電子束輻照對(duì)天麻粉滅菌效果及品質(zhì)的影響

于 明 王 丹, * 王 鋼 高 鵬 黃 敏 陳麗娟

(1 西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽(yáng) 621010；2 四川省原子能研究院，輻照保藏四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610101；3 成都默森輻源科技有限公司，四川 成都 610101)

天麻(Gastrodiaelata)是蘭科天麻屬天麻(GastrodiaelataBlume)的干燥塊莖[1-3]，廣泛分布于我國(guó)西南部和中部地區(qū)，有治療頭痛、降血壓、鎮(zhèn)靜和抗炎等效用[4-5]。天麻含天麻素、對(duì)羥基苯甲醇、多糖、蛋白質(zhì)等多種營(yíng)養(yǎng)成分，且天麻素和對(duì)羥基苯甲醇作為《中華人民共和國(guó)藥典》2020版規(guī)定測(cè)定的活性成分，是評(píng)價(jià)天麻品質(zhì)的主要指標(biāo)[6-7]。目前中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和健康委員會(huì)已將天麻納入《按照傳統(tǒng)既是食品又是中藥材的物質(zhì)管理試點(diǎn)》中。天麻既可加工成天麻飲片、天麻復(fù)方顆粒，又可加工成降壓咀嚼片和飲料等[8-9]。但由于天麻活性成分多、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，導(dǎo)致天麻表面微生物含量嚴(yán)重超標(biāo)。傳統(tǒng)的硫磺熏蒸和磷化鋁熏蒸方法存在化學(xué)殘留[10]等缺陷，氣調(diào)貯藏成本高，熱壓滅菌會(huì)破壞天麻素成分[11]。因此，尋求新的滅菌貯藏方式是促進(jìn)天麻產(chǎn)業(yè)發(fā)展的當(dāng)務(wù)之急。

電子束輻照技術(shù)是一種綠色冷殺菌技術(shù)[12]，因殺蟲滅菌效果顯著、安全等受到廣泛關(guān)注[13-14]。與傳統(tǒng)硫熏滅菌方法相比，電子束輻照技術(shù)具有無(wú)污染、無(wú)殘留等優(yōu)點(diǎn)。與60Co-γ射線輻照滅菌方式相比，電子束輻照技術(shù)穿透能力較弱，具有單位時(shí)間內(nèi)可加工產(chǎn)品量大、效率高、可控性強(qiáng)，且無(wú)環(huán)境污染隱患[15]等優(yōu)勢(shì)，已被廣泛用于食品、藥品及醫(yī)療用品的滅菌工藝中[16]，如蒸煮小龍蝦[17]、冷鮮雞[18]、葛根粉[19]等。

目前，電子束輻照在食品和中藥材中的應(yīng)用仍以滅菌殺蟲為主，而有關(guān)電子束輻照處理對(duì)天麻色澤、活性成分含量及指紋圖譜等品質(zhì)影響方面的研究尚鮮見。本研究采用不同劑量0(CK)、5、7、9、11、13 kGy高能電子束輻照處理天麻，測(cè)定天麻的微生物數(shù)量、色澤、理化性質(zhì)、活性成分含量及高效液相色譜(high performance liquid charamatography, HPLC)指紋圖譜等指標(biāo)，以期為電子束輻照技術(shù)在天麻滅菌加工中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

天麻藥材為市售，購(gòu)自成都市國(guó)際商貿(mào)城中藥材市場(chǎng)。

天麻素、對(duì)羥基苯甲醇、巴森利苷A(純度均≥ 98%)，成都埃法生物科技有限公司；甲醇、乙腈(均為色譜純)，購(gòu)于賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；胰酪大豆胨瓊脂、沙氏葡萄糖瓊脂，購(gòu)于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；重鉻酸銀劑量計(jì)，四川原子能研究院實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

NH300電腦色差儀，深圳市三恩馳科技有限公司；KQ-250DB超聲清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；GH6000型隔水培養(yǎng)箱，天津市泰斯特儀器有限公司；HZQ-F全溫振蕩培養(yǎng)箱，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；HH-S6數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市醫(yī)療儀器廠；DHG-9245A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科技有限公司；UltiMate3000DGLC雙三元、二維液相色譜儀系統(tǒng)，美國(guó)賽默飛世爾公司；IS1020高能電子加速器，同方威視科技(北京)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 輻照處理 將天麻樣品粉碎(過50目篩)，用聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯/聚乙烯(polyethylene glycol terephthalate/polyethylene, PET/PE)復(fù)合材料包裝，每袋400 g，平均厚度約2 cm，送至重慶恒德輻照有限公司進(jìn)行輻照處理，輻照吸收劑量分別設(shè)置為0(CK)、5、7、9、11、13 kGy。高能電子加速器參數(shù)為：電子束能量10 MeV，功率20 kW。采用四川原子能研究院自制的重鉻酸銀劑量計(jì)測(cè)定吸收劑量，實(shí)際測(cè)定吸收劑量為5.2、7.2、9.5、11.9、13.9 kGy。文中均以設(shè)定吸收劑量表示。

1.3.2 微生物限度指標(biāo)測(cè)定 按《中華人民共和國(guó)藥典》[2]2020版通則1105非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法測(cè)定天麻樣品中的需氧菌總數(shù)、霉菌及酵母菌總數(shù)。

1.3.3 色差測(cè)定 天麻色澤測(cè)定參照武艷雪等[20]的方法。對(duì)儀器黑白版校正以后，取適量天麻樣品置于粉末測(cè)試盒中進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，記錄其L*、a*、b*值。總色差ΔE由以下公式計(jì)算得出：

式中，ΔL*、Δa*、Δb*分別為劑量組與對(duì)照組L*、a*、b*的差值。

1.3.4 理化性質(zhì)測(cè)定 按照《中華人民共和國(guó)藥典》[2]2020版中的方法分別對(duì)天麻水分、醇溶性浸出物及總灰分含量等指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5 活性成分測(cè)定 參照《中華人民共和國(guó)藥典》[2]2020版中的方法測(cè)定天麻素及對(duì)羥基苯甲醇總含量。

1.3.6 天麻HPLC指紋圖譜測(cè)定

1.3.6.1 對(duì)照品溶液制備 取天麻素、對(duì)羥基苯甲醇、巴利森苷A對(duì)照品適量，精密稱定0.01 mg，加10%的甲醇混合溶液制成每1 mL含天麻素25 μg、對(duì)羥基苯甲醇50 μg、巴利森苷A 50 μg的混合溶液。

1.3.6.2 供試品溶液制備[21-22]取天麻細(xì)粉2.0 g，置于150 mL具塞磨口錐形瓶中，加入50 mL 55%甲醇溶液，搖勻，稱定重量，振蕩器振搖2 min后超聲(400 W，40 kHz)提取45 min，冷卻放至室溫，再次稱定重量，用上述溶液補(bǔ)足失量，搖勻并過濾，取續(xù)濾液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

1.3.6.3 高效液相色譜色譜條件 色譜柱：Hyersil GOLD(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液；按照表1進(jìn)行梯度洗脫；波長(zhǎng)：220 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30℃，進(jìn)樣量：10 μL。

表1 流動(dòng)相時(shí)間程序

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析計(jì)算，SPSS 25軟件Duncan’s多重檢驗(yàn)法分析結(jié)果之間是否存在顯著差異(P<0.05)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 電子束輻照對(duì)天麻微生物數(shù)量的影響

天麻經(jīng)電子束輻照后立即檢測(cè)需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)，結(jié)果見表2。天麻經(jīng)電子束輻照后，其微生物數(shù)量明顯減少。天麻的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)原始含菌量分別為 3.23×107、3.20×107(CFU·g-1)，經(jīng)5 kGy劑量輻照后，需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)均減少了4個(gè)數(shù)量級(jí)；經(jīng)7 kGy劑量輻照后，微生物含量降低了99.99%；經(jīng)9 kGy劑量輻照后，需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)含量均未檢出，滿足《中華人民共和國(guó)藥典》[2]2020版規(guī)定。

表2 電子束輻照對(duì)天麻微生物總數(shù)的影響

2.2 電子束輻照處理對(duì)天麻色澤的影響

中藥材色澤是影響藥材經(jīng)濟(jì)價(jià)值的因素之一。用色差儀測(cè)定其L*、a*、b*與△E值，獲得的數(shù)據(jù)可以判斷電子束輻照對(duì)天麻色澤的影響，其中L*值表示明度，值越大，光澤度越好；a*值代表紅綠值；b*值則代表黃藍(lán)軸上顏色的飽和度。由表3可知，電子束輻照處理后天麻的色澤發(fā)生變化。不同吸收劑量電子束輻照處理后天麻的色度L*值分布在11.03～13.81之間。與對(duì)照組相比，輻照后的天麻L(zhǎng)*值均降低，尤其是當(dāng)輻照劑量為5、11、13 kGy時(shí)，其L*值顯著低于對(duì)照組。a*值分布于22.74～26.33之間，表明顏色偏向紅色，在13 kGy時(shí)達(dá)到最大值。b*值分布在32.03～35.18之間，均為正值，偏黃色。與對(duì)照組相比，各劑量組的b*值無(wú)顯著差異，但5、7 kGy分別與13 kGy之間存在顯著差異，且13 kGy時(shí)達(dá)最大值?？偵睢鱁值在9 kGy時(shí)與對(duì)照組之間的差異最小，5 kGy的總色差則差異最大。

表3 電子束輻照對(duì)天麻色澤的影響

2.3 電子束輻照處理對(duì)天麻理化性質(zhì)的影響

由表4可知，不同劑量電子束輻照處理對(duì)天麻的水分、總灰分含量無(wú)顯著影響(P>0.05)。不同劑量電子束輻照處理天麻的醇溶性浸出物含量在16.90%～19.06%之間。與對(duì)照組相比，輻照處理后的天麻醇溶性浸出物含量略有上升，在9 kGy輻照時(shí)達(dá)到顯著水平(P<0.05)。

表4 電子束輻照對(duì)天麻貯藏期內(nèi)理化性質(zhì)的影響

2.4 電子束輻照對(duì)天麻HPLC指紋圖譜的影響

天麻素、對(duì)羥基苯甲醇、巴利森苷A對(duì)照品指紋圖譜如圖1所示。在天麻藥材高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜上共選擇標(biāo)定了20個(gè)共有特征峰，與對(duì)照品指紋圖譜比對(duì)，可確認(rèn)6號(hào)峰為天麻素、7號(hào)峰為對(duì)羥基苯甲醇、15號(hào)峰為巴利森苷A。采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2.0軟件分別對(duì)不同劑量電子束輻照天麻的指紋圖譜進(jìn)行多點(diǎn)位校正、自動(dòng)匹配，用中位數(shù)法生成對(duì)照?qǐng)D譜 R，即共有模式圖，并計(jì)算相似度(表5)。以6號(hào)峰天麻素為參比峰，計(jì)算天麻活性成分特征峰的相對(duì)保留時(shí)間(表 6)。由表5和表6可知，6個(gè)輻照劑量下的天麻特征峰相似度均達(dá)到0.99，相對(duì)保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation, RSD)均小于0.2%，說明在5～13 kGy吸收劑量范圍內(nèi)不會(huì)對(duì)天麻的化學(xué)成分一致性產(chǎn)生顯著影響。

注：6：天麻素；7：對(duì)羥基苯甲醇；15：巴利森苷A。

注：R：對(duì)照?qǐng)D譜；S1：0 kGy；S2：5 kGy；S3：7 kGy；S4：9 kGy；S5：11 kGy；S6：13 kGy。下同。

表5 電子束輻照前后天麻藥材指紋圖譜相似度計(jì)算表

表6 電子束輻照對(duì)天麻指紋圖譜相對(duì)保留時(shí)間的影響

2.5 電子束輻照處理對(duì)天麻活性成分含量的影響

為探究電子束輻照對(duì)天麻活性成分含量的影響，對(duì)電子束輻照處理后的天麻藥材進(jìn)行了活性成分定量檢測(cè)，結(jié)果見表7。各輻照組與對(duì)照組間天麻素含量無(wú)顯著差異，吸收劑量為5 kGy時(shí)，天麻素含量顯著低于11 kGy吸收劑量組(P<0.05)；對(duì)羥基苯甲醇含量隨著吸收劑量的增加而逐漸降低，在13 kGy時(shí)顯著降低至最小值。盡管不同處理組間的天麻素、對(duì)羥基苯甲醇含量存在差異，但電子束輻照對(duì)天麻主要有效成分天麻素、對(duì)羥基苯甲醇總百分含量無(wú)顯著影響(P>0.05)，表明天麻有效成分經(jīng)5種劑量處理后無(wú)大幅度降解。

表7 電子束輻照對(duì)天麻活性成分的影響

3 討論

3.1 電子束輻照對(duì)天麻微生物含量的影響

輻照直接或間接使微生物內(nèi)的DNA雙鏈斷裂、蛋白質(zhì)變性，從而使微生物喪失繁殖能力或死亡，且不會(huì)因溫度升高而使熱敏性物質(zhì)發(fā)生破壞[11]。目前已有利用60Co-γ射線探究輻照天麻的滅菌效果的報(bào)道，而利用電子束輻照天麻滅菌的報(bào)道較為鮮見。本研究結(jié)果表明，電子束輻照能夠有效降低天麻藥材中需氧菌、霉菌和酵母菌數(shù)量以達(dá)到滅菌效果，且隨著電子束吸收劑量的增加，對(duì)微生物的抑制作用逐漸增強(qiáng)，在輻照劑量為9 kGy時(shí)，天麻的微生物數(shù)量降至檢測(cè)限以下，基本達(dá)到無(wú)菌水平。蘇文俏[23]研究表明，采用輻照劑量為2、4、6 kGy的60Co-γ射線輻照天麻生藥粉，能有效降低產(chǎn)品中細(xì)菌、霉菌及酵母菌的含量，其中6 kGy的60Co-γ射線輻照滅菌率能達(dá)到99%以上，與本研究中輻照能有效降低天麻中需氧菌、霉菌與酵母菌含量的結(jié)果一致。何毅等[24]研究表明，采用2 kGy電子束輻照處理即可在保證藥材品質(zhì)的前提下有效殺滅川產(chǎn)麥冬中的微生物，也說明電子束輻照能有效殺滅藥材中的微生物。

3.2 電子束輻照對(duì)天麻色澤及理化性質(zhì)的影響

中藥材有其固有的色澤，是評(píng)價(jià)藥材品質(zhì)優(yōu)劣最直觀且重要的指標(biāo)，它與中藥材成分變化也有密切關(guān)系[25]。水分、灰分、浸出物含量是評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量的指標(biāo)。中藥材水分含量過高不利于貯藏，容易滋生病蟲和微生物，導(dǎo)致發(fā)霉、變質(zhì)以及有效成分的減少，降低藥效[26]。中藥材灰分中的礦物質(zhì)直接或間接地來(lái)自土壤，能反映藥材中的金屬礦物質(zhì)水平。當(dāng)總灰分含量控制在藥典規(guī)定范圍內(nèi)則說明藥材在種植、生產(chǎn)、運(yùn)輸和貯藏的各個(gè)環(huán)節(jié)中均無(wú)外界無(wú)機(jī)物的污染[27]。中藥材浸出物作為藥典規(guī)定的控制其品質(zhì)的關(guān)鍵指標(biāo)，具有保障中藥材質(zhì)量的作用。

本研究結(jié)果表明，電子束輻照對(duì)天麻亮度值有一定影響，即隨著電子束吸收劑量的增大，天麻L(zhǎng)*值降低。郭一丹等[28]研究發(fā)現(xiàn)60Co-γ射線和電子束處理使冬棗L*值降低，與本研究結(jié)果一致。有研究表明，總色差介于0～6之間時(shí)，色差不明顯[24]，說明本研究中輻照對(duì)天麻總色差的影響較小，但總體呈現(xiàn)出隨電子束吸收劑量增加先下降后上升的趨勢(shì)，其中9 kGy輻照劑量對(duì)天麻總色差的影響最小。

本研究結(jié)果表明，電子束輻照處理對(duì)天麻藥材中的水分和總灰分含量無(wú)顯著影響。韓振明等[29]研究發(fā)現(xiàn)蜈蚣藥粉中水分、總灰分、醇溶性浸出物含量在60Co-γ射線輻照前后均無(wú)顯著差異，與本研究結(jié)果一致。電子束輻照在輻照過程中并不會(huì)引起溫度的上升，因此對(duì)水分的影響較小。本研究結(jié)果表明天麻藥材醇溶性浸出物含量隨著吸收劑量的增加而增加。蔡汶莉[12]研究表明輻照后百合的水溶性浸出物含量顯著上升，與本研究結(jié)果一致。這可能是由于電子束輻照引起了天麻藥材中醇溶性生物大分子的降解，造成天麻醇溶性浸出物含量的上升。

3.3 電子束輻照對(duì)天麻HPLC指紋圖譜的影響

研究者利用中藥指紋圖譜分析比對(duì)中藥材的主要特征峰數(shù)量、峰面積或比例來(lái)達(dá)到對(duì)其質(zhì)量的綜合控制，保證中藥材質(zhì)量的穩(wěn)定安全[30]。中藥指紋圖譜技術(shù)能在一定程度上反映電子束輻照前后天麻質(zhì)量的變化。本研究結(jié)果表明，不同劑量電子束輻照處理并不會(huì)對(duì)天麻的HPLC指紋圖譜產(chǎn)生明顯影響，且各指紋圖譜相似度均大于0.99，具有良好的相似性，不會(huì)對(duì)天麻化學(xué)成分的一致性產(chǎn)生明顯影響。楊孝容等[31]研究發(fā)現(xiàn)天麻中某些化學(xué)成分會(huì)隨著60Co-γ射線輻照劑量的增加而減少。鄒瓊[21]研究發(fā)現(xiàn)低于10 kGy劑量60Co-γ射線輻照天麻后指紋圖譜相似度為0.918～0.999，結(jié)合5種成分含量變化情況后建議輻照天麻滅菌的劑量不超過6 kGy。以上研究均表明使用60Co-γ射線對(duì)天麻進(jìn)行輻照滅菌時(shí)宜采用較低劑量，與本研究中13 kGy以內(nèi)劑量輻照天麻不會(huì)對(duì)其成分產(chǎn)生明顯影響的結(jié)果不一致，這可能與輻射源不同有關(guān)，但仍需進(jìn)一步研究。

3.4 電子束輻照對(duì)天麻活性成分含量的影響

天麻素和對(duì)羥基苯甲醇是天麻的兩種主要藥用成分，也是評(píng)價(jià)天麻品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)。天麻素具有催眠鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、防治再灌注損傷、降低血壓、擴(kuò)張血管等藥理作用[32]。研究表明，對(duì)羥基苯甲醇作為天麻素的水解產(chǎn)物，同樣也具有神經(jīng)保護(hù)作用[33]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，各吸收劑量組天麻素含量均無(wú)顯著差異。胥雙等[34]研究發(fā)現(xiàn)天麻素含量在6 kGy的60Co-γ 射線輻照后無(wú)變化。陳艷[11]研究表明60Co-γ射線輻照對(duì)天麻素含量影響小。陳梅紅等[35]研究發(fā)現(xiàn)4.20～8.40 kGy60Co-γ射線輻照不會(huì)破壞天麻素結(jié)構(gòu)，其含量無(wú)顯著變化。以上研究均表明較低輻照劑量的60Co-γ射線輻照處理不會(huì)影響天麻素含量，與本研究結(jié)果一致。說明天麻素結(jié)構(gòu)在較低劑量輻照下較為穩(wěn)定。張曉彬等[36]采用5～30 kGy的電子束和60Co-γ射線分別輻照天麻藥材，結(jié)果表明天麻素含量隨輻照劑量的增加而降低，這與本研究結(jié)果不一致，可能是由于高劑量60Co-γ 射線輻照致使天麻素分子中醚鍵斷裂。楊孝容等[31]研究表明天麻素和對(duì)羥基苯甲醇在3～13 kGy60Co-γ射線輻照下相對(duì)穩(wěn)定。這與本研究中對(duì)羥基苯甲醇的含量在輻照劑量為13 kGy時(shí)顯著降低的結(jié)果不一致，但與輻射源是否有關(guān)還需進(jìn)一步探討?？傮w而言，電子束輻照處理對(duì)天麻藥材中兩者的總百分含量無(wú)顯著影響。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，電子束輻照能有效降低天麻藥材細(xì)粉中的微生物含量，且對(duì)其整體品質(zhì)無(wú)顯著影響。天麻中吸收劑量為9 kGy時(shí)，其微生物含量能滿足《中華人民共和國(guó)藥典》的規(guī)定，色澤變化最小，且有助于提高醇溶性浸出物含量，不會(huì)對(duì)天麻主要活性成分含量及化學(xué)成分一致性產(chǎn)生顯著影響。