畸胎瘤衍生生長因子1對宮頸癌細胞體內(nèi)外增殖的作用分析

楊亞楠，許晴晴，兀紫夢，任琛琛

（鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000）

1 背景

宮頸癌是起源于于女性宮頸的一種惡性腫瘤，主要發(fā)生于育齡期及絕經(jīng)期女性，在2020年全球女性惡性腫瘤發(fā)病中占7.7%，在因惡性腫瘤死亡的女性患者中，宮頸癌占6.4%，僅次于肺癌，結(jié)直腸癌，乳腺癌，是女性癌癥發(fā)病中第四常見的疾病[1]。在世界范圍內(nèi)的欠發(fā)達地區(qū)，宮頸癌的發(fā)病率較高，居女性惡性腫瘤的第2位[2,3]。對早期的宮頸癌患者，行根治性子宮切除術(shù)可提高患者的生存率。有研究表明，對腫瘤具有高級別特征，如切緣細胞受累，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，宮旁侵犯及遠處轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者，術(shù)后使用輔助外照射放射治療同時進行鉑類化療，可提高患者的總生存期和無進展生存期。對有中等危險因素的宮頸癌患者，使用輔助外照射放射治療可減少宮頸癌患者的局部復(fù)發(fā)[4]。

畸胎瘤衍生生長因子1（Teratocarcinomaderived growth factor1，TDGF-1）又稱Cripto-1，由于存在修飾的EGF樣結(jié)構(gòu)域而被歸類于表皮生長因子相關(guān)肽家族[5]，在許多癌變及癌前病變，如胃腸上皮化生及乳腺導(dǎo)管原位癌中過表達[6]。除了干細胞，Cripto-1在正常組織中的表達水平很低[6]。在致癌轉(zhuǎn)化過程中，Cripto-1在幾種類型的人類癌癥中重新表達，包括胃癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌，乳腺癌等。在生殖系統(tǒng)惡性腫瘤如卵巢癌、宮頸癌、睪丸癌、前列腺癌等中Cripto-1的表達量亦有升高[7]。在腫瘤的發(fā)生過程中，Cripto-1可通過激活多種細胞內(nèi)外信號通路，調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖遷移侵襲，并與腫瘤細胞的放療抵抗和化療耐藥有關(guān)[8]。有研究表明，Cripto-1亦可以激活經(jīng)典wnt通路，引起頭頸部鱗狀細胞癌等多種癌細胞的增殖遷移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[9]。本課題通過一系列體內(nèi)外實驗，研究了Cripto-1在體內(nèi)外對宮頸癌細胞的增殖的作用。

2 材料與方法

2.1 材料

人Hela及SiHa細胞為鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院科研中心饋贈。為構(gòu)建低表達Cripto-1因子的穩(wěn)轉(zhuǎn)宮頸癌細胞，我們委托上海吉凱基因生物公司，構(gòu)建靶向沉默Cripto-1的慢病毒，該病毒載體為GV344，序列信息為：hU6-MCSUbiquitin-firefly_Luciferase-IRES-puromycin。

雌性裸鼠（4周齡，體重13-16g）購自北京SPF生物技術(shù)有限公司。實驗前1周在鄭州大學(xué)實驗動物中心實驗室飼養(yǎng)，以適應(yīng)環(huán)境。這項動物研究的倫理申請由鄭州大學(xué)動物研究倫理委員會批準(zhǔn)。動物實驗遵循《實驗動物的照料和使用指南》。Cripto-1基因引物和GAPDH引物購自尚亞生物，兔抗人Cripto-1單克隆抗體和E-cadherin單克隆抗體購自CST公司，MMP-9單克隆抗體購自艾博抗公司，抗GAPDH抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，CCK-8試劑盒購自蘇州宇恒生物科技有限公司。

2.2 方法

2.2.1 TCGA數(shù)據(jù)庫

從TCGA中下載宮頸癌原始數(shù)據(jù)，包括臨床預(yù)后數(shù)據(jù)，病理參數(shù)和Cripto1 mRNA表達水平，分析mRNA表達水平的差異與臨床預(yù)后的關(guān)系，并進行生存曲線分析。

2.2.2 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

Hela及SiHa細胞培養(yǎng)于高糖DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清及青霉素-鏈霉素。將培養(yǎng)瓶置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2恒溫密閉培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)、消化和傳代。使用慢病毒感染兩株細胞，慢病毒載體為GV344載體。于六孔板中培養(yǎng)細胞，生長至20% -30%匯合度時，轉(zhuǎn)染慢病毒載體。培養(yǎng)72小時之后，用0.25μg/mL的普利茅斯篩選單克隆細胞系，通過qrt-pcr檢測驗證Cripto-1的敲減效率。

2.2.3 RT-PCR

使用Trizol試劑從指定的細胞系中提取總RNA。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，應(yīng)用SYBR Premix Ex Taq Kit系統(tǒng)為基礎(chǔ)，建立了熒光定量PCR的方法。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT方法進行數(shù)據(jù)分析及表達水平測定。β-actin引物序列為Foward：5’-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3’；Reserve：5’-AGGTCTTTGCGGATG TCCACGT-3’，Cripto-1引物序列為：Foward：5’-CAGGAATTTGCTCGTCCATCTCGG-3’；Reserve：5’-TAGTACGTGCAGACGGTGGTAGTT-3’。

2.2.4 Western-blot

轉(zhuǎn)染后48h收集各組的細胞，按照蛋白提取試劑盒說明書步驟提取總蛋白液。BCA法測定蛋白濃度，配置5%的濃縮膠和12%的分離膠，進行SDS-PAGE電泳，再將電泳產(chǎn)物電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。含5%的脫脂牛奶搖床上封閉1h后，分別加入稀釋好的Cripto-1、E-cadherin、MMP9和GAPDH（稀釋比均為1:1000）的抗體中，4℃孵育過夜。次日，TBST洗膜3次×10min。加入山羊抗兔免疫熒光二抗（稀釋比例為1:5000），室溫孵育1h。TBST洗膜3次×10min。利用Kodak Digital Science 1D Image Analysis Software測定Western blot條帶凈灰度值，并與內(nèi)參照GAPDH的測定結(jié)果相比較，計算其比值。

2.2.5 CCK-8實驗

用CCK-8法檢測細胞增殖情況。在96孔板中接種細胞，密度為2×103個細胞/孔，在培養(yǎng)24，48，72，96小時后分別加入CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2小時。使用酶標(biāo)儀在450nm出測定每個孔的吸光度。

2.2.6 克隆形成實驗

取對數(shù)生長期SiHa細胞及HeLa細胞，消化計數(shù)后，分別將2×103細胞接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2mL單細胞懸液。培養(yǎng)10～14天，每天觀察克隆形成情況，每3天更換培養(yǎng)基2次。至培養(yǎng)板中形成肉眼可見的克隆時，停止培養(yǎng)，以甲醇固定20min，0.2%結(jié)晶紫染液染色30min，最后于倒置顯微鏡下計數(shù)≥50個細胞數(shù)的集落為有效細胞集落，計算克隆形成率。

2.2.7 裸鼠異種移植瘤模型

將低表達Cripto-1慢病毒和陰性對照病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SiHa細胞分別接種于裸鼠兩側(cè)腋下（5×106個細胞，每組4只），接種后每3天測量腫瘤體積，18天后剝離瘤體，測量瘤體終體積及重量。排除意外原因小鼠的死亡，最終有效數(shù)據(jù)為4對4。這項動物研究的倫理批準(zhǔn)是由鄭州大學(xué)動物研究倫理委員會批準(zhǔn)。動物實驗遵循《實驗動物的照料和使用指南》。

2.2.8 數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計學(xué)分析使用了GraphPad Prism 8.0軟件和SPSS 26.0統(tǒng)計軟件進行了數(shù)據(jù)分析。計量資料使用算術(shù)均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)，P＜0.05視為有差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 Cripto-1表達與宮頸癌預(yù)后相關(guān)

通過在線網(wǎng)站GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn/）分析TCGA數(shù)據(jù)庫中278例宮頸癌患者Cripto-1 mRNA與生存期的關(guān)系，其中，藍色曲線為Cripto-1低表達組，樣本量n=145；紅色曲線為Cripto-1高表達組，樣本量n=133。結(jié)果如圖1，圖2所示，在278例宮頸癌患者中，Cripto-1的表達與患者總存活時間之間無明顯關(guān)系（P＞0.05，如圖1），但與低表達組相比，高表達Cripto-1因子的宮頸癌患者無進展生存時間較短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，如圖2），提示Cripto-1的表達可能減少宮頸癌患者的無進展生存時間。

圖1 Cripto-1表達水平與宮頸癌患者總生存率（Overall survival）的關(guān)系，P=0.85

圖2 Cripto-1表達水平與宮頸癌患者無瘤生存率（Diseasefree survival）的關(guān)系，P=0.015

3.2 Cripto-1促進宮頸癌的增殖

為構(gòu)建低表達Cripto-1因子的穩(wěn)轉(zhuǎn)宮頸癌細胞，我們委托上海吉凱基因生物公司，使用慢病毒GV344載體，構(gòu)建了Cripto-1-RNAi慢病毒。RT-PCR及Western-Blot結(jié)果證明，構(gòu)建完成的實驗組SiHa和HeLa穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株中，Cripto-1因子的表達明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖3。RT-PCR及Western-Blot證實穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株中Cripto-1因子的表達明顯降低，即成功構(gòu)建低表達Cripto-1因子的SiHa和HeLa穩(wěn)轉(zhuǎn)株。

圖3 RT-PCR和Western blot檢測慢病毒轉(zhuǎn)染效率。（A）四組細胞中Cripto-1及內(nèi)參蛋白表達水平。（B）四組細胞中Cripto-1及內(nèi)參蛋白表達定量分析。（C）敲減Cripto-1后HeLa細胞中Cripto-1 mRNA表達水平定量分析。（D）敲減Cripto-1后SiHa細胞中Cripto-1 mRNA表達水平定量分析。數(shù)據(jù)使用算術(shù)均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05

利用Cripto-1 RNAi慢病毒建立穩(wěn)定的SiHa和HeLa細胞低表達細胞系。兩株宮頸癌細胞系中的轉(zhuǎn)染效率均較高。利用兩株穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，我們采用克隆形成實驗及CCK-8實驗研究了Cripto-1對宮頸癌細胞增殖作用的影響。CCK-8實驗顯示，經(jīng)過相同時間的培養(yǎng)，Cripto-1低表達組細胞在OD=450nm處的吸光度明顯低于對照組（P＜0.05，圖4）；同時，克隆形成實驗顯示，經(jīng)相同時間的培養(yǎng)，Cripto-1低表達組集落形成數(shù)低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001，圖5）。結(jié)果表明，Cripto-1基因的下調(diào)抑制了細胞增殖，并降低了宮頸癌細胞的克隆能力。

圖4 Cripto-1促進宮頸癌細胞的增殖。（A）CCK-8法檢測Cripto-1下調(diào)后HeLa細胞細胞連續(xù)4天的生長情況（B）CCK-8法檢測Cripto-1下調(diào)后SiHa細胞連續(xù)4天的生長情況.**P＜0.01，*P＜0.05

圖5 慢病毒處理后細胞的集落形成情況。（A、C）HeLa-Cripto1（-）組及HeLa-Vector組克隆形成情況及定量分析。（B、D）SiHa-Cripto1（-）組及SiHa-Vector組克隆形成情況及定量分析。數(shù)據(jù)使用算術(shù)均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05

3.3 Cripto-1在裸鼠成瘤模型中促進腫瘤生長

為進一步探究Cripto-1在體內(nèi)的作用，我們利用裸鼠的異種移植瘤模型研究了Cripto-1對宮頸癌細胞體內(nèi)增殖的影響。實驗結(jié)果表明，在飼養(yǎng)時間相同的條件下，注射低表達Cripto-1因子的穩(wěn)轉(zhuǎn)SiHa細胞株的裸鼠皮下成瘤體積明顯低于對照組（圖6 A、C）。飼養(yǎng)28天后處死裸鼠，剝離瘤體并稱重，結(jié)果顯示，低表達Cripto-1組的腫瘤重量和體積顯著低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖6 B、DP＜0.05）。結(jié)果提示Cripto-1因子的表達對裸鼠的皮下成瘤起促進作用。

圖6 Cripto-1的低表達抑制小鼠模型中的腫瘤生長。（A）在處死小鼠后立即拍攝圖像，上組小鼠為注射Cripto-1低表達細胞系組，而下組圖像中的小鼠為對照組。（B）腫瘤重量。（C）從裸鼠身上切除的腫瘤。（D）每周測量腫瘤體積。數(shù)據(jù)使用算術(shù)均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05

4 討論

宮頸癌起源于子宮頸，是女性較為常見的惡性腫瘤類型，其發(fā)病率與死亡率均較高，在2020年全球女性惡性腫瘤統(tǒng)計中，宮頸癌發(fā)病率僅次于乳腺癌，肺癌，結(jié)直腸癌，是女性癌癥發(fā)病中第四常見的疾病[10]。在全球欠發(fā)達地區(qū)，宮頸癌的發(fā)病率居女性腫瘤第2位，僅次于乳腺癌[11]。傳統(tǒng)觀點認(rèn)為，大多數(shù)宮頸鱗狀細胞癌的發(fā)病與HPV感染有關(guān)，但越來越多的研究表明，部分宮頸癌患者可不伴隨HPV感染，其病理類型多為腺癌[12]。對早期宮頸癌患者，行根治性子宮切除術(shù)可提高生存率，有研究表明，對腫瘤具有高級別特征，如切緣細胞受累，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，宮旁侵犯及遠處轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者，術(shù)后使用輔助外照射放射治療同時進行鉑類化療，可提高患者的總生存期和無進展生存期。對有中等危險因素的宮頸癌患者，使用輔助外照射放射治療可減少宮頸癌患者的局部復(fù)發(fā)[13]。隨著生物化學(xué)、分子生物學(xué)技術(shù)及細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究的進展，生物學(xué)標(biāo)志物及基因靶點在癌癥的診斷、治療、預(yù)后方面逐漸開始發(fā)揮越來越重要的作用。靶向治療藥物是針對惡性腫瘤細胞明確位點而設(shè)計的藥物，特異性高，不良反應(yīng)較小，作用效果好，成為多種癌癥的主流治療方案[14]。同時，宮頸癌的治療目前并沒有有效可行的治療靶點[15]。同時，放化療抗性的產(chǎn)生是目前臨床癌癥治療的主要障礙之一，分子靶向增敏治療也是目前對宮頸癌治療方法的研究熱點之一[16]。因此，探討并確定宮頸癌診斷，治療，預(yù)后及隨訪的特異性生物學(xué)標(biāo)志物有一定必要性。

畸胎瘤衍生生長因子-1（TDGF-1），又名Cripto-1，屬于表皮生長因子/Cripto/FRL1/Cryptic（EGF-CFC）蛋白家族，定位在人類染色體3p21.3，編碼Cripto-1蛋白[17]。Cripto-1蛋白分子量為21KD，屬于膜相關(guān)蛋白，包含一個修飾的EGF樣結(jié)構(gòu)域、一個富含CFC半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域、一個NH2-末端信號肽和一個短的疏水COOH-末端，該末端包含糖基磷脂酰肌醇（GPI）切割和附著的短序列[18]。在早期胚胎內(nèi)胚層與中胚層的形成過程中，通過參與Nodal信號傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)，參與了早期胚胎誘導(dǎo)過程[19]。研究顯示，除了干細胞，Cripto-1在正常人體高分化組織及小鼠正常組織中的表達水平很低[20]。在正常組織的惡性轉(zhuǎn)化過程中，Cripto-1在多種人類癌癥中重新表達，包括結(jié)直腸癌、胰腺癌、乳腺癌，生殖系統(tǒng)惡性腫瘤如卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、前列腺癌和睪丸癌[21]。亦有研究發(fā)現(xiàn)，Cripto-1的過表達可能與癌前病變?nèi)缥改c上皮化生、乳腺導(dǎo)管原位癌的發(fā)生相關(guān)[22]。另外，在長期幽門螺桿菌感染和萎縮性胃炎（胃癌發(fā)生的兩個風(fēng)險因素）的患者中，以及在屬于遺傳性結(jié)直腸癌高危人群中未發(fā)病的個體的正常腸粘膜中，Cripto-1分子亦有表達[23]。已有觀點認(rèn)為，Cripto-1可能成為惡性腫瘤及癌前病變診斷治療的重要靶點。在一項對宮頸癌的研究中，Ertoy和collaborator收集臨床樣本的免疫組織化學(xué)研究結(jié)果顯示，與正常宮頸組織相比，Cripto-1在早期宮頸癌患者的組織切片中的表達量增加，該研究還表明，Cripto-1高表達量與腫瘤的高風(fēng)險特征，如腫瘤大小、切緣細胞受累、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、宮旁侵犯及遠處轉(zhuǎn)移相關(guān)，同時，在宮頸癌轉(zhuǎn)移的盆腔淋巴結(jié)中，亦可見Cripto-1表達水平增加[24]。另一項研究結(jié)果顯示，下調(diào)肝癌細胞HepG2中Cripto-1的表達可增加肝癌細胞中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物的表達，且與其對Dishevelled-3的穩(wěn)定和Wnt/beta-catenin通路的激活相關(guān)[25]。

在臨床腫瘤學(xué)研究中，惡性腫瘤患者的生存時間是衡量患者治療受益程度的重要標(biāo)準(zhǔn)之一，通常包括總生存時間（Overall Survival,OS）、無進展生存時間（Progression-Free Survival,PFS）和中位生存時間（Median Survival Time，MST）?？偵鏁r間指從病人確認(rèn)患有疾病開始至因任何原因引起死亡的經(jīng)過的時間，通常認(rèn)為總生存時間是衡量抗腫瘤治療的最佳指標(biāo)。無進展生存時間通常定義為患者接受治療開始，直到疾病進展（如腫瘤復(fù)發(fā)）或因各種原因出現(xiàn)死亡的時間，對于很多病人生存時間普遍較長的癌癥，如宮頸癌、乳腺癌等，PFS可反映腫瘤的生長，并不受交叉治療和后續(xù)治療的影響，可作為此類惡性腫瘤的主要終點指標(biāo)或次要終點指標(biāo)[26]。對TCGA數(shù)據(jù)庫中278例宮頸癌患者的生存分析結(jié)果表明，Cripto-1的高表達水平對宮頸癌患者總生存時間無明顯影響，但可能導(dǎo)致宮頸癌患者無進展生存時間的縮短，此結(jié)果提示Cripto-1的表達可能為宮頸癌不良預(yù)后的危險因素。

為進一步探討Cripto-1在宮頸癌中的生物學(xué)作用，我們設(shè)計了一系列體內(nèi)外實驗。我們在宮頸癌SiHa和HeLa細胞中進行了一系列細胞功能學(xué)實驗。增殖失控是惡性腫瘤細胞的特征性行為之一，也是評價腫瘤惡性程度的重要指標(biāo)之一。細胞增殖實驗結(jié)果證明，Cripto-1基因促進了宮頸癌的細胞增殖行為，并增加了細胞的克隆能力。

我們的體外實驗結(jié)果提示，Cripto-1的下調(diào)能有效抑制宮頸癌細胞的增殖。為進一步探究Cripto-1在體內(nèi)的作用，我們利用裸鼠的異種移植瘤模型研究了Cripto-1對腫瘤體內(nèi)增殖的影響。實驗結(jié)果顯示，在經(jīng)過相同的成瘤時間，注射低表達Cripto-1因子的穩(wěn)轉(zhuǎn)SiHa細胞株的裸鼠皮下成瘤體積明顯低于對照組，且處死裸鼠并剝離瘤體稱重的結(jié)果顯示，低表達Cripto-1組的腫瘤重量顯著低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果提示Cripto-1因子的表達對裸鼠的皮下成瘤起促進作用。

5 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，高表達Cripto-1的宮頸癌患者無進展生存時間較短，提示其與宮頸癌的不良預(yù)后有關(guān)。Cripto-1在體內(nèi)外均可促進宮頸癌細胞的生長。