低場核磁共振法測定豬肉中脂肪含量

湯舒越，湯曉艷,，張宇慧，劉素可，黃欣媛，段勝男

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，肉品加工與質(zhì)量控制教育部重點實驗室，江蘇 南京 210095；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，北京 100081）

脂肪是畜禽肉中重要營養(yǎng)指標(biāo)之一，脂肪含量的多少不僅反映了畜禽肉營養(yǎng)品質(zhì)狀態(tài)，還關(guān)系到肌肉的嫩度、多汁性以及風(fēng)味等食用品質(zhì)，此外脂肪的氧化問題還影響貯藏期間畜禽肉品質(zhì)劣變程度，從而影響產(chǎn)品貨架期。目前脂肪含量的檢測主要采用GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》中的索氏抽提法，該方法耗時長，操作繁瑣，尤其是檢測中使用乙醚或石油醚等有機試劑，會對人體和環(huán)境造成極大危害和污染。因此，探索高效率、低污染的新型脂肪含量測定方法成為重要課題。目前國內(nèi)外有不少研究人員探索用近紅外光譜技術(shù)、超聲波技術(shù)、計算機視覺技術(shù)等檢測畜禽肉中脂肪含量，其中近紅外技術(shù)在肉品快速無損檢測方面的操作規(guī)范還制定了相關(guān)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，但上述方法均基于模型建立的思路，需要收集至少100 個具有代表性的樣品，其中同一品種的樣品要包含不同性別、不同月齡、不同部位，使脂肪含量范圍能夠覆蓋未來分析的樣品特性，由此創(chuàng)建脂肪含量的預(yù)測模型，不能直接準(zhǔn)確定量。

低場核磁共振（low-field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）技術(shù)是在恒定磁場強度為0.5 T以下，研究具有固定磁矩的氫原子核與交變磁場發(fā)生能量交換的現(xiàn)象，即弛豫過程。根據(jù)物體內(nèi)部原子核的弛豫特性，實現(xiàn)物質(zhì)組分的定量和鑒別分析，利用這一原理可以檢測糧油種子含油含水率、牛奶摻假、肉類注水注膠鑒別等多個方面。其中，在油脂含量測定方面，有研究發(fā)現(xiàn)，食用油的弛豫峰頂點時間在100 ms左右，但在同一弛豫時間段內(nèi)，除油脂信號外還存在水分信號。Miklos等研究發(fā)現(xiàn)，香腸在弛豫時間為60～160 ms時出現(xiàn)的峰包含了脂肪和水分共同的信號。因此，消除水分對脂肪信號的影響是準(zhǔn)確定量脂肪含量的關(guān)鍵因素。有學(xué)者采用化學(xué)計量學(xué)方法，通過水油共同信號直接建立預(yù)測模型實現(xiàn)對脂肪含量的測定，但化學(xué)計量統(tǒng)計需要一定的樣本量，方法具有局限性。S?rland等也利用梯度場抑制水分信號對脂肪含量進行測定，但該方法對設(shè)備要求高，極大地增加了檢測成本。

本實驗針對生豬育種養(yǎng)殖以及豬肉營養(yǎng)評價中脂肪含量測定的迫切需求，擬利用烘干方法去除水分，分離低場核磁脂肪信號和水分信號，優(yōu)化樣品質(zhì)量、烘干時間、回波時間等技術(shù)參數(shù)，建立LF-NMR技術(shù)檢測豬肉中脂肪含量的方法，以期改進國標(biāo)索氏抽提法有機試劑污染危害、抽提耗時長等問題，提供一種綠色環(huán)保的畜禽肉中脂肪含量測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬背最長肌、豬油購于北京超市發(fā)賣場。將豬背最長肌剔除肉眼可見筋膜，絞成肉糜，置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

NMI20-040V-I型核磁共振成像分析儀（氫譜，共振頻率20 MHz，探頭線圈直徑25 mm） 蘇州紐邁分析儀器股份有限公司；Soxtec2050索氏提取儀 丹麥福斯集團公司；OLB-DH100-2型干式恒溫器 山東歐萊博儀器有限公司；GZX-9023 MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱烘箱上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；AL104型電子天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基準(zhǔn)脂肪含量的測定

參照GB 5009.6—2016，用索氏抽提法測定豬肉樣品中脂肪含量，作為基準(zhǔn)脂肪含量。

1.2.2 低場核磁信號采集

首先在FID序列下通過儀器自檢進行校準(zhǔn)，再用CPMG序列采集樣品的橫向弛豫時間（），經(jīng)SIRT多組分反演后得到譜圖。

CPMG序列檢測參數(shù)設(shè)置為：接收機帶寬200 kHz，等待時間2 000 ms，模擬增益20，數(shù)字增益3，前置放大增益2，回波個數(shù)4 000～9 000。

1.2.3 信號采集參數(shù)優(yōu)化

1.2.3.1 回波時間

經(jīng)射頻脈沖作用后，從橫向磁化強度最初產(chǎn)生到接收信號間的時間間隔被稱為回波時間。一般要求半回波時間大于6 倍90°脈沖寬度設(shè)定值。本研究分別設(shè)置回波時間為0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 ms，以末尾10 個信號幅值的平均值為最終衰減信號幅值，比較不同回波時間下的衰減程度及弛豫信息。

1.2.3.2 重復(fù)掃描次數(shù)

重復(fù)掃描次數(shù)為儀器進行自動重復(fù)采樣的次數(shù)，重復(fù)掃描次數(shù)會影響樣品的信號強度和采樣時間，因此需要根據(jù)樣品的實際信號強弱進行優(yōu)化選擇。本研究設(shè)置儀器重復(fù)掃描次數(shù)為8、16、32、64、128 次，分別比較分析譜圖的弛豫特性及信噪比（）。

1.2.4 樣品參數(shù)優(yōu)化

1.2.4.1 樣品質(zhì)量

分別稱取豬肉糜1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g（精確至0.001 g），105 ℃烘干6 h，恒溫50 ℃后采集低場核磁信號，設(shè)置回波時間為0.3 ms，重復(fù)掃描次數(shù)64 次，分析不同樣品質(zhì)量對弛豫特性的影響。

1.2.4.2 烘干時間

取4.0 g（精確至0.001 g）肉糜在105 ℃烘干不同時間（0、2、4、6、8、9、10、11、12 h），恒溫至50 ℃后，采集低場核磁信號，分析烘干時間對樣品脂肪信號的影響。

1.2.4.3 樣品檢測溫度

取4.0 g（精確至0.001 g）肉糜在105 ℃烘干6 h，將烘干后樣品溫度分別恒溫至32、40、50、60、70 ℃，采集樣品低場核磁信號，考察樣品溫度對弛豫特性的影響。

1.2.5 方法驗證

1.2.5.1 重復(fù)性

取3 塊豬背最長肌，每個樣品取6 個平行，根據(jù)優(yōu)化后檢測條件進行測定，計算低場核磁脂肪信號峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.2.5.2 精密度

分別在同一天內(nèi)不同時間段及不同天內(nèi)對同一樣品進行測定（=6），計算樣品脂肪信號峰面積的RSD，考察其日內(nèi)精密度及日間精密度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 信號采集參數(shù)優(yōu)化

儀器檢測參數(shù)主要由2 部分組成，即系統(tǒng)參數(shù)和信號采集參數(shù)。其中系統(tǒng)參數(shù)包括儀器特性和環(huán)境因素，檢測初始利用FID序列對儀器系統(tǒng)參數(shù)進行自動校準(zhǔn)，包括中心頻率、90°脈沖和180°脈沖。信號采集參數(shù)包括重復(fù)掃描次數(shù)、等待時間、回波時間及回波個數(shù)。其中等待時間無顯著影響，回波個數(shù)根據(jù)實際樣品保證信號量完全衰減即可，因此主要對回波時間及重復(fù)掃描次數(shù)進行優(yōu)化。

2.1.1 回波時間

回波時間的變化會影響CPMG回波曲線的衰減程度和弛豫區(qū)間。一般來講，為減小分子擴散作用的影響，回波時間應(yīng)盡量短，但對于干燥樣品，回波時間的變化主要影響分布的短弛豫組分。圖1A中和分別為肉中強結(jié)合水、部分烘干未去除的弱結(jié)合水，峰為脂肪峰。峰隨著回波時間的延長逐漸減小且向右移動，峰占比較小，隨回波時間延長逐漸消失。這是因為回波時間的改變會影響分子自擴散以及分子交換對弛豫特性的影響，回波時間越長，分子自擴散作用越強，從而導(dǎo)致橫向弛豫時間的延長。油脂的自擴散作用比水分弱，因此在0.35 ms內(nèi)，回波時間的變化并不會對脂肪弛豫時間和峰面積產(chǎn)生顯著影響。如圖1B所示，隨著回波時間的延長，弛豫區(qū)間逐漸增大，同時衰減曲線的最終信號幅值減小，王志永等的研究也證實了這一點。本研究中回波時間為0.1 ms時，樣品的信號幅值衰減至177.76，回波時間為0.35 ms時，樣品的信號幅值衰減至57.44。回波時間為0.3 ms之后最終信號衰減幅值不再發(fā)生顯著變化，并且峰面積穩(wěn)定性較好，RSD為1.14%，因此選擇回波時間為0.3 ms。

圖1 回波時間對T2（A）和CPMG回波衰減曲線（B）的影響Fig.1 Effect of echo time on T2 (A) and CPMG echo decay curves (B)

2.1.2 重復(fù)掃描次數(shù)

重復(fù)掃描次數(shù)對樣品的有直接的影響，重復(fù)掃描次數(shù)越多，越高。如圖2A所示，弛豫時間在20 ms后開始出現(xiàn)脂肪峰，重復(fù)掃描次數(shù)與脂肪峰面積之間存在良好的線性關(guān)系（=153.42+0.469 4），為1.000。隨重復(fù)掃描次數(shù)增加，由最初的49.91增加至180.97（圖2B）。本研究中，雖然重復(fù)掃描128 次會顯著提高，但掃描次數(shù)過多會導(dǎo)致磁體發(fā)熱，引起樣品溫度升高，從而改變弛豫特性，并且花費更長的檢測時間。因此，本研究選擇重復(fù)掃描次數(shù)64 次，此時穩(wěn)定的弛豫特性能夠滿足測定樣品的需求，脂肪峰面積RSD僅為0.28%。

圖2 重復(fù)掃描次數(shù)對T2（A）和RSN（B）的影響Fig.2 Effect of number of scanning cycles on T2 (A) and signal-to-noise ratio (RSN) (B)

2.2 樣品參數(shù)的優(yōu)化

2.2.1 樣品質(zhì)量

不同質(zhì)量樣品對脂肪弛豫特性有顯著影響，結(jié)果見表1，其中為脂肪峰面積，是樣品中脂肪的弛豫時間。隨樣品質(zhì)量的增大呈線性增加，相關(guān)系數(shù)可達0.999 2。隨著樣品質(zhì)量增加也會發(fā)生后移，并且樣品質(zhì)量越大，的穩(wěn)定性越好（RSD越?。?。當(dāng)樣品質(zhì)量為4.055～5.017 g時，各項弛豫特性均呈現(xiàn)較好的穩(wěn)定性，同時也顯著高于低質(zhì)量樣品，此結(jié)果與Keeton等研究結(jié)論一致，因此，本研究脂肪含量測定選擇豬肉樣品質(zhì)量為4 g。

表1 樣品質(zhì)量對RSN及脂肪弛豫特性的影響Table 1 Effect of sample mass on RSN and relaxation characteristics of fat

2.2.2 烘干時間

為消除水分信號的干擾，本研究對豬肉樣品進行烘干處理。烘干時間長短直接影響脂肪測定時間效率，同時烘干時間也顯著影響樣品弛豫特性。從圖3可以看出，鮮肉樣品（烘干0 h）中存在3 個弛豫峰，其中為結(jié)合水，為不易流動水和脂肪，為自由水。烘干2 h后，由開始的3 個弛豫峰減少為2 個，這可能是因為溫度升高使肌原纖維蛋白變性，破壞了水與蛋白質(zhì)間的氫鍵及蛋白凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，結(jié)合水的流動性變強，而具有較高自由度的不易流動水從凝膠體系中脫離出來形成自由水，導(dǎo)致水分蒸發(fā)，即自由水消失，此時的2 個峰分別表示未烘干的水分（′）和脂肪（′）。姜秀麗等研究也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)烘干一定時間后，不易流動水峰面積顯著降低，同時分裂出一個與水分變化關(guān)系并不明顯的峰，即為脂肪峰。當(dāng)樣品烘干4 h后脂肪峰（′）面積不再發(fā)生顯著變化。繼續(xù)烘干到6 h，′峰面積占比達52.18%，此時峰面積穩(wěn)定性良好，RSD為3.07%。隨著烘干時間繼續(xù)延長，′峰又向左移動且峰面積逐漸減小，樣品中的弱結(jié)合水不斷減少，但脂肪峰（′）基本不變，弛豫區(qū)間在31.178～691.588 ms內(nèi)。為了保證樣品中脂肪和水分的充分分離，獲得穩(wěn)定的脂肪峰面積，本研究選擇烘干6 h。

圖3 烘干時間對T2譜圖的影響Fig.3 Effect of drying time on T2 relaxation spectra

2.2.3 樣品檢測溫度

從圖4可以看出，隨著溫度的升高，脂肪弛豫時間逐漸后移，峰面積呈先上升后下降的趨勢，在40 ℃時峰面積顯著高于其他溫度。脂肪弛豫時間延后主要是由于溫度的升高使樣品內(nèi)部油脂的熱運動性加強導(dǎo)致，脂肪峰面積先上升后下降主要是樣品溫度對分子結(jié)構(gòu)和相態(tài)產(chǎn)生影響。陳芳宇等在巧克力熔化過程弛豫特性變化研究中也發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的升高，液體油脂峰逐漸后移，且峰面積逐漸增大，達到一定溫度后開始下降。由于豬脂肪熔點為27.5～48.4 ℃，為保證樣品油脂內(nèi)部狀態(tài)一致，樣品檢測溫度確定為50 ℃。

圖4 樣品檢測溫度對弛豫特性的影響Fig.4 Effect of detection temperature on relaxation characteristics

2.3 方法驗證

在上述研究獲得的檢測參數(shù)下，即樣品質(zhì)量4 g、烘干時間6 h、樣品檢測溫度50 ℃、回波時間0.3 ms、重復(fù)掃描次數(shù)64 次，對方法的重復(fù)性和精密度進行驗證。

2.3.1 重復(fù)性

針對不同脂肪含量的豬肉進行低場核磁信號采集，其脂肪峰基本重合（圖5），并且能夠獲得穩(wěn)定的脂肪峰面積（，表2），多次檢測結(jié)果的RSD分別為2.72%、2.44%、1.69%，說明在該檢測條件下能夠保證檢測結(jié)果的良好重復(fù)性。

表2 樣品脂肪峰面積的重復(fù)性Table 2 Repeatability RSD of peak area (Afat)

圖5 重復(fù)性驗證樣品的弛豫譜圖Fig.5 Relaxation spectra showing good repeatability of the LF-NMR method

2.3.2 精密度

如表3、4所示，日內(nèi)精密度分別在一天中的早、中、晚進行驗證，日間精密度分別在第1、3、5天進行實驗，脂肪峰面積的日內(nèi)、日間精密度RSD分別為3.07%和2.57%，說明該方法具有良好的精密度。

表3 樣品脂肪峰面積的日內(nèi)精密度Table 3 Intra-day precision of Afat

表4 樣品脂肪峰面積的日間精密度Table 4 Inter-day precision of Afat

2.4 豬肉中脂肪含量測定

不同物種油脂中氫質(zhì)子密度不同，因此不同物種油脂含量測定時，應(yīng)采用相應(yīng)物種純油脂標(biāo)準(zhǔn)樣品。Li Yuntong等在對燕麥中脂肪含量定量時也以燕麥中提取的脂肪作為標(biāo)準(zhǔn)樣品。本方法中脂肪含量測定用純豬油作為標(biāo)準(zhǔn)樣品。如圖6所示，弛豫時間1 ms出現(xiàn)的峰，可能是由大分子結(jié)構(gòu)和與其緊密結(jié)合的質(zhì)子產(chǎn)生，長弛豫的脂肪峰（）隨著豬油質(zhì)量的增加而不斷增大。以豬油質(zhì)量為自變量，脂肪峰面積為因變量，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為=66 292-70.693（=0.999 9），結(jié)果顯示，在0.011 1～0.977 2 g的范圍內(nèi)，豬油質(zhì)量與脂肪峰面積具有很好的線性關(guān)系。

圖6 不同質(zhì)量豬油T2弛豫譜圖Fig.6 T2 relaxation spectra for different masses of lard

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測豬肉樣品中脂肪質(zhì)量，從而計算出脂肪含量。如表5所示，低場核磁法測得的脂肪含量結(jié)果具有更好的重復(fù)性。S?rland等研究發(fā)現(xiàn)，索氏抽提法和梯度場低場核磁法測定脂肪含量結(jié)果相關(guān)性為0.975，本研究中索氏抽提法和低場核磁法測得的結(jié)果也顯著相關(guān)（＜0.05），達到0.999 5（=0.962 1+0.416 6），絕對誤差在0.15%～0.39%內(nèi)。本研究結(jié)果表明，低場核磁法能夠?qū)崿F(xiàn)豬肉中脂肪含量的準(zhǔn)確測定。

表5 低場核磁法和索氏抽提法檢測脂肪含量Table 5 Measured fat contents in pork by LF-NMR and Soxhlet extraction method

3 結(jié)論

使用烘干法分離豬肉中水分和脂肪的低場核磁信號，并對回波時間、重復(fù)掃描次數(shù)等信號采集參數(shù)，樣品質(zhì)量、烘干時間、檢測溫度等樣品參數(shù)進行優(yōu)化，確定基于LF-NMR技術(shù)的豬肉中脂肪含量測定方法，并對方法的重復(fù)性及精密度進行考察。結(jié)果表明，4 g肉糜烘干6 h后，在檢測溫度50 ℃、回波時間0.3 ms、重復(fù)掃描次數(shù)64 次的條件下，以純豬油為標(biāo)準(zhǔn)樣品，能夠?qū)崿F(xiàn)豬肉中脂肪含量的準(zhǔn)確定量。該方法綠色、安全，并顯著提高檢測效率，在畜禽肉脂肪含量快速準(zhǔn)確定量方面具有廣闊的應(yīng)用前景。