脫毒馬鈴薯開放式組織培養(yǎng)抑菌劑的篩選

李婷婷，劉希元，滕巍，馬燕，李彥軍

（吉林省蔬菜花卉科學(xué)研究院，長(zhǎng)春，130033）

傳統(tǒng)組織培養(yǎng)要求環(huán)境無(wú)菌，對(duì)操作人員及環(huán)節(jié)要求嚴(yán)格，導(dǎo)致成本較高，不利于生產(chǎn)應(yīng)用與推廣。開放式組織培養(yǎng)不使用高壓蒸汽滅菌鍋與超凈工作臺(tái)，降低了組織培養(yǎng)成本，開放式組織培養(yǎng)通過(guò)在培養(yǎng)基中添加抑菌劑來(lái)代替高溫高壓滅菌，能夠減少培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分的損失，降低操作要求，簡(jiǎn)化組織培養(yǎng)條件。

低毒高效的消毒劑在日常生活中多作為表面消毒劑使用，在開放式組織培養(yǎng)中也有所應(yīng)用[1，2]，次氯酸鈉的消毒抑菌原理主要是其氧化作用與氯化作用能夠使病毒體的酶、核酸、蛋白等物質(zhì)失活，從而達(dá)到殺死病原體的目的[3]；次氯酸鈉的氯原子能夠與細(xì)胞膜蛋白質(zhì)結(jié)合，形成氮氯化合物干擾細(xì)胞正常代謝，氯離子能改變細(xì)胞滲透壓，達(dá)到抑菌作用[4，5]。因此，本研究使用次氯酸鈉溶液浸泡組培瓶與瓶蓋消毒，以簡(jiǎn)化組織培養(yǎng)操作，降低消毒成本。

已有研究表明，香蕉[6]、百合[7，8]、藍(lán)莓[9]、東北紅豆杉[10，11]等植物開放式組織培養(yǎng)取得成功，開放式組織培養(yǎng)中抑菌劑的使用種類有抗生素[12，13]、食品或化學(xué)防腐劑[14，15]、植物提取物[16]、化學(xué)消毒劑[17]等。在脫毒馬鈴薯開放式組織培養(yǎng)研究中，抑菌劑的使用還有深入研究的價(jià)值。高效抑菌劑益培隆可應(yīng)用在脫毒馬鈴薯傳統(tǒng)組織培養(yǎng)中，本研究進(jìn)一步探討益培隆在脫毒馬鈴薯開放式組織培養(yǎng)中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料馬鈴薯夏波蒂脫毒苗（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院），MS培養(yǎng)基（北京酷萊博科技有限公司）、蔗糖（北京酷萊博科技有限公司）、瓊脂（北京酷萊博科技有限公司）、次氯酸鈉（生物工程上海有限公司）、抑菌劑益培?。ˋ：10 mL/瓶，B：356 mg/瓶，金博駿藍(lán)生物技術(shù)有限公司）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)共設(shè)置5個(gè)益培隆濃度梯度，分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8 mL/L，培養(yǎng)基配方：MS+10 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂+益培隆，pH值5.8，使用1%的次氯酸鈉液浸泡培養(yǎng)瓶與瓶蓋進(jìn)行消毒，紫外線照射實(shí)驗(yàn)室30 min，關(guān)閉紫外燈后噴霧75%酒精對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行消毒滅菌。每個(gè)梯度接種10瓶，每瓶10個(gè)莖段，如圖1所示，3次重復(fù)，光照強(qiáng)度2 000 lx、光照周期12 h/d、溫度22℃，培養(yǎng)28 d后測(cè)量生長(zhǎng)指標(biāo)，培養(yǎng)28 d后的脫毒苗如圖2。

圖1 已接種的脫毒苗

圖2 培養(yǎng)28 d后的脫毒苗

1.3 試驗(yàn)方法

①開放式培養(yǎng)基的配制 關(guān)閉實(shí)驗(yàn)室門窗，提前消毒滅菌，浸泡培養(yǎng)容器消毒瀝干水分后備用，MS培養(yǎng)基添加蔗糖、瓊脂、抑菌劑益培隆，煮沸1 min后分裝于提前準(zhǔn)備好的培養(yǎng)瓶中，分裝后用紫外線照射15 min，不必進(jìn)行高溫高壓滅菌。將益培隆B粉末均勻溶解于A溶液中，用純凈水定容至100 mL。

②開放式接種方法 對(duì)實(shí)驗(yàn)室消毒滅菌后備用，接種前用75%酒精棉擦拭接種臺(tái)，接種使用的剪子、鑷子用酒精燈灼燒消毒，備用的剪子、鑷子浸泡于75%酒精中，不使用超凈工作臺(tái)。將長(zhǎng)勢(shì)一致的脫毒苗剪取帶有1個(gè)腋芽的莖段接種在培養(yǎng)基上。

1.4 測(cè)量指標(biāo)與方法

培養(yǎng)28 d后統(tǒng)計(jì)污染率，污染率（%）=污染瓶數(shù)/總接種瓶數(shù)×100；統(tǒng)計(jì)葉片數(shù)，葉片數(shù)為除原接種莖段老葉外，從頂葉到基部最后1片新發(fā)葉的全部葉片數(shù)量。測(cè)量植株株高、莖粗、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、葉面積、葉片葉綠素含量。用直尺測(cè)量植株基部到頂部的長(zhǎng)度為株高；取植株頂葉下第3與第4片葉間莖段，用游標(biāo)卡尺測(cè)量莖粗；取待測(cè)植株，洗凈根部培養(yǎng)基，吸干水分，用分析天平稱量植株鮮質(zhì)量；取待測(cè)植株，洗凈根部培養(yǎng)基，吸干水分后于105℃烘箱中殺青30 min后，調(diào)至80℃烘干至恒重，用千分之一分析天平稱量植株干質(zhì)量；取頂葉下第4片葉，用便攜式葉綠素儀測(cè)量葉片葉綠素含量（SPAD值）；使用稱重法測(cè)量葉面積，每株待測(cè)植株取3片葉片，打孔后稱質(zhì)量1，計(jì)算打孔葉面積1，稱取全部葉片重量2，計(jì)算植株葉面積2，葉面積2=1×2/1。

數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel與DPS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理與分析，使用 最小顯著極差法進(jìn)行多重比較（＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度益培隆處理對(duì)脫毒苗污染率的影響

由表1可知，隨著培養(yǎng)基中抑菌劑益培隆濃度的提高，脫毒苗的污染率逐漸降低，不添加抑菌劑益培隆時(shí)污染率最高，達(dá)到60.00%，抑菌劑益培隆濃度為0.8 mL/L時(shí)脫毒苗污染率降至0。

2.2 不同濃度益培隆對(duì)脫毒苗生長(zhǎng)的影響

由表1可知，各處理間株高、莖粗、葉片數(shù)、莖節(jié)數(shù)、葉面積、葉綠素含量6個(gè)生長(zhǎng)指標(biāo)差異均不顯著，推測(cè)原因是益培隆添加較少，以及益培隆抑菌劑本身毒害作用低，所以對(duì)馬鈴薯夏波蒂脫毒苗的生長(zhǎng)指標(biāo)影響較小，對(duì)植株生長(zhǎng)無(wú)抑制作用。但是在0.8 mL/L濃度梯度下，株高、葉面積均高于其他濃度處理與CK，莖粗高于其他濃度處理，植株生長(zhǎng)指標(biāo)較好。

表1 不同益培隆濃度處理下脫毒苗的污染率及脫毒苗生長(zhǎng)的影響

3 討論與結(jié)論

開放式組織培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)基添加抑菌劑抑制污染的應(yīng)用較多，但是不同植物種類適用的抑菌劑種類與濃度不同，抑菌劑濃度過(guò)高可能影響植株的正常生長(zhǎng)，濃度過(guò)低則達(dá)不到消毒效果。羅燕羽等[18]研究結(jié)果表明，在開放式組培中使用抑菌劑益培隆會(huì)影響香蕉組培苗的生長(zhǎng)，但是本研究中抑菌劑益培隆不影響馬鈴薯脫毒苗的生長(zhǎng)。在以后的開放組培研究中應(yīng)根據(jù)植物種類的不同，選擇不同的抑菌劑?？悼〉萚19]的研究表明，用84消毒液（次氯酸鈉）200倍液浸泡組培容器能夠降低開放組培的污染率，本試驗(yàn)采用1%次氯酸鈉液浸泡培養(yǎng)瓶與瓶蓋配合在培養(yǎng)基中添加抑菌劑益培隆能降低污染率，為馬鈴薯開放式組織培養(yǎng)中抑菌劑的使用提供了參考與理論依據(jù)，為馬鈴薯開放式組織培養(yǎng)的應(yīng)用與推廣奠定了一定的基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果表明，在次氯酸鈉浸泡消毒濃度為1%、抑菌劑益培隆濃度為0.8 mL/L時(shí)不發(fā)生污染，并且夏波蒂馬鈴薯脫毒苗生長(zhǎng)指標(biāo)良好。因此在馬鈴薯開放式組織培養(yǎng)中建議培養(yǎng)基配方選擇MS+10 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂+0.8 mL/L益培隆。