基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探討枇杷葉防治Ⅱ型糖尿病的作用機(jī)制

孔紅銘 葉嘉昕 趙雅婷 趙楠星 夏旭東 戚向陽(yáng) 陳秋平

(浙江萬(wàn)里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，浙江 寧波 315100)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一組以高血糖為特征的代謝性疾病，通常分為Ⅰ型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)和Ⅱ型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)，臨床上絕大多數(shù)患者屬于T2DM。根據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)合會(huì)(International Diabetes Federation, IDF)數(shù)據(jù)顯示，截止2021年12月，我國(guó)糖尿病患者人數(shù)已達(dá)到1.4億，是全球糖尿病患病人數(shù)最多的國(guó)家，到2030年，成人糖尿病年發(fā)病率預(yù)計(jì)將增加69%[1]。有效控制血糖水平是預(yù)防或逆轉(zhuǎn)T1DM和T2DM及其并發(fā)癥，提高生活質(zhì)量的關(guān)鍵。天然α-葡萄糖苷酶(α-Glucosidase)抑制劑因副作用小，能夠有效控制糖尿病患者餐后血糖上升，是輔助治療T2DM的首選藥物。但目前市面上的α-葡萄糖苷酶抑制劑大多為人工合成，會(huì)引起腹脹[2]、腹瀉[3]、腹痛[4]等不良反應(yīng)。已有研究表明，從植物提取物中分析鑒定糖苷酶和脂肪酶抑制劑，能夠快速篩選潛在的降糖活性成分。如陳海君等[5]運(yùn)用親和超濾技術(shù)從毛菊苣種子提取物中篩選并鑒定出4種α-葡萄糖苷酶抑制劑；Chen等[6]通過(guò)沉淀交聯(lián)法將豬胰脂肪酶固定在金屬有機(jī)骨架上，篩選了夏枯草中的脂肪酶抑制劑，獲得13種可抑制脂肪酶的小分子化合物。

枇杷葉為薔薇科植物枇杷(Eriobotryajaponica)的干燥葉，作為傳統(tǒng)中藥，其性微寒、味苦，有清肺止咳、和胃利尿之功效[7]，主要化學(xué)成分為三萜酸類、黃酮類、多酚類等物質(zhì)。近年來(lái)，枇杷葉提取物在抗炎[8]、抗氧化[9-10]、降血糖[11]等方面的作用逐漸受到關(guān)注。由于中藥發(fā)揮療效時(shí)具有多成分多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，因此，枇杷葉抗糖尿病的作用機(jī)制也十分復(fù)雜，現(xiàn)階段缺乏對(duì)枇杷葉抗糖尿病的藥效成分及作用機(jī)制的整體認(rèn)識(shí)。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門基于系統(tǒng)生物學(xué)理論的新學(xué)科，主要內(nèi)容為生物系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)分析，可以從整體水平考察“藥物-靶點(diǎn)-疾病”之間的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系[12]，為表達(dá)及解釋傳統(tǒng)中藥多成分、多靶點(diǎn)、多調(diào)控通路的協(xié)同關(guān)系提供技術(shù)支撐。已有研究者采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對(duì)天然產(chǎn)物與疾病之間的作用關(guān)系進(jìn)行多通路分析，如吳丹等[13]運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)對(duì)柴胡抗抑郁機(jī)制進(jìn)行了預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)柴胡主要通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白磷脂酰肌醇激酶-蛋白激酶B (phosphatidylinositol 3 kinase protein kinase B，PI3K-AKT)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)、腎素血管緊張素系統(tǒng)(renin angiotensin system，Ras)和骨骼肌叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O (forkhead transcription factor O，F(xiàn)oxO)等信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮抗抑郁作用。本研究以枇杷葉為研究對(duì)象，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探究枇杷葉多途徑、多層次、多靶點(diǎn)間復(fù)雜的相互作用關(guān)系，旨在從天然產(chǎn)物中尋找藥效溫和、毒副作用小的α-葡萄糖苷酶抑制劑，以解決糖尿病人的實(shí)際需求。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

α-葡萄糖苷酶(50～120 kDa)，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；阿卡波糖、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；槲皮素、鞣花酸、β-谷甾醇、山奈酚、異鼠李素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate, EGCG)、科羅索酸對(duì)照品，均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1810可控溫紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 構(gòu)建枇杷葉活性成分潛在作用靶標(biāo)庫(kù)、相互作用網(wǎng)絡(luò)圖 登錄中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php)，設(shè)置類別為“Herb name”，使用“pipaye”作為檢索關(guān)鍵詞，以化合物口服藥物生物利用度(oral bioavailability，OB)和類藥性(drug-like，DL)為依據(jù)[14]，分別將二者參數(shù)設(shè)置為OB≥30%和DL≥0.18[15]進(jìn)行初篩，獲得活性成分及靶點(diǎn)。其中活性成分科羅索酸OB值為15.86，未能通過(guò)初篩，但宋星等[11]、許舒雯[16]研究表明該物質(zhì)具有降血糖作用，因此將其列入其中。借助Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)對(duì)靶點(diǎn)名稱標(biāo)準(zhǔn)化處理。將活性成分及靶點(diǎn)信息導(dǎo)入至Cytoscape 3.7.0，生成“活性成分-作用基因”相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3.2 通過(guò)共同靶點(diǎn)構(gòu)建成分-疾病相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò) 登錄人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，https://omim.org/)、人類基因數(shù)據(jù)庫(kù)(Genecards，https://www.genecards.org/)，以“type 2 diabetes mellitus”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，由此得到Ⅱ型糖尿病基因。將疾病靶點(diǎn)與成分靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny 2.1數(shù)據(jù)庫(kù)(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)繪制韋恩圖，交集靶點(diǎn)即為枇杷葉潛在治療Ⅱ型糖尿病作用靶點(diǎn)。將交集靶點(diǎn)與對(duì)應(yīng)活性成分導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0,建立“成分-疾病靶點(diǎn)”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，從而進(jìn)一步探討枇杷葉活性成分協(xié)同防治T2DM的藥理作用。

1.3.3 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將交集靶點(diǎn)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)(Search tool for recurring instances of neighbouring genes，https://string-db.org/cgi/input.pl)，設(shè)定物種為“Homo sapiens”，獲取蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein to protein interaction, PPI)，以“TSV”格式導(dǎo)出，使用Cytoscape 3.7.0 “Network Analyzer”分析插件獲取自由度、中心度數(shù)、介數(shù)，三者同時(shí)大于平均值的交集靶點(diǎn)即為枇杷葉防治T2DM的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.3.4 關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO分析及KEGG通路分析 將共同靶點(diǎn)上傳至Metascape分析平臺(tái)(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)，構(gòu)建可視化網(wǎng)絡(luò)。選擇物種為“Homo sapiens”，進(jìn)行基因本體論(Gene Ontology，GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路分析，并規(guī)定P<0.01，篩選符合條件的條目進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化分析。

1.3.5 分子對(duì)接 將篩選得到的自由度值較高的關(guān)鍵化合物與α-葡萄糖苷酶(PDB ID：3A4A)進(jìn)行分子對(duì)接，首先借助Chem3D軟件將化合物進(jìn)行能量最小化處理，在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.rcsb.org/)檢索3A4A，保存為pdb格式，使用Pymol 2.5.0軟件對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)刪除水分子、去除修飾配體，再使用AutoDock Tools 1.5.6將枇杷葉關(guān)鍵活性成分和3A4A轉(zhuǎn)換為pdbqt格式，并通過(guò)AutoDock Vina 1.1.2進(jìn)行分子對(duì)接，最后運(yùn)用Pymol 2.5.0將分子對(duì)接能量較小且構(gòu)象穩(wěn)定的化合物與3A4A進(jìn)行可視化處理[17]。棍狀結(jié)構(gòu)為配體分子，細(xì)線狀結(jié)構(gòu)為距離活性分子5?范圍內(nèi)的氨基酸殘基，黃色虛線表明配體分子與氨基酸殘基之間具有氫鍵相互作用。

1.3.6 活性抑制試驗(yàn)驗(yàn)證 用0.1 mmol·L-1磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS，pH值6.8)將α-葡萄糖苷酶配制成1.5 U·mL-1的溶液，用于酶活性分析。

測(cè)定樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性：比色皿中加入1.8 mL PBS緩沖液，于37℃預(yù)熱5 min，待其溫度穩(wěn)定后，加入5 mmol·L-14-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷溶液(4-nitrobenzene-α-D-glucopyranoside，PNPG)100 μL，再加入不同體積梯度(10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μL)的樣品溶液(0.03 mg·mL-1)，然后迅速加入20 μL 1.5 U·mL-1酶液，搖勻，于405 nm處監(jiān)測(cè)其2 min內(nèi)吸光度值的變化，計(jì)算酶活性(enzymatic activity，EA)[18-19]；測(cè)定陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖的酶活性同理，僅需將樣品溶液替換為阿卡波糖溶液(5 mmol·L-1)即可；測(cè)定空白酶活時(shí)，無(wú)需添加任何抑制劑，其余步驟同上。抑制率計(jì)算公式如下：

其中，EA為酶活力系數(shù)，U·mL-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 活性化合物篩選結(jié)果

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)篩選符合OB、DL值的化合物，得到19種結(jié)果，匯總見表1。

表1 枇杷葉19種活性成分信息表Table 1 Information table of 19 active ingredients of Loquat leaf

2.2 化合物、疾病靶點(diǎn)篩選結(jié)果

收集19種活性成分各自對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)基因，得到294種結(jié)果，并構(gòu)建有效成分靶標(biāo)庫(kù)。通過(guò)OMIM、Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索T2DM相關(guān)基因，收集相關(guān)度大于40以上的基因信息，刪除重復(fù)基因后共獲得731條結(jié)果，匯總為疾病數(shù)據(jù)庫(kù)。

2.3 “活性成分-作用基因”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建及分析

將2.1中收集到的活性成分及其對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)信息錄入Cytoscape 3.7.0生成“活性成分-作用基因”網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果見圖1。圖中共有309個(gè)節(jié)點(diǎn)、484條邊，節(jié)點(diǎn)間的連線表明二者之間存在相互作用關(guān)系，連線越密集表示二者之間的關(guān)聯(lián)度越高。其中，MOL00098(槲皮素)匹配到的靶標(biāo)數(shù)最多，為142個(gè)，MOL006821(EGCG)、MOL000422(山奈酚)、MOL005508(科羅索酸)、MOL000354(異鼠李素)和MOL000358(β-谷甾醇)對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)數(shù)量較多，依次為52、44、40、34和32個(gè)，因此，以上活性成分可能在諸如糖尿病、高血脂、高血糖等疾病的治療或輔助治療中發(fā)揮不同的作用。此外，由于TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)未收錄MOL001663(3-表齊墩果酸)、MOL012556(23-反式-p-香豆酸)、MOL012593、MOL012617(圓酵母烯素)化合物的相關(guān)靶點(diǎn)，因此將其刪去。

圖1 枇杷葉“活性成分-作用基因”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 “Component-action gene” network of loquat leaf

2.4 交集基因獲得結(jié)果

將294個(gè)活性成分靶點(diǎn)與731個(gè)T2DM靶點(diǎn)通過(guò)Venny 2.1繪制維恩圖(圖2)，二者重合區(qū)域即為交集基因，得到95個(gè)結(jié)果。

圖2 枇杷葉與Ⅱ型糖尿病靶點(diǎn)基因維恩圖Fig.2 Venn diagram of the targets of Loquat leaf and type 2 diabetes mellitus

2.5 “活性成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建及分析

將韋恩圖繪制得到的交集靶點(diǎn)依照2.3同法制作得到“活性成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)，網(wǎng)絡(luò)共包含100個(gè)節(jié)點(diǎn)與164條邊。其中，MOL00098(槲皮素)匹配到的靶標(biāo)數(shù)仍然最多，為59個(gè)，其次為MOL006821(EGCG)，匹配到41個(gè)靶標(biāo)，MOL000422(山奈酚)、MOL000354(異鼠李素)和MOL005508(科羅索酸)對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)數(shù)量依次為14、11和7個(gè)，說(shuō)明枇杷葉提取物用于防治Ⅱ型糖尿病時(shí)，主要通過(guò)以上活性成分作用于相同或不同的靶標(biāo)，進(jìn)而調(diào)節(jié)不同的代謝通路，從而發(fā)揮療效。

圖3 枇杷葉“活性成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 “Component-disease target” network of Loquat leaf

2.6 “活性成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建及分析

將篩選得到的95個(gè)成分-疾病交集靶點(diǎn)上傳至STRING在線蛋白互作關(guān)系分析平臺(tái)，得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖，如圖4所示。

圖4 枇杷葉與Ⅱ型糖尿病蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 The protein-protein interaction network of Loquat leaf and type 2 diabetes mellitus

PPI網(wǎng)絡(luò)中各個(gè)蛋白節(jié)點(diǎn)的平均自由度為 20.347 4， 平均介數(shù)為0.002 6，平均中心度數(shù)為0.691 5，三者同時(shí)大于平均值的靶點(diǎn)有15個(gè)，匯總見表2，由此判斷這些靶點(diǎn)極有可能是枇杷葉活性成分用于防治T2DM的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

表2 枇杷葉防治T2DM關(guān)鍵基因基本信息表Table 2 Basic information table of key genes in prevention of T2DM with loquat leaf

2.7 GO分析結(jié)果

GO富集分析結(jié)果表明(圖5)，生物過(guò)程(biological process，BP)主要涉及對(duì)脂多糖的反應(yīng)、上皮細(xì)胞增殖、氧化應(yīng)激反應(yīng)、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的調(diào)節(jié)、凋亡信號(hào)通路的調(diào)控等方面；分子功能(molecular function，MF)主要涉及DNA-結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、泛素-類蛋白連接酶結(jié)合、生長(zhǎng)因子結(jié)合等方面；細(xì)胞組成(cellular component，CC)主要涉及膜筏、膜微區(qū)、質(zhì)膜外側(cè)、細(xì)胞-襯底結(jié)、早期內(nèi)體等。

圖5 GO功能富集分析圖Fig.5 GO functional enrichment analysis diagram

2.8 KEGG分析結(jié)果

如圖6所示，富集程度較高的代謝通路主要包括脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、晚期糖基化產(chǎn)物-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(advanced glycosylation end products-receptor of AGE, AGE-RAGE)信號(hào)通路、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)信號(hào)通路、低氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia inducible factor-1, HIF-1)信號(hào)通路等，表明枇杷葉活性成分通過(guò)以上多條代謝通路發(fā)揮防治T2DM的作用。

注：氣泡大小與顏色表示代謝通路富集程度，氣泡越大，顏色越深表明富集程度越高。Note: The bubble size and color in the figure indicate the enrichment degree of metabolic pathway. The larger the bubble,the deeper the color, and the higher the enrichment degree.圖6 KEGG通路富集分析氣泡圖Fig.6 Bubble diagram of KEGG pathway enrichment analysis

2.9 分子對(duì)接結(jié)果

由表3可知，EGCG與3A4A結(jié)合能小于-10.0 kcal·mol-1，其次金雞納素 1a、原飛燕草素 B6、β-谷甾醇與3A4A的結(jié)合能均小于-9.0 kcal·mol-1，具有非常強(qiáng)烈的結(jié)合活性[20-21]。運(yùn)用Pymol 2.5.0進(jìn)行可視化處理，結(jié)果如圖7所示。以槲皮素為例，它能夠順利與3A4A蛋白的活性口袋進(jìn)行結(jié)合，通過(guò)與活性口袋的ASN317、ASN415、GLY161、LYS156、ASP233、ASN235、GLU429氨基酸形成分子間氫鍵，從而維持配體與蛋白活性口袋的穩(wěn)定。

表3 枇杷葉關(guān)鍵成分與3A4A對(duì)接結(jié)果Table 3 Docking results of key components of loquat leaf with 3A4A

圖7 枇杷葉關(guān)鍵活性成分與3A4A對(duì)接可視化三維圖Fig.7 3D visualization of the docking of key active components of loquat leaf with 3A4A

2.10 體外酶活性抑制驗(yàn)證

根據(jù)分子對(duì)接結(jié)果，選擇EGCG、β-谷甾醇、科羅索酸、槲皮素、異鼠李素、鞣花酸、山奈酚進(jìn)行體外酶活性抑制試驗(yàn)，結(jié)果見圖8?？紤]到臨床上常用阿卡波糖作為α-葡萄糖苷酶抑制劑，因此設(shè)置阿卡波糖為陽(yáng)性對(duì)照組，測(cè)得其半抑制濃度(50% inhibitory concentration，IC50)值為126.98 μmol·L-1。

圖8 活性成分對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用Fig.8 Inhibition effect of active ingredient on α-glucosidase

體外酶抑制結(jié)果表明，枇杷葉中主要活性成分的IC50值依次為EGCG(1.11 μmol·L-1)<科羅索酸(4.43 μmol·L-1)<槲皮素(6.39 μmol·L-1)<山奈酚(17.77 μmol·L-1)<β-谷甾醇(21.05 μmol·L-1)<鞣花酸(36.35 μmol·L-1)<異鼠李素(80.04 μmol·L-1) <阿卡波糖(126.98 μmol·L-1)，IC50值越低，表明對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制效果越好。EGCG的抑制活性最強(qiáng)(IC50值為1.11 μmol·L-1)，這與分子對(duì)接結(jié)果吻合，其余有效成分與酶的結(jié)合力十分強(qiáng)烈，說(shuō)明核心有效成分能夠與酶自發(fā)且穩(wěn)定地結(jié)合，因此，以上活性成分可作為高效α-葡萄糖苷酶抑制劑。

3 討論

我國(guó)是中藥大國(guó)，獨(dú)特的傳統(tǒng)藥學(xué)理論讓中藥在糖尿病及其并發(fā)癥的治療方面有著良好的效果和廣闊的前景。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一門新學(xué)科，與枇杷葉這一味傳統(tǒng)中藥相結(jié)合，能夠從靶點(diǎn)通路的角度分析枇杷葉用于防治Ⅱ型糖尿病的機(jī)理。因此本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)對(duì)枇杷葉防治Ⅱ型糖尿病的機(jī)制進(jìn)行探討。

通過(guò)構(gòu)建“活性成分-作用基因”、“活性成分-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖發(fā)現(xiàn)，槲皮素在二圖中均為關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，經(jīng)分子對(duì)接驗(yàn)證了其與α-葡萄糖苷酶有較強(qiáng)的結(jié)合活性。研究證實(shí)，槲皮素具有降血糖[22-23]、降血脂[24-25]、抗炎[26-27]、抗氧化[28]等多種藥理作用。翟云鵬等[29]通過(guò)誘導(dǎo)高血脂癥大鼠模型發(fā)現(xiàn)，槲皮素能夠降低其血糖、血脂并有效改善高血糖導(dǎo)致的腎功能損傷。

將枇杷葉"活性成分-疾病靶點(diǎn)"網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行靶點(diǎn)間相互作用分析，通過(guò)自由度值篩選發(fā)現(xiàn)IL6、TNF、AKT1、TP53、MAPK3、PTGS2是枇杷葉防治T2DM的關(guān)鍵靶點(diǎn)。IL6、TNF和AKT1能夠激活下游蛋白，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)能量代謝，增加葡萄糖消耗，抑制脂質(zhì)的合成，從而調(diào)控葡萄糖和脂質(zhì)代謝[30-32]。相關(guān)研究表明，TP53可能通過(guò)誘導(dǎo)骨骼肌中的氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)胰島素信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而調(diào)控胰島素抵抗的發(fā)展[33]。MAPK3在糖尿病、腎病的發(fā)病過(guò)程中，可能參與腎小球系膜細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致腎小球細(xì)胞外基質(zhì)堆積，造成腎小球硬化[34]。PTGS2可能對(duì)Ⅱ型糖尿病發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，PTGS2產(chǎn)生前列腺素，前列腺素負(fù)向調(diào)控葡萄糖刺激的胰島素分泌[35]。因此，枇杷葉活性成分可能作用于以上靶點(diǎn)，進(jìn)而發(fā)揮防治Ⅱ型糖尿病的作用。

通過(guò)GO和KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，AGE-RAGE、HIF-1、PI3K-Akt、TNF、叉頭轉(zhuǎn)錄因子O(forkhead box O, FoxO)、IL-17信號(hào)通路是枇杷葉防治Ⅱ型糖尿病的主要通路，槲皮素、山奈酚、異鼠李素等化合物正是通過(guò)以上信號(hào)通路影響了T2DM的發(fā)展進(jìn)程。Fox O在胰島素調(diào)節(jié)肝臟糖異生的信號(hào)通路中起重要作用，F(xiàn)ox O的高表達(dá)能夠引起糖脂代謝異常，通過(guò)抑制Fox O的蛋白表達(dá)，并促進(jìn)Fox O磷酸化表達(dá)，達(dá)到改善肝臟胰島素抵抗的效果[36]。磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3 kinase, PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)信號(hào)通路是肝臟中胰島素發(fā)揮作用的主要信號(hào)通路[37]。PI3K-Akt活化后能夠激活下游蛋白，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)能量代謝，增加體內(nèi)葡萄糖消耗，從而抑制體內(nèi)脂質(zhì)的合成，槲皮素、山奈酚作為常見的膳食類黃酮，具有抗炎、抗氧化、抑制AGE在血管內(nèi)蓄積等生物學(xué)功能，其機(jī)制與PI3K-Akt通路、AGE-RAGE通路密不可分?？屏_索酸能夠激活A(yù)kt磷酸化，下調(diào)Fox O等糖異生相關(guān)基因的表達(dá)，改善胰島素抵抗。AGE-RAGE信號(hào)通路可促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)和釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和促進(jìn)血管新生，降低AGE-RAGE水平可有效延緩腎臟纖維化病理改變[38-39]。異鼠李素是常見的黃酮類化合物之一，具有抗氧化、抗糖尿病、抗腫瘤等生物學(xué)活性，可通過(guò)AGE-RAGE、HIF通路降低血糖含量。HIF-1信號(hào)通路是機(jī)體低氧應(yīng)激反應(yīng)時(shí)的主要靶點(diǎn)[40]，研究表明，抑制糖尿病小鼠HIF-1α的表達(dá)，能抑制Ras同源基因家族成員A(Ras homolog gene family, member A, Rho A)/Rho蛋白激酶(Rho protein kinase, ROCK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而降低糖尿病小鼠的血糖水平[41]。

由于人體內(nèi)的α-葡萄糖苷酶是臨床上用于降血糖的關(guān)鍵靶點(diǎn)，因此將篩選得到的活性成分與α-葡萄糖苷酶進(jìn)行計(jì)算機(jī)輔助分子對(duì)接模擬。結(jié)果表明，α-葡萄糖苷酶與枇杷葉10種主要活性成分的結(jié)合能均≤-8.0 kcal·mol-1， 結(jié)合活性較強(qiáng)，與EGCG的結(jié)合能低至-10.2 kcal·mol-1， 親和力十分強(qiáng)烈。體外酶活性抑制驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，隨著作用濃度提高，活性成分抑制率也逐漸提高，呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性，且各成分IC50值均小于阿卡波糖，因此，枇杷葉活性成分可作為高效α-葡萄糖苷酶抑制劑。

在對(duì)枇杷葉活性成分進(jìn)行初篩時(shí)，已獲得4種金雞納素同分異構(gòu)體，經(jīng)過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)復(fù)篩，保留其中2種同分異構(gòu)體(金雞納素1a和金雞納素1c)，且分子對(duì)接結(jié)果表明，二者與α-葡萄糖苷酶的親和力總體而言十分優(yōu)異，可對(duì)二者進(jìn)行體外酶抑制驗(yàn)證。Patel等[42]研究發(fā)現(xiàn)，金雞納素lb能夠用作胰島素促進(jìn)劑，增加大鼠胰島素分泌。由于金雞納素lc目前在國(guó)內(nèi)無(wú)供貨商，因此暫時(shí)無(wú)法對(duì)其進(jìn)行體外試驗(yàn)，具體抑制效果有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，枇杷葉主要通過(guò)槲皮素、山奈酚、鞣花酸、科羅索酸等活性成分來(lái)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)、絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、對(duì)脂多糖的反應(yīng)和上皮細(xì)胞增殖等，進(jìn)而調(diào)控AGE-RAGE、HIF-1和PI3K-Akt等信號(hào)通路，從而對(duì)Ⅱ型糖尿病發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。研究結(jié)果為枇杷葉用于防治Ⅱ型糖尿病的作用機(jī)制提供了理論指導(dǎo)。