯微鏡中的掃描探針裝置
    噬菌體治療鮑曼不動(dòng)桿菌感染的綜述
    掃描近場(chǎng)光電多功能探針系統(tǒng)
    文件拷貝誰最“給力”
    午夜老司机福利剧场| 亚洲男人的天堂狠狠| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 亚洲av五月六月丁香网| eeuss影院久久| 中文字幕熟女人妻在线| 操出白浆在线播放| 99久久精品一区二区三区| 日韩中文字幕欧美一区二区| 在线免费观看的www视频| 国产精品 国内视频| 国产精品亚洲av一区麻豆| 一区二区三区国产精品乱码| 身体一侧抽搐| 十八禁网站免费在线| 老鸭窝网址在线观看| 特大巨黑吊av在线直播| 国产精品99久久久久久久久| 美女大奶头视频| www.999成人在线观看| 黄色视频,在线免费观看| 制服丝袜大香蕉在线| 欧美zozozo另类| 国模一区二区三区四区视频| 青草久久国产| 无人区码免费观看不卡| 国内精品久久久久久久电影| 欧美3d第一页| www.熟女人妻精品国产| 日日夜夜操网爽| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 91字幕亚洲| av国产免费在线观看| 国产精品一区二区三区四区久久| 欧美一区二区亚洲| 嫁个100分男人电影在线观看| 色av中文字幕| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 久久精品国产自在天天线| 性色av乱码一区二区三区2| 免费在线观看亚洲国产| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 大型黄色视频在线免费观看| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 91在线精品国自产拍蜜月 | 午夜福利欧美成人| 免费看十八禁软件| 两个人看的免费小视频| 国产免费一级a男人的天堂| 五月玫瑰六月丁香| 一级黄片播放器| 一区二区三区国产精品乱码| 亚洲精品亚洲一区二区| 久久久久久久午夜电影| 日本黄色片子视频| 国产毛片a区久久久久| 美女免费视频网站| 午夜福利在线观看吧| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| av福利片在线观看| 免费电影在线观看免费观看| 麻豆国产av国片精品| 国产成人av激情在线播放| 不卡一级毛片| 国产精品精品国产色婷婷| 国产日本99.免费观看| 免费av观看视频| 国产精品影院久久| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 老司机午夜福利在线观看视频| 一本综合久久免费| 国产高清激情床上av| 一个人观看的视频www高清免费观看| 国产单亲对白刺激| 亚洲专区国产一区二区| 国产91精品成人一区二区三区| 91久久精品国产一区二区成人 | 美女 人体艺术 gogo| 久久久国产精品麻豆| 久久香蕉国产精品| 偷拍熟女少妇极品色| 中亚洲国语对白在线视频| 99精品久久久久人妻精品| 老司机福利观看| 美女被艹到高潮喷水动态| 国内精品一区二区在线观看| 三级国产精品欧美在线观看| www日本黄色视频网| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 91在线精品国自产拍蜜月 | 欧美日韩瑟瑟在线播放| 亚洲一区二区三区色噜噜| 一二三四社区在线视频社区8| 欧美色视频一区免费| 免费人成在线观看视频色| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 色综合站精品国产| 精品日产1卡2卡| 亚洲色图av天堂| 久久亚洲精品不卡| 日韩有码中文字幕| 国产亚洲精品一区二区www| 91久久精品电影网| 久久久久久久久大av| 亚洲av电影在线进入| 69av精品久久久久久| 久99久视频精品免费| 中文字幕高清在线视频| 精品国产三级普通话版| 亚洲国产色片| 老司机深夜福利视频在线观看| 一区福利在线观看| 久9热在线精品视频| 99久久精品一区二区三区| 免费看a级黄色片| 午夜亚洲福利在线播放| 最新美女视频免费是黄的| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 国产亚洲欧美在线一区二区| 色视频www国产| 国产精品乱码一区二三区的特点| 日本 av在线| 久久久久国内视频| 国产在线精品亚洲第一网站| 免费观看精品视频网站| 亚洲五月天丁香| 久久久久国内视频| 免费看日本二区| 可以在线观看毛片的网站| 一级黄色大片毛片| 亚洲欧美日韩无卡精品| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 在线观看午夜福利视频| 狂野欧美激情性xxxx| 麻豆一二三区av精品| 亚洲成人免费电影在线观看| 啦啦啦免费观看视频1| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 在线观看免费午夜福利视频| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 人妻夜夜爽99麻豆av| 嫩草影院精品99| 老司机午夜福利在线观看视频| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 亚洲无线在线观看| 午夜福利成人在线免费观看| 亚洲专区中文字幕在线| 极品教师在线免费播放| 欧美国产日韩亚洲一区| 波多野结衣高清无吗| 男女之事视频高清在线观看| 国内精品久久久久精免费| 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲五月天丁香| 99热精品在线国产| eeuss影院久久| 桃红色精品国产亚洲av| 一个人看视频在线观看www免费 | 亚洲avbb在线观看| 中文字幕av成人在线电影| 51午夜福利影视在线观看| www.熟女人妻精品国产| 日韩精品青青久久久久久| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 国产成人av教育| 波多野结衣高清作品| 香蕉av资源在线| 淫秽高清视频在线观看| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 露出奶头的视频| 日日干狠狠操夜夜爽| 天堂影院成人在线观看| 久久精品人妻少妇| 69av精品久久久久久| 天堂网av新在线| 婷婷精品国产亚洲av在线| 69av精品久久久久久| 国产色婷婷99| 一a级毛片在线观看| 黄片大片在线免费观看| 国产免费男女视频| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 久久久久性生活片| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产 一区 欧美 日韩| 国产乱人视频| 欧美zozozo另类| 日韩大尺度精品在线看网址| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 欧美乱妇无乱码| 91九色精品人成在线观看| 亚洲美女视频黄频| 免费在线观看亚洲国产| 999久久久精品免费观看国产| 超碰av人人做人人爽久久 | 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 床上黄色一级片| 老司机福利观看| av在线蜜桃| 欧美日韩乱码在线| 国产精品电影一区二区三区| 亚洲精品日韩av片在线观看 | 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 好男人在线观看高清免费视频| 一区二区三区国产精品乱码| 久久久久久久久久黄片| 狂野欧美激情性xxxx| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 90打野战视频偷拍视频| 制服人妻中文乱码| 美女大奶头视频| 久久久色成人| 99国产精品一区二区三区| 久久精品国产清高在天天线| 性欧美人与动物交配| 日本黄色视频三级网站网址| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产亚洲精品av在线| 免费电影在线观看免费观看| 国产成人欧美在线观看| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 一个人观看的视频www高清免费观看| 国产av麻豆久久久久久久| 久久亚洲精品不卡| 性欧美人与动物交配| 国产一区二区三区视频了| 18禁美女被吸乳视频| 淫妇啪啪啪对白视频| 日韩欧美精品v在线| 免费观看的影片在线观看| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 亚洲精品色激情综合| 国产成人欧美在线观看| 国产三级中文精品| 成年人黄色毛片网站| 老司机深夜福利视频在线观看| 亚洲av成人av| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 一区福利在线观看| 国产精品久久久久久久久免 | 亚洲乱码一区二区免费版| 亚洲最大成人手机在线| 欧美最新免费一区二区三区 | 国产精品 国内视频| 亚洲午夜理论影院| 变态另类丝袜制服| 99热这里只有是精品50| 他把我摸到了高潮在线观看| 国产单亲对白刺激| 日韩精品青青久久久久久| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 最近视频中文字幕2019在线8| 日韩欧美国产在线观看| 日本 av在线| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 欧美日韩精品网址| 岛国视频午夜一区免费看| 国产高清激情床上av| www日本黄色视频网| 老鸭窝网址在线观看| 国产精品 欧美亚洲| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 午夜影院日韩av| 偷拍熟女少妇极品色| 91麻豆av在线| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 国产伦人伦偷精品视频| 可以在线观看毛片的网站| 国产精品久久久人人做人人爽| 欧美3d第一页| 国产三级在线视频| 三级毛片av免费| 国产视频一区二区在线看| 欧美日韩乱码在线| 欧美乱码精品一区二区三区| 国产精品日韩av在线免费观看| 日韩欧美在线二视频| 无遮挡黄片免费观看| 一级作爱视频免费观看| 亚洲专区国产一区二区| 欧美成人a在线观看| 91在线观看av| 一二三四社区在线视频社区8| 亚洲不卡免费看| 欧美av亚洲av综合av国产av| 国产日本99.免费观看| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 午夜老司机福利剧场| 又黄又爽又免费观看的视频| 麻豆国产97在线/欧美| 99热这里只有精品一区| 色在线成人网| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 欧美色视频一区免费| 国产老妇女一区| 欧美在线一区亚洲| 国产成+人综合+亚洲专区| 色综合站精品国产| 成人精品一区二区免费| 亚洲av成人av| 免费观看精品视频网站| АⅤ资源中文在线天堂| 亚洲在线观看片| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 麻豆成人av在线观看| 午夜福利免费观看在线| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 亚洲av成人av| 免费人成在线观看视频色| 欧美黄色片欧美黄色片| 老司机福利观看| 一区二区三区激情视频| 搡老妇女老女人老熟妇| 中文字幕av在线有码专区| 无遮挡黄片免费观看| 午夜精品久久久久久毛片777| 成人特级黄色片久久久久久久| 免费人成视频x8x8入口观看| 又黄又爽又免费观看的视频| 欧美在线一区亚洲| 国产乱人伦免费视频| 国产高清有码在线观看视频| 日韩精品中文字幕看吧| а√天堂www在线а√下载| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 90打野战视频偷拍视频| 9191精品国产免费久久| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 99久久综合精品五月天人人| 欧美日韩黄片免| 国产高清有码在线观看视频| 亚洲人成网站高清观看| 97碰自拍视频| 嫩草影院入口| 免费一级毛片在线播放高清视频| 村上凉子中文字幕在线| 亚洲精华国产精华精| 免费在线观看日本一区| 国产真实伦视频高清在线观看 | 精品人妻1区二区| 黑人欧美特级aaaaaa片| 精品人妻1区二区| 一边摸一边抽搐一进一小说| 成人精品一区二区免费| 久久久成人免费电影| 三级毛片av免费| 国产老妇女一区| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 在线播放国产精品三级| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 一个人看的www免费观看视频| 久久精品国产清高在天天线| 国内精品久久久久久久电影| 亚洲一区二区三区色噜噜| av视频在线观看入口| 美女被艹到高潮喷水动态| 国产免费av片在线观看野外av| 国内精品久久久久久久电影| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 深爱激情五月婷婷| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 亚洲欧美日韩东京热| 丰满人妻一区二区三区视频av | 女同久久另类99精品国产91| a在线观看视频网站| 国产视频一区二区在线看| a在线观看视频网站| 午夜两性在线视频| 1024手机看黄色片| 国产高清视频在线播放一区| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 亚洲专区中文字幕在线| 99久久精品国产亚洲精品| 人人妻人人澡欧美一区二区| 99久久综合精品五月天人人| 啦啦啦免费观看视频1| 人妻久久中文字幕网| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 欧美黄色淫秽网站| 美女免费视频网站| 久久伊人香网站| 国产精品久久久久久精品电影| 天堂影院成人在线观看| 亚洲18禁久久av| 精品久久久久久久久久免费视频| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产激情欧美一区二区| 90打野战视频偷拍视频| 国产免费男女视频| 欧美黑人巨大hd| 在线a可以看的网站| 十八禁人妻一区二区| 中文亚洲av片在线观看爽| 久久久久九九精品影院| 精品一区二区三区人妻视频| 好男人在线观看高清免费视频| 免费在线观看影片大全网站| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| av中文乱码字幕在线| av片东京热男人的天堂| 欧美bdsm另类| 国产综合懂色| 国产精品三级大全| 国产亚洲精品av在线| 制服丝袜大香蕉在线| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 欧美黑人巨大hd| 国产精品亚洲一级av第二区| 一本一本综合久久| 97碰自拍视频| 99久国产av精品| 久久精品国产自在天天线| 久久伊人香网站| 国产精品免费一区二区三区在线| 窝窝影院91人妻| 一个人免费在线观看的高清视频| 欧美乱色亚洲激情| 嫩草影院入口| 老汉色∧v一级毛片| 99精品久久久久人妻精品| 嫩草影视91久久| 亚洲一区高清亚洲精品| 热99在线观看视频| 国产成人av激情在线播放| 亚洲国产欧美人成| 欧美日韩国产亚洲二区| 天天躁日日操中文字幕| 国产极品精品免费视频能看的| 在线观看免费午夜福利视频| 日韩成人在线观看一区二区三区| 日本在线视频免费播放| 长腿黑丝高跟| 日韩欧美在线乱码| 一夜夜www| 亚洲专区国产一区二区| 男人和女人高潮做爰伦理| 久久香蕉精品热| 久久精品91无色码中文字幕| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 久久精品影院6| 高潮久久久久久久久久久不卡| 有码 亚洲区| 搡老熟女国产l中国老女人| 亚洲av熟女| 久久香蕉精品热| 成人av在线播放网站| 最好的美女福利视频网| 国产久久久一区二区三区| 国产私拍福利视频在线观看| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 国产免费男女视频| 性色avwww在线观看| 一进一出抽搐gif免费好疼| 免费在线观看亚洲国产| 日韩有码中文字幕| 亚洲自拍偷在线| 亚洲国产精品久久男人天堂| АⅤ资源中文在线天堂| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 最近最新免费中文字幕在线| 一进一出抽搐gif免费好疼| 国产69精品久久久久777片| 精品国产三级普通话版| 国产探花在线观看一区二区| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 两个人的视频大全免费| 欧美3d第一页| 欧美午夜高清在线| 一区二区三区国产精品乱码| 久久久久久久精品吃奶| 我的老师免费观看完整版| 在线看三级毛片| 午夜福利欧美成人| 高潮久久久久久久久久久不卡| 中文字幕熟女人妻在线| 欧美不卡视频在线免费观看| 最近在线观看免费完整版| 欧美日本亚洲视频在线播放| 日韩欧美在线二视频| 亚洲av成人av| 日韩国内少妇激情av| 久久久久九九精品影院| 午夜福利在线在线| 色尼玛亚洲综合影院| 一二三四社区在线视频社区8| 久久久久免费精品人妻一区二区| 午夜福利在线观看吧| ponron亚洲| 婷婷丁香在线五月| 十八禁网站免费在线| 成人永久免费在线观看视频| 18美女黄网站色大片免费观看| 日韩免费av在线播放| 婷婷丁香在线五月| 一二三四社区在线视频社区8| 国产午夜精品论理片| 在线观看午夜福利视频| 波多野结衣高清无吗| 国产成人啪精品午夜网站| 99在线人妻在线中文字幕| 内射极品少妇av片p| 欧美成人一区二区免费高清观看| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲男人的天堂狠狠| 少妇的逼好多水| 国产探花极品一区二区| 亚洲成av人片免费观看| 欧美av亚洲av综合av国产av| 亚洲在线自拍视频| 偷拍熟女少妇极品色| 欧美日韩综合久久久久久 | 嫩草影院精品99| 亚洲专区国产一区二区| 国产中年淑女户外野战色| 国产不卡一卡二| 99精品在免费线老司机午夜| 51午夜福利影视在线观看| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 免费大片18禁| 在线a可以看的网站| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 午夜a级毛片| 丁香六月欧美| 99国产精品一区二区蜜桃av| ponron亚洲| 国产精品久久电影中文字幕| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 免费无遮挡裸体视频| av女优亚洲男人天堂| 亚洲国产精品999在线| 久久久精品大字幕| 国产高清有码在线观看视频| 国产高清视频在线播放一区| 99热这里只有精品一区| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| h日本视频在线播放| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 草草在线视频免费看| av专区在线播放| 日本成人三级电影网站| 国产日本99.免费观看| 色吧在线观看| 91九色精品人成在线观看| 嫁个100分男人电影在线观看| 2021天堂中文幕一二区在线观| 久久久久精品国产欧美久久久| 中文字幕熟女人妻在线| 全区人妻精品视频| 日本黄色片子视频| 波多野结衣高清作品| 国产精品国产高清国产av| 日韩有码中文字幕| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国产在视频线在精品| 波多野结衣高清作品| 两个人视频免费观看高清| 国产亚洲精品一区二区www| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 欧美+日韩+精品| 色播亚洲综合网| 亚洲av五月六月丁香网| 俺也久久电影网| 此物有八面人人有两片| 老司机福利观看| 在线观看一区二区三区| 一本精品99久久精品77| 国产精品一区二区三区四区久久| 怎么达到女性高潮| 综合色av麻豆| 欧美+日韩+精品| 男女视频在线观看网站免费| 亚洲成人免费电影在线观看| 99精品久久久久人妻精品| 精品人妻1区二区| 色av中文字幕| 美女黄网站色视频| av专区在线播放| 观看美女的网站| 黄色成人免费大全| 精品一区二区三区视频在线 | 99国产精品一区二区蜜桃av| 99视频精品全部免费 在线| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 最近最新免费中文字幕在线| 国产精品综合久久久久久久免费| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 床上黄色一级片| 在线观看66精品国产| 欧美色欧美亚洲另类二区| 国产精品一区二区三区四区久久| 白带黄色成豆腐渣| e午夜精品久久久久久久| 长腿黑丝高跟| 亚洲专区国产一区二区| 国产精品亚洲av一区麻豆| 有码 亚洲区| 女同久久另类99精品国产91| 中出人妻视频一区二区| 久久久久久大精品| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 免费看日本二区| 亚洲内射少妇av| 免费无遮挡裸体视频| e午夜精品久久久久久久| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 日日夜夜操网爽| 亚洲av一区综合|