酰肼介導(dǎo)的抗體定向偶聯(lián)策略提高免疫層析試紙條檢測(cè)性能

周夢(mèng)君，周 舒，黃小林，李響敏, ，熊勇華

（1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué)食品學(xué)院，江西 南昌 330031）

膠體金免疫層析試紙條（gold nanoparticles-based immunochromatographic assay，AuNPs-ICA）是最常用的快速檢測(cè)方法之一。膠體金探針的生物活性與AuNPs-ICA的檢測(cè)性能密切相關(guān)。目前，制備膠體金探針的方法有物理吸附法、共價(jià)偶聯(lián)法和蛋白A/G介導(dǎo)的定向偶聯(lián)法。物理吸附法偶聯(lián)效率高、操作簡(jiǎn)單，但是該方法在檢測(cè)一些含復(fù)雜基質(zhì)的樣本時(shí)，因探針的穩(wěn)定性差而不能達(dá)到檢測(cè)要求。采用配基交換方式可使AuNPs表面富含羧基功能團(tuán)，進(jìn)一步可通過(guò)碳二亞胺法介導(dǎo)抗體的共價(jià)偶聯(lián)。與物理吸附法相比，該方法可以有效提高膠體金探針的穩(wěn)定性，從而擴(kuò)展免疫層析試紙條的應(yīng)用場(chǎng)景。然而，碳二亞胺法介導(dǎo)的抗體偶聯(lián)因抗體分子上不同部位的氨基都可能與活化的羧基發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致抗體在AuNPs表面可能出現(xiàn)端對(duì)、正對(duì)、側(cè)對(duì)或平對(duì)的取向，從而導(dǎo)致抗體中Fab片段與抗原結(jié)合的生物活性下降。通過(guò)控制抗體的取向（特異性偶聯(lián)Fc區(qū)域）使抗體Fab片段充分暴露，是提高抗體生物活性的有效手段。之前一些研究表明，蛋白A/G也可以特異性結(jié)合抗體的Fc片段，使得抗體豎立在AuNPs表面，可以最大限度地提高抗體的生物活性。然而，蛋白A/G必須首先通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)的方法固定在AuNPs表面，這增加了膠體金探針合成的操作復(fù)雜度和生產(chǎn)成本。

本研究提出了一種基于酰肼基團(tuán)共價(jià)定向偶聯(lián)抗體的新策略。該策略利用了部分抗體的Fc片段天然含有醛基的特性（或通過(guò)高碘酸鈉氧化抗體Fc片段糖基側(cè)鏈生成醛基），在弱酸條件下，醛基與酰肼基團(tuán)通過(guò)親核加成反應(yīng)形成共價(jià)鍵，從而實(shí)現(xiàn)抗體在AuNPs表面的定向偶聯(lián)。首先，采用種子生長(zhǎng)法制備100 nm的AuNPs，自主合成羧基配體和酰肼配體，通過(guò)配基交換制備了羧基化膠體金（carboxylated gold nanoparticles，cAuNPs）以及酰肼化膠體金（hydrazided gold nanoparticles，hAuNPs）；進(jìn)一步將抗玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）單克隆抗體與cAuNPs及hAuNPs共價(jià)偶聯(lián)，得到兩種膠體金探針；在此基礎(chǔ)上，比較兩種偶聯(lián)方法所需抗體標(biāo)記量以及偶聯(lián)反應(yīng)時(shí)間的差異；同時(shí)以兩種膠體金抗體偶聯(lián)物為探針制備試紙條，比較兩種試紙條檢測(cè)ZEN靈敏度的差異；此外，進(jìn)一步評(píng)價(jià)酰肼介導(dǎo)的定向偶聯(lián)策略對(duì)試紙條檢測(cè)實(shí)際玉米樣本中ZEN的性能影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

檸檬酸三鈉 天津市大茂化學(xué)試劑廠；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺（1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC）、對(duì)苯二酚、氯金酸、三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）、三異丙基硅烷（triisopropyl silane，TIPS）、二異丙基碳二亞胺（diisopropylcarbodiimide，DIC） 美國(guó)Sigma公司；,-二甲基乙酰胺（dimethylacetamide，DMA） 西隴科學(xué)股份有限公司；ZEN標(biāo)準(zhǔn)品、赭曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品、伏馬毒素標(biāo)準(zhǔn)品、橘青霉素標(biāo)準(zhǔn)品、黃曲霉毒素G標(biāo)準(zhǔn)品、黃曲霉毒素B標(biāo)準(zhǔn)品、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)品、黃曲霉毒素B標(biāo)準(zhǔn)品 青島普瑞邦生物工程有限公司；豬血清 江西寶靈科技發(fā)展有限公司；山羊抗鼠IgG抗體 北京中杉生物技術(shù)有限公司；硝酸纖維素膜（NC膜） 德國(guó)Sartorius公司；吸水紙、PVC黏性底板上海捷寧生物技術(shù)有限公司；5-氧代-6,9,12,15,18-五氧雜-30-硫雜-31,31,31-三苯基-三十一碳酸由實(shí)驗(yàn)室自主合成；實(shí)驗(yàn)中所用試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

JEOL Model JEM-2100透射電子顯微鏡 日本日立高新技術(shù)有限公司；U-3900型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)日本株式會(huì)社日立高新技術(shù)科學(xué)事務(wù)所；HGS201可編程切條機(jī)、HGS510劃膜噴金標(biāo)機(jī) 杭州峰航科學(xué)儀器有限公司；膠體金試紙條讀取儀 無(wú)錫中德伯爾生物有限公司；DHP-9082電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；TGL-16K臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；Nano ZSE粒度分析儀英國(guó)馬爾文公司；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）儀、超高效液相色譜（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）儀 安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 100 nm AuNPs的合成

采用檸檬酸還原法制備20 nm的種子金，具體方案如下：取1 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的氯金酸溶液加入裝有99 mL超純水的錐形瓶中，緩慢勻速攪拌條件下加熱至沸騰，迅速加入2.7 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的檸檬酸三鈉溶液，快速攪拌10 min，待溶液顏色變?yōu)榫萍t色并且不再發(fā)生變化時(shí)，停止加熱，在攪拌條件下冷卻至室溫，置于4 ℃保存?zhèn)溆?。采用種子生長(zhǎng)法合成100 nm的AuNPs，具體方案如下：將1.0 mL上述方法合成的20 nm種子金溶液加入至裝有99 mL超純水的錐形瓶中，然后快速加入2.4 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的氯金酸溶液，待攪拌均勻后，每隔10 min加入400 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的檸檬酸三鈉溶液和200 μL對(duì)苯二酚溶液（30 mol/L），重復(fù)8 次。繼續(xù)反應(yīng)1 h后，將所合成的膠體金溶液離心、棄上清液、沉淀復(fù)溶于10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%的檸檬酸三鈉溶液中，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 配體的制備

1.3.2.1 羧基配體制備

參照Z(yǔ)hou Yaofeng等的方案并略作修改，羧基配體的制備方案如圖1所示：將300 mg 5-氧代-6,9,12,15,18-五氧雜-30-硫雜-31,31,31-三苯基-三十一碳酸溶于3 mL二氯甲烷中，加入2 mL TFA，瓶?jī)?nèi)溶液立即變成棕紅色，加入1 mL TIPS，溶液顏色變淺，于氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3 h。反應(yīng)結(jié)束后，真空濃縮，黃色殘留油狀液體用正己烷攪洗4 次，每次5 mL，殘余物再通過(guò)真空干燥得到羧基配體。

圖1 羧基配體的合成方案Fig.1 Synthesis of the carboxyl ligand

1.3.2.2 酰肼配體制備

參照Z(yǔ)hou Yaofeng等的方案并進(jìn)行衍生，酰肼配體的制備方案如圖2所示。將700 mg 5-氧代-6,9,12,15,18-五氧雜-30-硫雜-31,31,31-三苯基-三十一碳酸和330 mg己二酸二酰肼溶于25 mL DMA中，加入240 mg DIC，50 ℃攪拌反應(yīng)18 h，反應(yīng)結(jié)束后，真空濃縮，柱層析提純后，得到770 mg中間體，將其用5 mL二氯甲烷溶解，加入3 mL TFA和1.5 mL TIPS，于氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3 h。真空濃縮，黃色殘留油狀液體用正己烷攪洗6 次，每次6 mL，殘余物再通過(guò)真空干燥得到酰肼配體。

圖2 酰肼配體的合成方案Fig.2 Synthesis of the hydrazide ligand

1.3.3 羧基化膠體金探針（cAuNPs@mAbs）和酰肼化膠體金探針（hAuNPs@mAbs）的制備

1.3.3.1 cAuNPs@mAbs制備

利用羧基配體修飾AuNPs，制備cAuNPs。具體步驟如下：將10 mL膠體金（100 nm）溶液以4 000 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀復(fù)溶于10 mL堿性超純水（pH 9）中，加入0.2 mg羧基配體，室溫緩慢振蕩反應(yīng)4 h，反應(yīng)混合物離心去除游離的配體，沉淀復(fù)溶于10 mL超純水中，置于4 ℃保存?zhèn)溆?，此時(shí)cAuNPs濃度為0.11 pmol/L。然后，在EDC存在的情況下，將所合成的cAuNPs與抗ZEN單克隆抗體的氨基偶聯(lián)，制備cAuNPs@mAbs。具體步驟如下：在0.9 mL 0.01 mol/L磷酸緩沖液（phosphate buffer，PB，pH 7.0）中加入100 μL cAuNPs（0.011 pmol），再將2.53 μg抗ZEN單克隆抗體和4 μL EDC（10ng/mL）加入到上述混合溶液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)90 min。加入100 μL的質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% BSA溶液，封閉反應(yīng)30 min。制備的膠體金探針以4 000 r/min離心10 min，沉淀重懸分散于100 μL PB溶液中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.2 hAuNPs@mAbs制備

將等比例的酰肼配體和羧基配體共修飾AuNPs，制備hAuNPs。具體步驟如下：將10 mL膠體金（100 nm）溶液以4 000 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀復(fù)溶于10 mL堿性超純水（pH 9）中，再加入0.2 mg酰肼配體與0.2 mg羧基配體，室溫緩慢振蕩反應(yīng)4 h，反應(yīng)混合物離心去除游離的配體，沉淀復(fù)溶于10 mL超純水中，置于4 ℃保存?zhèn)溆?，此時(shí)hAuNPs濃度為0.11 pmol/L。然后，將所合成的hAuNPs與抗ZEN單克隆抗體的醛基偶聯(lián)，制備hAuNPs@mAbs。具體步驟如下：在0.9 mL 0.01 mol/L PB溶液（pH 6.5）中加入100 μL hAuNPs（0.011 pmol），再將1.32 μg抗ZEN單克隆抗體加入到上述混合溶液中反應(yīng)10 min。加入20 μL豬血清溶液封閉30 min后，離心去除上清液，沉淀重懸分散于100 μL PB溶液中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 羧基化膠體金試紙條（cAuNPs-ICA）和酰肼化膠體金試紙條（hAuNPs-ICA）的制備及免疫層析檢測(cè)流程

試紙條由四部分組成：樣本墊、NC膜、吸水紙、PVC底板。使用劃膜儀將一定濃度的ZEN-BSA和羊抗鼠抗體（10ng/mL）噴涂到NC膜上，分別作為試紙條的T線和C線，37 ℃干燥6 h。將制備好的NC膜貼在底板上，再將吸水紙和樣本墊依次貼在底板的其余兩個(gè)部分，并與NC膜重疊1.0 mm左右，最后將組裝好的cAuNPs-ICA和hAuNPs-ICA切割成每條3.9 mm，密封干燥條件下保存。樣品中ZEN的檢測(cè)流程如圖3所示：取4 μL cAuNPs@mAbs或5 μL hAuNPs@mAbs與70 μL待測(cè)樣品提取液充分混合孵育5 min后，再加入到試紙條的加樣孔中，15 min后用膠體金讀取儀測(cè)定T線光密度（OD）和C線光密度（OD）。每個(gè)實(shí)驗(yàn)做3 個(gè)平行。如果C線顯色T線不顯色，則為陽(yáng)性結(jié)果；若T、C線都顯色，則為陰性結(jié)果；若C線不顯色，則結(jié)果無(wú)效。

圖3 cAuNPs-ICA和hAuNPs-ICA檢測(cè)ZEN的原理圖Fig.3 Schematic diagrams of the cAuNPs-ICA and hAuNPs-ICA for the detection of zearalenone

1.3.5 兩種膠體金試紙條檢測(cè)ZEN的標(biāo)準(zhǔn)曲線

將ZEN標(biāo)準(zhǔn)品用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS，pH 7.4）（0.01 mol/L）稀釋成終質(zhì)量濃度為0～1 500 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度取70 μL與5 μL cAuNPs@mAbs或4 μL hAuNPs@mAbs充分混勻后，移取70 μL混合物至樣品孔中（每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)3 次測(cè)定），15 min后使用讀取儀記錄試紙條T線與C線的讀值。以/為縱坐標(biāo)（代表試紙條檢測(cè)系列標(biāo)準(zhǔn)品的OD/OD值，代表試紙條檢測(cè)陰性對(duì)照樣品的OD/OD值），ZEN溶液質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制定量檢測(cè)ZEN的試紙條標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定線性定量范圍，并計(jì)算試紙條的IC以及檢出限（limit of detection，LOD），IC定義為抑制率為50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的ZEN質(zhì)量濃度，LOD定義為抑制率為10%時(shí)所對(duì)應(yīng)的ZEN質(zhì)量濃度。

1.3.6 hAuNPs-ICA檢測(cè)性能的評(píng)價(jià)

1.3.6.1 玉米中ZEN的提取

采用GB 5009.209—2016《食品中玉米赤霉烯酮的測(cè)定》的方法提取玉米中ZEN。具體步驟如下：稱取40.0 g玉米粉碎試樣（精確到0.1 g）于均質(zhì)杯中，加入4 g氯化鈉和100 mL乙腈-水（9∶1，/），以均質(zhì)器高速攪拌2 min，定量濾紙過(guò)濾，濾液置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.6.2 檢測(cè)條件優(yōu)化

移取5.0 mL經(jīng)LC-MS/MS測(cè)定為陰性的玉米提取液，加入85 mL水稀釋混勻，定量濾紙過(guò)濾，濾液同時(shí)添加ZEN儲(chǔ)備液至終質(zhì)量濃度為1 ng/mL。使用濃度為1 mol/L的HCl或NaOH溶液將陰性及陽(yáng)性添加玉米稀釋液的pH值調(diào)成5.0、6.0、7.0、8.0。分別取70 μL不同pH值的玉米稀釋液與4 μL hAuNPs@mAbs反應(yīng)5 min后，將上述溶液加到試紙條樣品孔中，每個(gè)梯度pH值重復(fù)3 次，15 min后使用讀取儀記錄試紙條T線與C線的讀值。競(jìng)爭(zhēng)抑制率/%＝（1-/）×100，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)抑制率確定試紙條最佳反應(yīng)pH值。進(jìn)一步將玉米提取液乙腈含量稀釋至體積分?jǐn)?shù)0%、2.5%、5%、10%、15%、20%，按照上述方法評(píng)價(jià)溶液中乙腈含量對(duì)試紙條檢測(cè)性能的影響。

1.3.6.3 玉米樣本中ZEN的靈敏度檢測(cè)

在最佳檢測(cè)條件下，用陰性玉米稀釋液將ZEN標(biāo)準(zhǔn)品配制成若干個(gè)梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液，各取70 μL上述溶液與4 μL hAuNPs@mAbs孵育5 min后加入到試紙條加樣孔中，每個(gè)質(zhì)量濃度分別重復(fù)3 次，15 min后用膠體金讀取儀獲得試紙條T線與C線的讀值。以/為縱坐標(biāo)，ZEN質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到試紙條的檢測(cè)靈敏度以及線性定量范圍。

1.3.6.4 試紙條精密度、準(zhǔn)確度及特異性評(píng)價(jià)

分別配制加標(biāo)量為1、10、100 μg/kg的ZEN陽(yáng)性樣本，用hAuNPs-ICA進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)不同質(zhì)量濃度的ZEN樣品，在同1 d內(nèi)使用同一批次試紙條分別測(cè)定3 次，每隔3 d測(cè)定1 次，且每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)3 次，最后通過(guò)計(jì)算得到每個(gè)質(zhì)量濃度的平均加標(biāo)回收率和批內(nèi)、批間回收率，評(píng)價(jià)試紙條的精密度與準(zhǔn)確度。選取糧食污染中常見(jiàn)的7 種真菌毒素進(jìn)行試紙條的特異性評(píng)價(jià)，包括赭曲霉毒素A、伏馬菌素B、黃曲霉毒素B、黃曲霉毒素B、黃曲霉毒素G、橘青霉毒素、嘔吐毒素，并將質(zhì)量濃度配制為1 000 ng/mL。然后將上述溶液與hAuNPs@mAbs混合反應(yīng)5 min后加入試紙條加樣孔中，每種溶液測(cè)定3 次，記錄試紙條T線和C線的讀值，并與ZEN陽(yáng)性樣品的競(jìng)爭(zhēng)抑制率進(jìn)行比較。

1.3.6.5 與UPLC法的相關(guān)性評(píng)價(jià)

取17 份經(jīng)商業(yè)化ELISA試劑盒檢測(cè)為陽(yáng)性的玉米樣本，使用本法和UPLC法同時(shí)檢測(cè)。以hAuNPs-ICA測(cè)定結(jié)果為橫坐標(biāo)，UPLC法測(cè)定結(jié)果為縱坐標(biāo)，繪制二者的相關(guān)性曲線并計(jì)算相關(guān)系數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

2 結(jié)果與分析

2.1 AuNPs、cAuNPs及hAuNPs的表征

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，大粒徑膠體金有利于提高競(jìng)爭(zhēng)模式免疫層析方法的檢測(cè)靈敏度，因此本研究采用種子法合成了大粒徑的AuNPs。圖4 A表明，制備的AuNPs具有規(guī)則的球形形狀，尺寸為（100±4.3）nm（=50）。如圖4B所示，羧基配體在傅里葉紅外光譜中1 710 cm處出現(xiàn)羧基C＝O的伸縮振動(dòng)峰，酰肼配體在1 654 cm處出現(xiàn)了明顯的酰胺鍵C＝O的伸縮振動(dòng)峰，表明兩種配體已經(jīng)成功合成。利用配基置換的方法制備cAuNPs和hAuNPs。相對(duì)于原始AuNPs，cAuNPs的Zeta電位從-36.8 mV略微增加到-32 mV，而hAuNPs的Zeta電位從-36.8 mV顯著增加到-16 mV（圖4C）。此外，與原始AuNPs相比，合成的cAuNPs和hAuNPs的紫外-可見(jiàn)吸收光譜出現(xiàn)明顯的紅移，cAuNPs和hAuNPs的紅移分別從566 nm到570 nm和573 nm（圖4D），而水化粒徑分別從99 nm增加到108 nm和111 nm（圖4E）。這些結(jié)果表明羧基和酰肼配體已經(jīng)成功修飾到AuNPs表面。

圖4 AuNPs、cAuNPs和hAuNPs的表征Fig.4 Characterization of AuNPs,cAuNPs and hAuNPs

2.2 cAuNPs@mAbs和hAuNPs@mAbs的合成及表征

2.2.1 cAuNPs@mAbs合成及表征

通過(guò)EDC活化cAuNPs表面羧基與抗ZEN單克隆抗體上的氨基形成酰胺鍵制備cAuNPs@mAbs。為了獲得探針的最佳活性，對(duì)影響抗體活性的幾個(gè)關(guān)鍵偶聯(lián)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，具體包括緩沖液pH值、EDC用量、偶聯(lián)反應(yīng)時(shí)間以及抗體飽和標(biāo)記量。將制備的膠體金探針進(jìn)行試紙條檢測(cè)，以試紙條T線顯色信號(hào)強(qiáng)弱確認(rèn)最佳標(biāo)記參數(shù)。如圖5A所示，當(dāng)溶液pH 7.0時(shí)，試紙條T線顯色值（OD）最大，因此選取pH 7.0的緩沖液用于后續(xù)偶聯(lián)實(shí)驗(yàn)。圖5B顯示，當(dāng)EDC用量為0.364 mg/pmol時(shí)，試紙條OD值最高。圖5C顯示，T線讀值隨著偶聯(lián)時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，在偶聯(lián)反應(yīng)90 min時(shí)，T線讀值達(dá)到最大，之后OD值保持穩(wěn)定，說(shuō)明最佳偶聯(lián)反應(yīng)時(shí)間為90 min?？贵w飽和標(biāo)記量結(jié)果如圖5D所示，OD值隨著抗體用量的增加而增加，當(dāng)抗體標(biāo)記量達(dá)到0.23 mg/pmol時(shí)OD值最大，表明抗體最佳標(biāo)記量為0.23 mg/pmol。在上述最優(yōu)條件下制備cAuNPs@mAbs并表征其水化粒徑，結(jié)果如圖5E所示，探針合成前后水化粒徑發(fā)生明顯改變，cAuNPs的粒徑從108 nm增加到145 nm，表明成功制備了cAuNPs@mAbs。

圖5 cAuNPs@mAbs的合成條件優(yōu)化Fig.5 Parameter optimization for synthesis of cAuNPs@mAbs

2.2.2 hAuNPs@mAbs合成及表征

溶液pH值和偶聯(lián)反應(yīng)時(shí)間是影響酰肼定向偶聯(lián)效率的兩個(gè)關(guān)鍵參數(shù)。理論上，弱酸性條件有利于促進(jìn)抗體Fc片段上醛基與hAuNPs酰肼基團(tuán)發(fā)生親核加成反應(yīng)。但是當(dāng)溶液pH值接近抗體的等電點(diǎn)時(shí)，由于抗體溶解度下降反而會(huì)降低偶聯(lián)效率，甚至導(dǎo)致探針出現(xiàn)沉淀反應(yīng)。如圖6A所示，當(dāng)緩沖溶液pH 6.5時(shí)，OD值達(dá)到最大，表明此時(shí)探針具有最高的生物活性。在最佳的反應(yīng)pH值條件下，將抗ZEN單克隆抗體與hAuNPs分別孵育1、3、5、7、10、30、50、70、90、120 min。圖6B顯示，抗體與hAuNPs孵育10 min后，試紙條OD值已經(jīng)達(dá)到最大值，表明酰肼介導(dǎo)的親核加成反應(yīng)在10 min內(nèi)即可快速完成偶聯(lián)反應(yīng)。相比于碳二亞胺介導(dǎo)的共價(jià)偶聯(lián)反應(yīng)（90 min），酰肼介導(dǎo)的定向偶聯(lián)策略大大減少了探針的制備時(shí)間。在最佳的反應(yīng)pH值下，使用不同量的抗ZEN單克隆抗體偶聯(lián)hAuNPs制備免疫探針。如圖6C所示，隨著ZEN抗體用量的增加，試紙條OD值也逐漸增加，當(dāng)抗體標(biāo)記量超過(guò)0.12 mg/pmol hAuNPs時(shí)，由于位阻效應(yīng)試紙條OD值反而呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。所以酰肼法介導(dǎo)的定向偶聯(lián)最佳抗體標(biāo)記量為0.12 mg/pmol hAuNPs，較碳二亞胺介導(dǎo)的共價(jià)偶聯(lián)抗體用量降低接近一倍左右，表明定向偶聯(lián)策略能有效降低抗體的用量，從而減少試紙條的制作成本。在上述最優(yōu)條件下制備hAuNPs@mAbs并表征其水化粒徑，結(jié)果如圖6D所示，探針合成前后水化粒徑發(fā)生明顯改變，hAuNPs的粒徑從111 nm增加到136 nm，表明成功合成了hAuNPs@mAbs。

圖6 hAuNPs@mAbs制備條件優(yōu)化Fig.6 Parameter optimization for preparation of hAuNPs@mAbs

2.3 cAuNPs-ICA和hAuNPs-ICA制備

膠體金探針用量與T線ZEN-BSA噴涂質(zhì)量濃度是影響試紙條靈敏度的兩個(gè)重要因素。為了獲得試紙條最佳檢測(cè)性能，本研究通過(guò)2因素3水平正交試驗(yàn)優(yōu)化以上參數(shù)。如表1、2所示，當(dāng)T線ZEN-BSA質(zhì)量濃度為2.5×10ng/mL，cAuNPs@mAbs用量為5 μL/條，試紙條檢測(cè)1 ng/mL的ZEN樣品時(shí)，抑制率達(dá)到27.89%；當(dāng)T線ZEN-BSA質(zhì)量濃度為10ng/mL，hAuNPs@mAbs用量為4 μL/條，檢測(cè)1 ng/mL的ZEN樣品時(shí)，抑制率達(dá)到43.8%。此時(shí)，兩種膠體金試紙條T線與C線均具有合適的顯色信號(hào)（cAuNPs-ICA：OD=977±10，OD=183±16；hAuNPs-ICA：OD=801±17，OD=850±30）。因此，cAuNPs-ICA的最佳制備工藝為T線抗原噴涂質(zhì)量濃度2.5×10ng/mL，探針用量5 μL/條。hAuNPs-ICA的最佳制備工藝為T線抗原噴涂質(zhì)量濃度10ng/mL、探針用量4 μL/條。

表1 cAuNPs-ICA制備參數(shù)2因素3水平正交試驗(yàn)優(yōu)化Table 1 Orthogonal array design and experimental results for parameter optimization for preparation of cAuNPs-ICA

表2 hAuNPs-ICA制備參數(shù)2因素3水平正交試驗(yàn)優(yōu)化Table 2 Orthogonal array design and experimental results for parameter optimization for preparation of hAuNPs-ICA

2.4 兩種膠體金試紙條檢測(cè)ZEN的標(biāo)準(zhǔn)曲線

在最優(yōu)條件下，用兩種膠體金試紙條檢測(cè)PBS 7.4（0.01 mol/L）配制質(zhì)量濃度為0～1 500 ng/mL的ZEN樣品。如圖7A所示，cAuNP-ICA與hAuNP-ICA定量檢測(cè)ZEN均呈良好的線性相關(guān)。如圖7B所示，當(dāng)ZEN質(zhì)量濃度介于0.488～31.253 ng/mL時(shí)，滿足線性回歸方程=-0.153ln+0.864（=0.978 8），經(jīng)計(jì)算得cAuNPICA的IC為10.795 1 ng/mL，LOD為0.843 7 ng/mL；酰肼方法的線性回歸方程為=-0.124ln+0.701 5（=0.990 1），檢測(cè)范圍為0.2～100 ng/mL，IC為5.078 ng/mL，LOD為0.201 7 ng/mL。以上結(jié)果表明酰肼介導(dǎo)的定向偶聯(lián)抗體策略有助于提高試紙條的檢測(cè)靈敏度。因此，本研究選用該法用于后續(xù)實(shí)際玉米樣本中ZEN的檢測(cè)。

圖7 cAuNPs-ICA和hAuNPs-ICA在PBS中檢測(cè)ZEN的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 Calibration curves for ZEN detection based on cAuNPs-ICA and hAuNPs-ICA

2.5 hAuNPs-ICA的性能評(píng)價(jià)

2.5.1 檢測(cè)參數(shù)的優(yōu)化

將hAuNPs-ICA應(yīng)用于玉米樣本中ZEN的檢測(cè)，以評(píng)價(jià)其在實(shí)際樣本中的檢測(cè)性能。由于ZEN是一種脂溶性真菌毒素，在提取過(guò)程中通常需要添加較高濃度的乙腈或甲醇以提高ZEN的提取得率，而高濃度的有機(jī)溶劑會(huì)極大地破壞抗原-抗體的親和力，因此，本研究首先優(yōu)化溶液中乙腈體積分?jǐn)?shù)對(duì)試紙條檢測(cè)性能的影響。如圖8A所示，當(dāng)溶液中乙腈體積分?jǐn)?shù)逐漸增加，競(jìng)爭(zhēng)抑制率由39%下降至15%。說(shuō)明隨著乙腈體積分?jǐn)?shù)的增加，抗體-抗原的反應(yīng)效果越來(lái)越差，從而影響試紙條的檢測(cè)性能。綜合考慮試紙條靈敏度以及樣本稀釋倍數(shù)兩個(gè)因素，最終選取溶液中乙腈體積分?jǐn)?shù)為5%作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)條件。其次，溶液的pH值也會(huì)影響抗原-抗體的反應(yīng)效率，因此進(jìn)一步優(yōu)化了檢測(cè)體系的pH值。如圖8B所示，試紙條檢測(cè)陰性樣本的ODT/ODC值隨著pH值的升高而降低（由1.2±0.06下降至0.84±0.04），說(shuō)明抗原-抗體的結(jié)合效率在下降。當(dāng)溶液pH 5.0時(shí)，試紙條的競(jìng)爭(zhēng)抑制率達(dá)到最高（43%），因此確定最佳反應(yīng)pH 5.0。

圖8 hAuNPs-ICA檢測(cè)參數(shù)的優(yōu)化Fig.8 Optimization of detection parameters of hAuNPs-ICA

2.5.2 玉米樣本中ZEN的標(biāo)準(zhǔn)曲線

為減少玉米樣本基質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的影響，采用陰性玉米提取液配制質(zhì)量濃度為0～10 000 ng/mL的ZEN標(biāo)準(zhǔn)溶液。圖9顯示，ZEN質(zhì)量濃度在0.25～250 ng/mL范圍內(nèi)，hAuNPs-ICA定量檢測(cè)ZEN呈良好線性相關(guān)，其線性回歸方程為=-0.122ln+0.778 1（=0.984 5），根據(jù)方程計(jì)算出IC為9.4 ng/mL，LOD為0.32 ng/mL。

圖9 hAuNPs-ICA檢測(cè)玉米樣本中ZEN的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.9 Calibration curves for ZEN detection in corn based on hAuNPs-ICA

2.5.3 試紙條精密度、準(zhǔn)確度及特異性評(píng)價(jià)

在玉米陰性樣本中添加量分別為1、10、100 μg/kg的ZEN 標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行批間及批內(nèi)加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)hAuNPs-ICA的準(zhǔn)確度和精密度。如表3所示，試紙條批內(nèi)和批間的回收率在83.1%～118.0%之間，變異系數(shù)在3.9%～13.1%之間，表明hAuNPs-ICA具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。進(jìn)一步選取糧食污染中常見(jiàn)的7 種真菌毒素進(jìn)行試紙條的特異性評(píng)價(jià)，包括赭曲霉毒素A、伏馬菌素B、黃曲霉毒素B、黃曲霉毒素B、黃曲霉毒素G、橘青霉毒素、嘔吐毒素，并將質(zhì)量濃度配制為1 000 ng/mL。結(jié)果表明本研究建立的hAuNPs-ICA與以上7 種真菌毒素?zé)o交叉反應(yīng)，表明本研究方法檢測(cè)ZEN具有良好的特異性。

表3 hAuNPs-ICA精密度與準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)Table 3 Precision and accuracy of hAuNPs-ICA

2.5.4 與UPLC方法的相關(guān)性評(píng)價(jià)

取17 份經(jīng)商業(yè)化ELISA試劑盒檢測(cè)為陽(yáng)性的玉米樣本，使用酰肼法和UPLC方法同時(shí)檢測(cè)。以hAuNPs-ICA測(cè)定結(jié)果為橫坐標(biāo)，UPLC方法的測(cè)定結(jié)果為縱坐標(biāo)，繪制二者的相關(guān)性曲線。如圖10所示，hAuNPs-ICA與UPLC的檢測(cè)結(jié)果有較好的相關(guān)性（=0.962 7），表明該方法可應(yīng)用于真實(shí)玉米樣品中ZEN的定量檢測(cè)。

圖10 hAuNPs-ICA方法與UPLC方法對(duì)比（n=17）Fig.10 Correlation between the results of hAuNPs-ICA and UPLC (n=17)

3 結(jié)論

建立了一種利用膠體金納米粒子表面的酰肼基團(tuán)與抗體Fc片段醛基發(fā)生親核反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)抗體在金納米粒子表面定向共價(jià)偶聯(lián)的新方法。該方法與常規(guī)碳二亞胺共價(jià)法相比具有以下優(yōu)勢(shì)：1）偶聯(lián)過(guò)程無(wú)需額外添加其他偶聯(lián)反應(yīng)試劑；2）抗體飽和標(biāo)記量更低（0.12 mg/pmol）；3）偶聯(lián)時(shí)間更短（10 min）；4）基于hAuNPs-mAbs探針制備的試紙條檢測(cè)ZEN具有更高的靈敏度（0.2 ng/mL），以及更寬的定量檢測(cè)范圍（0.2～100 ng/mL）。以上結(jié)果表明hAuNPs金作為一種新型標(biāo)記材料在提高免疫層析方法檢測(cè)性能方面具有廣泛的開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值。