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    糙米和大米非靶向代謝組學分析

    2022-10-31 08:56:28任傳英盧淑雯張英蕾管立軍黃文功盧衛(wèi)紅
    食品科學 2022年20期
    關鍵詞:糙米黃酮類代謝物

    任傳英,盧淑雯,洪 濱,張英蕾,管立軍,3,李 波,3,黃文功,盧衛(wèi)紅

    (1.哈爾濱工業(yè)大學化工與化學學院,黑龍江 哈爾濱 150001;2.黑龍江省農業(yè)科學院食品加工研究所,黑龍江 哈爾濱 150086;3.黑龍江省食品加工重點實驗室,黑龍江 哈爾濱 150086;4.黑龍江省農業(yè)科學院農產品質量安全研究所,黑龍江 哈爾濱 150086)

    水稻是世界上消費量最大的谷物之一,在100多個國家種植,大米是世界一半以上人口的主食,也是中國65%以上人口的口糧。糙米由皮層(6%~7%)、胚(2%~3%)和胚乳(約90%)組成,被稱為全谷物。糙米不僅富含基本營養(yǎng)成分,還含有更多的微量元素和生物活性成分,如VB、VE、膳食纖維、酚類化合物、-氨基丁酸、谷維素、低聚糖和植酸。大米是糙米經多道碾磨、拋光、色選,去除全部皮層和胚,僅保留胚乳的產品,因此,糙米在營養(yǎng)上優(yōu)于大米。

    目前,對糙米和大米的研究主要集中在一些已知的營養(yǎng)素和生物活性成分分析,而對于許多未知的營養(yǎng)素和活性成分鮮有報道。代謝組學主要是不同代謝路徑產生的底物和產物的小分子代謝物分析(分子質量<1 000 Da),不僅可以全面分析代謝產物含量的變化,還可以闡明不同代謝產物與各處理條件間的變化規(guī)律,從而評價不同物質的生物反應及效果。已經在植物代謝組學、微生物代謝組學等領域應用,用于鑒定綠茶的品質和種子萌發(fā)過程中代謝物的變化。Pongsuwan等采用高效液相色譜法與質譜法相結合進行不同綠茶的代謝組分析,綠茶中除了檢測到表沒食子兒茶素外,還檢測到未知的表沒食子兒茶素沒食子酸酯和表兒茶素沒食子酸酯,也具有顯著差異。本研究利用液相色譜-串聯(lián)質譜非靶向代謝組學技術研究糙米與大米中的所有代謝產物,采用主成分分析(principal component analysis,PCA)、聚類分析和通路分析等多元統(tǒng)計分析方法,解析糙米和大米間的代謝物種類和數(shù)量的變化規(guī)律,并探明代謝產物變化參與的關鍵代謝途徑,旨在為糙米的貯藏技術和功能性評價提供新的依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    糙米:綏粳18水稻種植于黑龍江省五常市衛(wèi)國鄉(xiāng),2021年9月末收獲脫粒成稻谷,貯存至10月初經礱谷制得糙米,出糙率為81.7%,稱取約5 g整粒糙米于10 mL離心管中密封,平行取樣3 次,液氮冷凍后貯存于-80 ℃冰箱中,待測。

    大米:稱取500 g上述糙米采用實驗型碾米機碾磨成大米(與糙米制備同一天),整精米率為69.4%。稱取5 g整粒大米于10 mL離心管中密封,平行取樣3 次,液氮冷凍后貯存于-80 ℃冰箱中,待測。

    乙腈、甲酸和甲醇均為色譜純。

    1.2 儀器與設備

    Yamamoto Vp-32實驗型碾米機 日本佐竹公司;2777C UPLC system液相色譜儀、Xevo G2-XS QTOF質譜儀 美國沃特世公司。

    1.3 方法

    1.3.1 代謝物提取

    將-80 ℃保存的測試樣品取出,立即從每管中各選取1 粒米(單粒質量21~23 mg),具體提取過程按照每粒米的實際質量(精確到0.000 1 g)折算成下述25 mg體系等比例添加試劑進行代謝物的提取,具體操作如下:25 mg測試樣品倒入1.5 mL EP管中,加入800 μL預冷沉淀劑(甲醇-乙腈-純水,2∶2∶1,/),放入小鋼珠2 顆,轉入研磨機中研磨(60 Hz,4 min),小鋼珠取出后再將樣本冰浴超聲(80 Hz,10 min),放入-20 ℃冰箱,靜置120 min后離心(4 ℃,25 000×,15 min),取出上清液600 μL,將上清液轉入凍干機中凍干,加入10%甲醇溶液600 μL復溶,80 Hz冰浴超聲10 min,然后25 000×、4 ℃離心15 min,取出上清液,6 個樣本各取出50 μL,然后混合成一個樣本(質控樣本,quality control,QC)。

    1.3.2 液相色譜條件

    ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm);柱溫50 ℃,流速0.4 mL/min,流動相A為0.1%甲酸溶液,流動相B為0.1%甲酸-甲醇溶液。梯度洗脫程序:0~2 min,100% A,0% B;2~11 min,100%~0% A,0%~100% B;11~13 min,0% A,100% B;13~15 min,0%~100% A,100%~0% B。每個測試樣本的上樣體積均為5 μL。

    1.3.3 串聯(lián)質譜條件

    利用Xevo G2-XS QTOF高分辨串聯(lián)質譜對從液相色譜柱洗脫下來的小分子,分別進行正、負離子2 種模式采集。正離子采集模式下,錐孔電壓和毛細管電壓分別為40.0 V和3.0 kV。負離子采集模式下,錐孔電壓和毛細管電壓分別為40.0 V和2.0 kV。采用全信息串聯(lián)質譜模式進行質心數(shù)據(jù)采集,一級掃描是在50~1 200 Da范圍內掃描0.2 s,然后使用20~40 eV的能量對所有母離子進行碎裂,再進行二級掃描0.2 s采集所有的碎片信息。在采集數(shù)據(jù)的過程中,需要對LE信號每間隔3 s進行實時質量校正一次,并且,在測試樣本前采集一次QC樣本,用于評價樣本在整個采集過程中儀器的穩(wěn)定性狀態(tài)。

    1.3.4 峰提取及鑒定

    主要通過軟件Progenesis QI(version 2.2)實現(xiàn),包括峰對齊、峰提取、歸一化、譜圖解析和化合物鑒定等步驟。峰提取和鑒定的主要參數(shù)設置如表1所示。

    表1 Progenesis QI主要參數(shù)Table 1 Major parameters of Progenesis QI

    1.3.5 差異代謝物的鑒定

    采用自主研發(fā)的代謝組學metaX軟件包和Progenesis QI(version 2.2)軟件對質譜分離數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析,其中代謝物的鑒定來源于KEGG、HMDB和LipidMaps數(shù)據(jù)庫。差異表達代謝物的篩選采用多變量偏最小二乘判別分析(partial least square-discriminant analysis,PLS-DA)模型前2 個PC的變量投影重要性(variable importance in projection,VIP)值,再結合值和單變量分析差異倍數(shù)篩選。篩選條件為:1)VIP≥1;2)<0.053);3)差異倍數(shù)≤0.833 3或差異倍數(shù)≥1.2,3 個條件取交集,最后得到共有的代謝物即差異代謝物。最后結果以火山圖形式呈現(xiàn)VIP值、值和差異倍數(shù)三項指標。

    1.3.6 代謝物的分類和功能注釋

    HMDB(www.hmdb.ca)是一個可聯(lián)網的代謝組學數(shù)據(jù)庫,包含有關人類代謝物、生理濃度、疾病關聯(lián)、化學反應、代謝途徑、參考光譜及其生物學作用的綜合信息,具有代謝途徑和圖譜搜索功能。KEGG是從分子水平信息了解生物系統(tǒng)(如細胞,生物和生態(tài)系統(tǒng))的高層次功能的數(shù)據(jù)庫,尤其是通過基因組測序和其他高通量實驗技術而產生的大規(guī)模的數(shù)據(jù)庫資源。其中KEGG Pathway數(shù)據(jù)庫是對生命活動中的分子相互作用和化學物質反應的認識,構建了復雜的調控網絡,通過強大的通路圖形式展示關聯(lián)的代謝途徑及各途徑之間的相關性,并進行功能注釋,明確特定代謝物參與的主要生化代謝途徑和信號轉導途徑。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    首先對質譜分離鑒定的原始數(shù)據(jù)提取峰列表信息,進行數(shù)據(jù)預處理和校正,然后按照1.3.5節(jié)進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,找出樣品間差異表達的代謝物,最后,參考KEGG、HMDB和LipidMaps數(shù)據(jù)庫對代謝物及差異代謝物進行鑒定,并通過KEGG Pathway數(shù)據(jù)庫進行Pathway分析,確定差異代謝物參與的主要代謝途徑。

    統(tǒng)計分析:包括單變量分析和多變量分析。其中單變量分析包括非參數(shù)檢驗或參數(shù)檢驗、倍數(shù)分析。多變量分析包括PCA、聚類分析和PLS-DA。

    2 結果與分析

    2.1 質控分析

    代謝組學研究中,QC分析是評價質譜技術可靠性和高質量的重要方法。在樣本檢測前首先進行QC樣本分析測試,用以平衡、穩(wěn)定“色譜-質譜”系統(tǒng),連續(xù)掃描得到的圖譜為總離子流圖(圖1)。QC樣本為同一個樣本,重疊程度越高、峰分離度越高,可以判定本研究的質譜分析儀器狀態(tài)良好且穩(wěn)定。

    圖1 QC樣本總離子流重疊圖Fig.1 Overlapping total ion current (TIC) chromatograms of quality control (QC) samples

    2.2 差異代謝物數(shù)量和類別鑒定結果

    差異代謝物的定性和相對定量基于數(shù)據(jù)庫KEGG、HMDB、LipidMaps分析得出。從數(shù)量上看,糙米與大米相比,正離子模式下,分析出差異代謝物460 個,其中上調300 個、下調160 個。負離子模式下分析出差異代謝物579 個,其中上調383 個、下調196 個(表2)。2 種模式下,上調差異代謝物均多于下調差異代謝物。從類別上看,糙米與大米相比,正離子模式下,差異代謝物中上調的主要是黃酮類、脂肪酸類、羧酸類、有機氧化物、苯類;差異代謝物中下調的主要是黃酮類、脂肪酸類、羧酸類、甘油磷酸和異二戊烯類,黃酮類、脂肪酸類和羧酸類為上調和下調共有類別。負離子模式下,差異代謝物中上調的主要是黃酮類、有機氧化物、脂肪酸類、羧酸類和肉桂酸類,差異代謝物中下調的主要是黃酮類、有機氧化物、脂肪酸類、羧酸類和甘油磷脂(圖2)。2 種離子模式下分析的差異代謝物數(shù)量極多,其中多數(shù)僅有變化趨勢,但是差異不顯著,見圖3??傮w上看,糙米與大米相比,差異代謝物中黃酮類最多。黃酮類物質具有抗病毒、抗自由基、抗氧化、降低脂質過氧化反應、抗炎、抗衰老、防癌和預防心血管疾病等作用。Kris-Etherton等研究發(fā)現(xiàn)酚類化合物包括亞類黃酮類化合物,廣泛存在于在谷物、豆類和堅果中。Yang Zhigang等已經證明,黃酮類物質如麥黃酮、7--蕓香苷和7----吡喃葡萄糖苷主要存在于子葉和麩皮中,但不存在于碾磨的谷物中。多酚類物質也是糙米中重要的植物類營養(yǎng)素,糙米中游離酚和結合酚含量均顯著高于白米,游離酚平均含量為101.64 mg/100 g,粳型糙米平均含量略高于秈型糙米。糙米在胃部和小腸消化階段還會顯著促進酚類物質釋放,消化液中的單體酚酸主要為阿魏酸和原兒茶酸。本研究發(fā)現(xiàn),鑒定到的黃酮類物質中部分由脂肪酸降解得到,如表兒茶素-吡喃葡萄糖苷-苯甲酸酯、芥子油基酯、8-丙炔二吡喃酮、兒茶素-4-醇和甘丙烯醇。這是由于糙米中脂質含量雖然只有1%左右,但易分解,在糙米儲藏過程中,脂質在酯酶的作用下分解產生游離脂肪酸,脂肪酸不穩(wěn)定,可進一步降解產生酚類、酮類物質。

    表2 糙米與大米差異代謝物鑒定Table 2 Differential metabolites between brown rice and while rice

    圖2 主要差異代謝物的類別Fig.2 Classification of major differential metabolites

    圖3 差異代謝物火山圖Fig.3 Volcano map of differential metabolites

    2.3 差異代謝物的PCA

    PCA可反映樣本中代謝物豐度情況,樣本之間位置越近則越相似,越遠則反之。對糙米與大米差異代謝物進行PCA,見圖4。2 組樣品的置信區(qū)間均在95%以內,糙米與大米樣品的PC明顯不同,分別位于置信區(qū)間的左右兩側。從分布模式看,負離子模式下糙米樣本之間的距離更近,說明3 個平行樣品中的差異代謝物鑒定情況十分接近。正離子模式下,每組3 個平行樣品中的差異代謝物均有一定的離散性,說明組內樣品間也存在一定的個體差異。這可能是由于測試樣品組內的3 個米粒成熟度和粒位不同,導致鑒定到的差異代謝物有所差異。研究表明,成熟度和粒位對大麥品質、營養(yǎng)性和耐儲性均有影響。貴州主栽水稻品種不同成熟期大米品質變化,發(fā)現(xiàn)在乳熟、蠟熟、成熟、完熟4 個時期中,各質量指標在中后期較高,而在后期有所下降。

    圖4 PCA散點圖Fig.4 PCA score scatter plots

    2.4 差異代謝物的分類和功能注釋

    糙米與大米全部差異代謝物(正離子模式460 種和負離子模式579 種)聚類分析熱圖見圖5。不同顏色表示不同含量,紅色表示含量上調,綠色表示含量下調,從綠色到紅色表示該物質表達量由低到高。通過對鑒定的代謝物進行聚類分析后,已鑒定的代謝物主要分為3 類,包括生物活性物質、脂質和植物化學物,其中具有生物活性的化合物居多,正離子模式下生物活性的化合物主要是氨基酸/肽、苯類和有機酸類,如-精氨酸、瓜氨酸、3-甲基組氨酸、-乙酰高絲氨酸、5-羥基--色氨酸、三甲基--組氨酸、5-羥基--色氨酸、谷氨酰--半胱氨酸、4-氟苯甲酸、苯丙酮酸、吲哚、賽洛辛、4-羥基苯甲醛和-乙酰神經氨酸9-磷酸等。相關研究發(fā)現(xiàn),糙米與大米中的蛋白質含量雖然差異不顯著,但是氨基酸總量和必需氨基酸總量差異顯著,其中以組氨酸、苯丙氨酸和纈氨酸為主。脂質類主要是脂肪酸、脂肪酰、脂肪醇、脂肪酯、脂肪酰胺和脂肪醛。植物化學物主要是黃酮類、生物堿,如鼠李糖苷、染料木黃酮、甘黃酮A、2-脫羧基甜菜堿、天竺葵素、4,8-二羥基-2-呋喃、頭孢拉定A和苯并呋喃-1,3-二醇。類黃酮是植物酚類化合物的重要組成,Dong Xuekui等采用廣靶代謝組學方法對90多種黃酮類化合物同時鑒定和定量,比較水稻不同發(fā)育階段不同組織中的類黃酮含量,研究表明,黃酮單-C-糖苷、丙二酸化黃酮--己糖苷和一些黃酮--糖苷為主要差異代謝物。Wang Changyuan等采用氣相色譜-質譜法進行不同貯藏期糙米代謝組學分析,發(fā)現(xiàn)糙米貯藏后代謝產物的數(shù)量和類型發(fā)生了顯著變化,由于采用的分析方法和鑒定數(shù)據(jù)庫不同,僅篩選了34 種差異代謝物,儲藏后糙米的碳水化合物、氨基酸和脂肪酸含量降低,而糖醇、胺和醛類含量增加。

    圖5 差異代謝物聚類分析圖Fig.5 Cluster analysis of differential metabolites

    如圖6所示,正離子模式下,主要代謝是氨基酸代謝、其他次生代謝物的生物合成、輔因子和維生素代謝;負離子模式下,主要代謝是輔因子和維生素代謝、其他次生代謝物的生物合成、碳水化合物代謝、核苷酸代謝和氨基酸代謝(沒有分類信息的鑒定結果不參與統(tǒng)計)。對于差異代謝物顯著富集的Pathway繪制氣泡圖(圖7),參與相應代謝途徑的代謝物鑒定結果見表3、4。正離子模式下,代謝物參與的代謝途徑差異顯著的主要是苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的生物合成和組氨酸代謝,其中參與前者的代謝物是苯基丙酮酸和吲哚,參與后者的代謝物是3-甲基組氨酸和三甲基--組氨酸;負離子模式下,代謝物參與的代謝途徑差異顯著的主要是甜菜堿生物合成、嘌呤代謝、碳代謝、玉米素生物合成和C-支鏈二元酸代謝,其中參與甜菜堿生物合成的代謝物是2-脫羧基甜菜堿、天竺葵II和七葉樹素II,導致糙米具有一定的澀味,參與嘌呤代謝的代謝物是P1,P4-雙(5′-黃糖基)四磷酸,參與碳代謝的代謝物是--葡萄糖-6-磷酸、中康酸和5,10-甲基四氫葉酸,參與玉米素生物合成的代謝物是順式玉米素-7--糖苷和腺嘌呤,參與C-支鏈二元酸代謝的代謝物是中康酸和反式烏頭酸。Zhao Mingchao等采用液相色譜-質譜/質譜法代謝組學分析到黑米中257 種次級差異代謝物,大多數(shù)差異代謝物參與的代謝途徑主要是酪氨酸代謝、核黃素代謝、類黃酮生物合成、花青素生物合成和苯丙烷類化合物生物合成。

    圖6 KEGG功能注釋條形圖Fig.6 Bar graphs of KEGG function annotation

    圖7 代謝途徑富集分析氣泡圖Fig.7 Bubble diagrams of metabolic pathway enrichment analysis

    表3 差異代謝物鑒定結果(正離子)Table 3 Results of identification of differential metabolites in the positive ion mode

    表4 差異代謝物鑒定結果(負離子)Table 4 Results of identification of differential metabolites in the negative ion mode

    3 討論

    近年來,糙米因其具有較高的營養(yǎng)品質而越來越受到人們的關注,全世界都推薦食用糙米。糙米和精米之間的營養(yǎng)素差異已經被許多研究所確定。Vichapong等發(fā)現(xiàn),黑米、紅米、紫米和糙米中酚類化合物、總黃酮和抗氧化活性均高于大米,鑒定的12 種酚類化合物均為游離酚類化合物,其中阿魏酸含量最高。本研究基于液相色譜-串聯(lián)質譜非靶向代謝組學分析糙米與大米中的差異代謝物,PCA表明,在正離子和負離子模型下,大米和糙米是分離的。PCA正確反映了相應樣品中代謝物的積累模式和特異性,該結果表明大米和糙米之間存在代謝組學差異。在這些差異代謝物中,類黃酮最多。負、正離子模式分別為89 個和31 個,除了糖苷類,還鑒定到脂肪酸分解物(如兒茶素-吡喃葡萄糖苷-苯甲酸酯、芥子油基酯、8-丙炔二吡喃酮、兒茶素-4-醇和甘丙烯醇)、與糙米顏色和口感相關的代謝物(胡椒堿、甘草苷、米香苷和姜黃素)。黃酮類化合物是眾所周知的藥用植物活性成分和生物活性食品成分,可以改善內皮功能并可能降低血壓,體外研究表明,多種黃酮類化合物可引起大鼠離體動脈的血管舒張,內皮功能的改善可有助于降低血壓。

    植物使用脂肪酸合成?;|,用于許多不同的細胞、生理和防御作用,包括合成必需的膜、儲存或表面脂質,以及用于信號或防御的各種脂肪酸衍生代謝物的產生,脂肪酸通過與輔酶A或?;d體蛋白的硫酯鍵被激活以進行代謝處理。特定的不飽和脂肪對正常壽命、生理功能和神經發(fā)育有重要作用,相應的下游代謝物是重要的脂質信號分子。脂肪酸在人體細胞膜結構功能、物質儲存和細胞信號傳導中發(fā)揮重要作用,食用不飽和脂肪酸對人體健康有保護作用,一些必需脂肪酸(亞油酸和-亞麻酸)只能從飲食中攝取。因此,類黃酮和脂肪酸的代謝變化可能有助于糙米的營養(yǎng)價值評價。此外,使用KEGG數(shù)據(jù)庫對差異離子進行注釋,正離子模式下代謝途徑為2 條(苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、組氨酸代謝),參與代謝物為4 種;負離子模式下代謝途徑為5 條(甜菜堿生物合成、C-支鏈二元酸代謝、嘌呤代謝、玉米素生物合成和碳代謝),參與代謝物為10 種。結果發(fā)現(xiàn),全谷物糙米與碾磨后的大米相比,差異代謝物上調為主,而且通過影響氨基酸代謝、碳代謝、嘌呤代謝、玉米素代謝和甜菜堿生物合成等代謝途徑,調節(jié)米糠和胚中多種氨基酸、多酚、脂肪酸類物質含量,提升稻米的營養(yǎng)品質。

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