木薯二倍體及其同源四倍體葉片形態(tài)、生理及抗螨特征比較

韋婉羚 黃珍玲 陳會鮮 楊海霞 蘭 秀 梁振華 李恒銳

(廣西南亞熱帶農業(yè)科學研究所，廣西 龍州 532415)

木薯(ManihotesculentaCrantz)是熱帶、亞熱帶地區(qū)重要的糧食、飼料作物，也是重要的工業(yè)原料，深加工產品多達3 000種，涉及國計民生的各個領域[1]。朱砂葉螨(Tetranychuscinnabarinus)是重要的世界危險性農業(yè)害螨，目前已經成為為害木薯最嚴重的有害生物之一，可使木薯減產20%～70%，甚至絕收[2-3]。目前，各木薯產區(qū)對于朱砂葉螨的防治仍依賴于化學藥劑，但存在噴藥難、農藥有效利用率低、使用頻率與劑量不斷加大和“3R”等嚴重問題，因此，尋求符合環(huán)保要求的新防治策略和方法成為我國現代木薯產業(yè)發(fā)展中亟待解決的重要課題[4]。選育具有高抗朱砂葉螨的優(yōu)質高產木薯新品種具有重要的生物學及經濟學意義。

植物多倍體通常具有營養(yǎng)生長優(yōu)勢和更強的環(huán)境適應性，因而多倍體育種是植物遺傳改良的重要途徑[5]。多倍體植物由于染色體加倍，具有器官巨大、可孕性低、生活能力強、內含物多、抗逆性強、耐貯運等特點，目前多倍體育種技術已經受到廣泛關注與深入研究[6]。Chao等[7]和Liu等[8]的研究分別證明了多倍體擬南芥、四倍體大麥抗鹽性強于其二倍體；Ruiz等[9]研究了四倍體卡里佐枳橙的抗硼過量能力，證明其四倍體抗性比二倍體更強?？芍诜巧锬婢趁{迫下，多倍體植物的抗逆性普遍高于二倍體。在生物脅迫方面，姬萬麗[10]和張弛[11]分別研究了四倍體西瓜枯萎病抗性和紅陽獼猴桃潰瘍病抗性，結果均表明四倍體植株抗病性比二倍體更強。由此可見，多倍體優(yōu)良的抗逆性表現已經被充分證實。多倍體化是提高植物抗逆性的有效手段。

近年來國內開展了木薯多倍體誘導研究。安飛飛等[12]研究發(fā)現，華南8號四倍體植株葉片較其二倍體厚，且葉色深綠，塊根干物率和粗淀粉含量均較其二倍體顯著降低。李恒銳等[13]研究表明，四倍體木薯的開花結實物候期均遲于二倍體，且四倍體的雌花、雄花、花藥、果實、種子的形態(tài)大小均大于二倍體。凡杰[14]對獲得的四倍體植株與二倍體供體種進行蛋白質組學研究，發(fā)現木薯加倍后，與脅迫以及信號傳導相關的差異表達蛋白質表達水平上調，并據此推測多倍體的抗性會提高。魏望[15]研究發(fā)現，低溫脅迫下，四倍體木薯葉片遭受低溫損傷和葉片萎蔫下垂更加嚴重，且葉片黃化面積和數目均高于二倍體，四倍體木薯的抗寒性弱于其二倍體。尚小紅等[16]研究發(fā)現，在干旱脅迫下，四倍體木薯的總抗氧化能力強于二倍體，能產生更多的超氧化物歧化酶以清除活性氧，減少植株體內過氧化氫對細胞的破壞，四倍體受到干旱脅迫的影響明顯小于其二倍體。李遷等[17]對國家木薯種質資源圃227份核心木薯種質進行抗朱砂葉螨的抗性評價，發(fā)現華南124和華南205多倍體植株的抗螨性均強于其二倍體。但目前關于木薯同源四倍體在抗朱砂葉螨方面的深入研究仍鮮見報道。因此，本研究通過對木薯品種華南205、南植199的二倍體及其同源四倍體植株的葉片形態(tài)結構和逆境生理指標進行測定比較，并觀察自然感螨情況下植株的田間表現，鑒定其抗螨性，分析其抗性與葉片形態(tài)結構和逆境生理指標間的相關性，探究木薯同源四倍體抗朱砂葉螨的優(yōu)勢機理，以期為木薯抗螨性育種提供科學指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為廣西主栽木薯品種南植199(NZ199)和華南205(SC205)的二倍體及其同源四倍體成熟種莖。其中二倍體(2x)材料(染色體數為2n=2x=36條)，來自廣西南亞熱帶農業(yè)科學研究所木薯種質資源圃；四倍體(4x)材料(染色體數為2n=4x=72條)，由廣西農業(yè)科學院經濟作物研究所嚴華兵課題組鑒定后提供。

1.2 試驗地概況

試驗地位于廣西壯族自治區(qū)崇左市龍州縣境內的廣西南亞熱帶農業(yè)科學研究所木薯試驗基地(22°20′16″N，106°47′19″E)，海拔138 m左右。試驗地屬南亞熱帶季風氣候，年均氣溫≥23.1℃，年降雨量≥1 266 mm，年日照時數約1 521 h，年均相對濕度約88%，全年無霜期361 d。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗設計 木薯于2021年3月21日種植，試驗地為壤土，肥力中等。木薯種植株行距為0.8 m×1.0 m，每小區(qū)種植25株，采用完全隨機區(qū)組設計，每個品種為1個處理，3次重復。種植前施用有機肥 12 000 kg·hm-2作為基肥。種后50 d進行第1次追肥，施尿素112.5 kg·hm-2，復合肥(N∶P∶K為15∶15∶15)150 kg·hm-2，氯化鉀112.5 kg·hm-2。種后120 d進行第2次追肥，施尿素225 kg·hm-2，復合肥(N∶P∶K為15∶15∶15)300 kg·hm-2，氯化鉀300 kg·hm-2，其他栽培管理與常規(guī)管理一致。自然感螨，不噴施農藥。于2021年8月16日(木薯朱砂葉螨為害高峰期)調查木薯葉片受朱砂葉螨為害情況，隨后觀測各小區(qū)葉片形態(tài)及中裂片長寬，并采集植株頂芽下第5片完全展開的未受害葉片，用于葉片顯微結構觀測和逆境生理指標測定。

1.3.2 葉片形態(tài)及中裂片長寬觀測 每小區(qū)隨機選取15片葉觀測葉片裂片數、中裂片形狀、中裂片葉緣、頂端形狀，以及中裂片長與寬，取平均值。中裂片長為葉基部至葉尖的距離，中裂片寬為裂葉最寬處葉緣之間的距離。

1.3.3 葉片顯微解剖結構的觀測 葉片橫切面組織結構：于中裂片中脈兩側剪取約0.5 cm2的葉片塊，用甲醛-乙酸-乙醇(formaldehyde-acetic acid-ethanol，FAA)固定液進行固定、常規(guī)石蠟切片法切片，切片厚度為12 μm，番紅-固綠對染，制成永久切片，顯微鏡鏡檢合格后使用Eclipse Ci-L拍照顯微鏡(Nikon，日本)選取組織的目的區(qū)域進行100倍和400倍成像。成像完成后使用Image-Pro Plus 6.0分析軟件，以mm作為標準單位，觀測并計算葉片厚度、下表皮厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度，計算葉片組織結構緊密度(cell tense ratio,CTR)、組織結構疏松度(spongy ratio,SR)和柵海比：

柵海比=柵欄組織厚度/海綿組織厚度

(1)

CTR=柵欄組織厚度/葉片厚度×100%

(2)

SR=海綿組織厚度/葉片厚度×100%

(3)

每項指標均測定50個數值，求平均值。

氣孔特征：于中裂片中脈兩側剪取約0.5 cm2的葉片塊，用2.5%戊二醛固定，后經脫水、干燥，再進行導電處理，最后使用SU8100掃描電子顯微鏡(Hitachi，日本)對樣本進行觀察并采集圖像。應用Image-Pro Plus 6.0軟件測量計算每平方毫米氣孔密度、氣孔長度和寬度。

1.3.4 葉片逆境生理指標及測定 丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量、單寧含量、多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)活性、苯丙氨酸解氨酶(phenylanine ammonialyase, PAL)活性均參照試劑盒說明書測定，試劑盒均購自蘇州格銳思生物科技有限公司。

1.3.5 田間鑒定方法 木薯種質抗螨性鑒定評價方法及評級標準參照《NY/T 2445-2013 木薯種質資源抗蟲性鑒定技術規(guī)程》[18]。

采用五點取樣法進行調查：從木薯植株上、中、下3個部位的東、南、西、北4個方位各隨機選1片葉片為代表，每株共調查12片葉，調查受害程度，根據葉片受害癥狀確定和記錄受害級別(表1)，計算螨害指數。隨后，根據螨害指數將木薯種質的抗螨性分為免疫、高抗、抗、中抗、感和高感共6級(表2)。

表1 木薯葉片受朱砂葉螨為害的分級標準

表2 木薯種質對朱砂葉螨的田間抗螨性鑒定評級標準

螨害指數計算公式：

(4)

式中，I表示螨害指數%；S為葉片受害級別；NS為該受害級別葉片數；N為調查總葉片數。

1.4 統計分析

數據采用Excel 2013進行處理和制表，用SPSS 20.0進行統計分析，采取單因素方差分析和Duncan’s檢驗法進行差異顯著性分析，Pearson法進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 葉片形態(tài)組織特征比較

2.1.1 葉片形態(tài)特征比較 由圖1可知，染色體經過加倍后，葉片裂葉數、葉緣類型不變，但葉片裂葉的形狀有所改變。華南205二倍體葉片的中裂葉形狀為線形，其同源四倍體為提琴形，兩種倍性葉片的裂葉數均為9片；南植199二倍體葉片的中裂葉形狀為披針形，而其同源四倍體為倒卵形，兩種倍性葉片的裂葉數均為7片；兩品種的葉頂端形狀均由二倍體的漸尖變成四倍體的尾尖，葉片整體更寬更短。

圖1 二倍體及其同源四倍體木薯葉片比較

方差分析結果表明(表3)，兩木薯品種的二倍體及其四倍體植株葉片的中裂葉長、寬、葉形指數均差異顯著(P<0.05)。華南205同源四倍體、南植199的同源四倍體中裂葉長分別是其二倍體的0.81倍和0.87倍，中裂葉寬分別是1.46倍和1.28倍，葉形指數分別是0.55倍和0.68倍?？梢?，隨著倍數的增加，木薯葉長和葉形指數顯著變小，而葉寬顯著變大。

表3 二倍體及其同源四倍體木薯葉片特征比較

2.1.2 葉片解剖結構比較 由圖2可知，不同木薯葉片細胞排列順序基本相同，柵欄組織、海綿組織明顯分化。柵欄組織由多層柱狀細胞組成，每層細胞排列整齊、緊密，近等長。海綿組織由排列疏松的圓形或橢圓形細胞組成。由表4可知，華南205同源四倍體、南植199同源四倍體的葉片厚度分別是其二倍體的1.17倍和1.14倍，柵欄組織厚度分別是1.15倍和1.25倍，海綿組織厚度分別是1.09倍和1.06倍，下表皮厚度分別是1.14倍和1.22倍，下角質層分別是1.11倍和1.12倍，柵海比分別是1.05倍和1.18倍。兩品種的葉片厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度、下表皮厚度、下角質層厚度均隨倍性增大而增大，其同源四倍體與二倍體間差異顯著。華南205同源四倍體、南植199同源四倍體的組織結構疏松度分別是其二倍體的0.91倍和0.92倍，組織結構疏松度隨倍性的增大而變?。欢M織結構緊密度變化無規(guī)律，兩品種的二倍體及其同源四倍體間差異不顯著。

注：UE：上表皮；LE：下表皮；PT：柵欄組織；ST：海綿組織；LC：下角質層。

表4 二倍體及其同源四倍體木薯葉片橫切面解剖結構比較

2.1.3 氣孔特征比較 由表5可知，華南205同源四倍體、南植199同源四倍體的氣孔長度分別是其二倍體的1.29倍和1.58倍，氣孔寬度分別是0.99倍和0.75倍，氣孔密度分別是0.76倍和0.57倍。同源四倍體氣孔長度顯著大于其二倍體，同源四倍體氣孔寬度小于其二倍體但差異不顯著，但同源四倍體的氣孔密度顯著低于其二倍體?？梢?，同源四倍體氣孔增大，氣孔密度比其二倍性植株小(圖3)。

圖3 二倍體及其同源四倍體木薯葉片氣孔特征顯微示意圖

表5 二倍體及其同源四倍體木薯葉片氣孔特征比較

2.2 葉片抗逆生理指標比較

由表6可知，華南205同源四倍體、南植199同源四倍體的丙二醛含量分別是其二倍體的0.92倍和0.89倍，單寧含量分別是1.04倍和1.04倍，多酚氧化酶活性分別是1.29倍和1.13倍，苯丙氨酸解氨酶活性分別是1.30倍和1.73倍。兩品種的同源四倍體丙二醛含量較二倍體降低，而單寧含量和苯丙氨酸解氨酶活性顯著升高，華南205同源四倍體多酚氧化酶活性顯著高于其二倍體，而南植199同源四倍體高于其二倍體，但差異不顯著。

表6 二倍體及其同源四倍體木薯葉片逆境生理指標

2.3 木薯對朱砂葉螨抗性比較

由圖4可知，華南205二倍體葉面黃色斑點最多且成片，受害最嚴重，而南植199同源四倍體葉面黃色小斑點最少，受害輕微。結合表7可知，華南205同源四倍體螨害指數較其二倍體下降39.5個百分點，南植199同源四倍體螨害指數較其二倍體下降16.7個百分點。木薯品種華南205、南植199同源四倍體受螨害程度均較其二倍體低(圖4)，抗螨性由強到弱排序為：南植199同源四倍體(抗)>華南205同源四倍體(中抗)>南植199二倍體(中抗)>華南205二倍體(感)。木薯同源四倍體的抗螨性均強于其二倍體。

圖4 二倍體及其同源四倍體木薯葉片受朱砂葉螨為害的田間表現

表7 二倍體及其同源四倍體木薯對朱砂葉螨的田間抗性鑒定結果

2.4 木薯抗螨性與葉片形態(tài)結構特征和逆境生理指標的相關性分析

對不同倍性木薯螨害指數與部分葉片形態(tài)結構特征和逆境生理指標進行相關性分析(表8)，結果表明，螨害指數與葉片厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度、下表皮厚度、下角質層厚度、多酚氧化酶活性以及苯丙氨酸解氨酶活性呈極顯著負相關，與單寧含量呈顯著負相關；與氣孔密度、丙二醛含量呈顯著正相關。

表8 木薯螨害指數與葉片形態(tài)結構特征和逆境生理指標的相關性分析

3 討論

3.1 二倍體及其同源四倍體木薯葉片形態(tài)結構特征

不同倍性植株的表型存在差異，主要體現在細胞學、形態(tài)學及生理生化等方面[19]。本試驗結果表明，與二倍體相比，同源四倍體葉片更加厚實，小葉葉長更短、葉寬更寬，葉形指數顯著變小(表3)，氣孔增大，氣孔密度變小(表5)，該試驗結果與魏望[15]和周慧文等[20]的研究結果一致。同源四倍體葉片大，葉片與光的接觸面積增加，這可能是同源四倍體植株生長更健壯的重要原因。Skorupska[21]研究發(fā)現，氣孔密度與抗螨性呈顯著負相關。氣孔作為害螨取食的天然孔道，分布越密，害螨越易于取食，植株抗性越弱。木薯同源四倍體植株的氣孔大、氣孔密度小，不易于害螨取食，抗性強。葉片的顯微結構可以反映植物對環(huán)境的適應能力，是植物抗逆綜合評定必不可少的一部分。研究表明，下表皮、海綿組織和柵欄組織厚度等組織結構與抗螨性呈顯著正相關[22-23]。本研究結果表明，同源四倍體葉片柵欄組織厚度、海綿組織厚度、下表皮厚度、下角質層厚度、柵海比均比其二倍體大(表4)。害螨多群集于葉背，其取食的葉綠體主要存在于柵欄組織中，害螨口針需經過下表皮和海綿組織才能到達柵欄組織，所以下表皮和海綿組織越厚越不利于害螨取食。由此推測，染色體加倍后木薯葉片厚度、下表皮厚度等物理性狀的改變，可能會直接導致其抗螨性發(fā)生變化。

3.2 二倍體及其同源四倍體木薯葉片抗逆境生理指標特征

丙二醛是膜脂過氧化作用的主要產物之一。丙二醛含量在細胞內的積累常會導致膜脂過氧化，滲透系統受到破壞，因而其含量高低與抗逆性密切相關[24-25]。關于黑皮冬瓜[25]、蓖麻[26]的研究表明，四倍體植株丙二醛含量低于其二倍體。次生代謝物質在昆蟲營養(yǎng)上無重要意義，但能顯著影響昆蟲取食、生長和繁殖。單寧與植物抗蟲關系密切，被公認為是在作物防御害蟲取食中發(fā)揮直接作用的次生代謝物質，是植物抗蟲的重要化學屏障[27-28]。Ropek等[29]發(fā)現抗蟲蠶豆品種能夠有效抵御蠶豆蚜為害，與其葉組織中單寧含量含有較高有關。吳巖等[24]認為木薯對木瓜秀粉蚧的抗性與葉組織中總酚、單寧含量顯著正相關，與丙二醛含量顯著負相關。本試驗結果表明，木薯同源四倍體丙二醛含量顯著低于其二倍體(表6)。說明同源四倍體中丙二醛含量維持在較低水平，在逆境脅迫下受到的損傷較輕，抗逆性強。木薯同源四倍體葉片單寧含量顯著高于其二倍體，由此推測取食同源四倍體可能對害螨生長發(fā)育和種群數量擴大的抑制作用更強，因而同源四倍體植株受害更輕，抗性更強。

苯丙氨酸解氨酶和多酚氧化酶活性與植物抗蟲性密切相關。苯丙氨酸解氨酶可促進木質素的合成，木質素含量的增加可阻礙害蟲進一步取食危害，從而達到抵抗蟲害的目的[30]。多酚氧化酶可將酚類物質氧化為毒性更強的醌類物質，醌類物質對昆蟲的生長發(fā)育繁殖有明顯的抑制作用，是一種重要的抗性生理指標[31]。尹艷等[32]研究發(fā)現，四倍體頭花蓼苯丙氨酸解氨酶、查爾酮異構酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶活性均顯著高于二倍體。王宇[33]發(fā)現小麥高抗蚜品種的PAL和PPO活性均顯著高于其他抗性品種。本試驗發(fā)現，同源四倍體植株葉片的多酚氧化酶以及苯丙氨酸解氨酶活性均比其二倍體高(表6)。說明同源四倍體催化次生代謝物質(酚類、醌類等)合成的能力更強，同源四倍體具有更強大的化學防御物質基礎，從而不利于害螨生存，有利于減少害螨種群數量，減輕植株受害程度。

3.3 二倍體及其同源四倍體木薯抗螨性特征

大量研究表明，植物的抗蟲性與葉片厚度等物理性狀及單寧、丙二醛等化學物質含量息息相關，如螨害指數與葉片厚度、下表皮和柵欄組織厚度呈顯著負相關，與氣孔密度呈顯著正相關[21-23]；抗螨種質葉片苯丙氨酸解氨酶和多酚氧化酶活性[34-35]、單寧含量[36-37]顯著高于感螨種質；丙二醛含量與葉片為害指數呈顯著正相關[38]。本研究中，抗螨性鑒定發(fā)現，木薯同源四倍體的抗螨性均強于其二倍體(表7、圖4)。相關性分析結果表明(表8)，抗螨性越強的木薯品種，其葉片厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度、下表皮厚度和下角質層厚度以及葉片單寧含量、多酚氧化酶活性和苯丙氨酸解氨酶活性越大，氣孔密度和丙二醛含量越小。上述結果說明，木薯的物理屏障和化學物質含量對朱砂葉螨寄主選擇性具有重要影響。由此推測，木薯同源四倍體的抗螨性比其二倍體強的原因，可能是由于基因的劑量效應，增加了同源四倍體木薯固有的物理防御和化學防御機制，并直接影響了朱砂葉螨的敏感性和行為表現，從而減少了來自朱砂葉螨取食的侵害，增加植物在環(huán)境中的生存能力。

4 結論

本研究以華南205、南植199的二倍體及其同源四倍體為試驗材料，通過形態(tài)結構、抗逆生理指標和抗螨性的比較及相關性分析，發(fā)現同源四倍體在抗螨性、葉片形態(tài)結構和生理指標方面均優(yōu)于其二倍體。作為一種新的種質資源和育種方向，同源四倍體木薯具有較高的利用價值和前景。