FLCN通過(guò)AMPK-mTOR信號(hào)軸調(diào)節(jié)奶牛乳腺上皮細(xì)胞能量代謝

張 娜，符海鑫，曹 慧，王偉華

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

乳腺是哺乳動(dòng)物特有哺育后代的功能器官，奶牛乳腺發(fā)育及泌乳需充足能量供應(yīng)，能量供應(yīng)不足導(dǎo)致乳品質(zhì)降低，因此能量代謝對(duì)乳腺組織發(fā)育和泌乳至關(guān)重要[1]。

AMPK是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與細(xì)胞代謝和能量調(diào)節(jié)。葡萄糖供應(yīng)減少等應(yīng)激條件可激活A(yù)MPK[2]。AICAR等激活劑可激活A(yù)MPK，天然小分子化合物CompoundC可抑制AMPK[3]。AMPK是所有真核生 物 細(xì)胞能量狀態(tài)傳感器，也在維持上皮細(xì)胞連接中發(fā)揮重要作用[4]。AMPK參與乳腺上皮細(xì)胞能量代謝調(diào)節(jié)。AMPK調(diào)控主要下游信號(hào)通路是mTOR信號(hào)通路。mTOR是一類(lèi)絲/蘇氨酸蛋白激酶，在進(jìn)化中高度保守，mTOR在各種生物細(xì)胞中廣泛存在，且分布于胞漿中。當(dāng)AMPK被激活時(shí)，mTOR活性被抑制。mTOR信號(hào)通路在細(xì)胞中發(fā)揮重要作用，主要有控制蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞增殖和代謝[5]。

FLCN有兩種相互作用蛋白，相互作用蛋白1（FNIP1）和FLCN同源蛋白2（FNIP2/FNIPL）[6]。Takagi等證實(shí)AMPK與FNIP1相互作用，AMPK導(dǎo)致FNIP1和FLCN磷 酸 化[7]。研 究 表 明，F(xiàn)LCN可 與FNIP1/FNIP2和AMPK形成復(fù)合物[8]。Yan等在對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)研究中發(fā)現(xiàn)FLCN敲除可增加AMPK活性[9]。Possik等在小鼠腎臟和肌肉研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LCN敲除導(dǎo)致AMPK表達(dá)增加[10]。此外，Collodet等在對(duì)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞系研究中發(fā)現(xiàn)FLCN敲除可激活A(yù)MPK[11]。以上結(jié)果提示FLCN是AMPK通路負(fù)調(diào)控因子。Wada等最新研究證實(shí)FLCN可調(diào)控mTOR信號(hào)通路[12]。Hartman等在人類(lèi)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中證實(shí)，F(xiàn)LCN敲除導(dǎo)致S6K磷酸化水平降低[13]，此結(jié)果提示FLCN是mTOR通路正調(diào)控因子。FLCN在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中如何調(diào)控AMPK信號(hào)通路和mTOR信號(hào)通路尚未闡明。FLCN在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中研究較少，其作用分子機(jī)制尚不清楚。本研究通過(guò)干擾和過(guò)表達(dá)FLCN，檢測(cè)下游蛋白表達(dá)情況，探討FLCN在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中功能，豐富乳腺上皮細(xì)胞代謝及泌乳調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，為進(jìn)一步提高乳品質(zhì)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本試驗(yàn)所用細(xì)胞均為乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期保存的荷斯坦奶牛乳腺上皮細(xì)胞[14]。AMPKα抗體、Phospho-AMPKα抗體（購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司），F(xiàn)NIP1抗體（購(gòu)自Abcam公司），β-actin、mTOR抗體、p-mTOR抗體、兔IgG/FITC、caspase3抗體（購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司），胎牛血清（FBS)、DMEM/F12（購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司），Lip 2000試劑、Trizol（購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司），HRP辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗、ECL發(fā)光檢測(cè)試劑（購(gòu)自北京蘭杰柯科技有限公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

奶牛乳腺上皮細(xì)胞（BMECs）分離自荷斯坦奶牛乳腺組織。奶牛乳腺上皮細(xì)胞在DMEM/F12中添加10%胎牛血清和兩種抗生素（青霉素10 mg·L-1，鏈霉素10 mg·L-1）中培養(yǎng)。細(xì)胞在DMEM/F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，然后處理。以AMPK激活劑AICAR（0.5 mmol·L-1）和抑制劑Compound C（20μm·L-1）作用BMECs 60 min，D-Hanks鹽溶液作為對(duì)照。葡萄糖饑餓時(shí)，磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞兩次，然后在不含葡萄糖和丙酮酸的DMEM培養(yǎng)液中孵育。以DMEM/F12全培養(yǎng)基作為對(duì)照。

1.3 免疫熒光試驗(yàn)

冷凍切片機(jī)打開(kāi)至-20℃，將冷凍的各時(shí)期組織取出，修剪為1 cm3塊狀，包埋，冷凍切片，厚度約為8μm。將組織切片用4%多聚甲醛溶液固定，去除4%多聚甲醛并用含有0.1%吐溫的磷酸鹽緩沖液清洗，封片劑在室溫封片1 h。FLCN一抗在4℃條件下封閉組織12 h，磷酸鹽緩沖液清洗3次后用FITC標(biāo)記的山羊抗兔二抗37℃避光孵育1 h，棄二抗后清洗3次，用含有DAPI抗熒光淬滅劑滴加至組織切片上，激光共聚焦觀察組織切片。

1.4 免疫共沉淀

棄掉細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液清洗3次，細(xì)胞刮刀將含有RIPA裂解液的細(xì)胞刮下。細(xì)胞裂解液在4℃搖晃60 min，14 000 g離心5 min，以清除細(xì)胞碎片等。含等量蛋白（200μg）裂解液分別用FLCN和IgG抗體在4℃下孵育過(guò)夜，用protein A+G瓊脂糖凝珠在4℃下孵育3 h。用裂解緩沖液洗滌3次?；厥赵赟DS樣品緩沖液中相關(guān)蛋白復(fù)合物并進(jìn)行后續(xù)Western blot試驗(yàn)。

1.5 Western blot

將細(xì)胞用細(xì)胞裂解液刮下，14 000 g離心5 min，加入5×上樣緩沖液，95℃下煮15 min備用。取200μg蛋白電泳，電泳后將凝膠轉(zhuǎn)移至NC膜上，脫脂牛奶封閉2.5 h后，一抗過(guò)夜孵育，用TBST洗膜3次后，37℃孵育二抗1 h，清洗后在NC膜上滴加發(fā)光液，在化學(xué)發(fā)光成像儀中顯影。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)值均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。定量數(shù)據(jù)通過(guò)對(duì)數(shù)變換歸一化，并使用SPSS 16.0軟件進(jìn)行One Way ANOVA對(duì)組間均值作統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。其中“*”表示P＜0.05，差異顯著；P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 FLCN在牛乳腺中免疫組織學(xué)定位

為探究FLCN在奶牛乳腺組織青春期、泌乳期、干奶期的表達(dá)情況，本試驗(yàn)采用免疫熒光檢測(cè)方法，分析青春期、泌乳期、干奶期奶牛乳腺組織中FLCN表達(dá)情況。DAPI標(biāo)記細(xì)胞核，異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記FLCN。激光共聚焦結(jié)果顯示，F(xiàn)LCN蛋白在乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞表達(dá)，由圖1可知，青春期（圖1B）和泌乳期（圖1D）綠色熒光信號(hào)多于干奶期（圖1F）。由此得出結(jié)論，F(xiàn)LCN在青春期和泌乳期表達(dá)量高于干奶期。說(shuō)明FLCN可能參與乳腺發(fā)育和泌乳。

圖1 FLCN在奶牛乳腺發(fā)育各時(shí)期定位Fig.1 Location of FLCN in mammary gland development of dairy cows

2.2 FLCN通過(guò)FNIP1與AMPK結(jié)合

為證實(shí)AMPK與FLCN、FNIP1作用，采用AMPK、FNIP1特異性抗體及同源IgG抗體進(jìn)行免疫共沉淀，Western blot檢測(cè)沉淀中AMPK、FLCN、FNIP1蛋白表達(dá)情況。制備AMPK抗體（AMPK組）和兔IgG抗體（IgG組）樣品，采用SDSPAGE電泳分離，質(zhì)譜檢測(cè)。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，不同分子質(zhì)量蛋白均較好分離。與對(duì)照組相比，免疫共沉淀組在63和135 ku處出現(xiàn)不同靶條帶（見(jiàn)圖2），根據(jù)蛋白量推測(cè)蛋白可能是FLCN和FNIP1。用AMPK抗體進(jìn)行Co-IP試驗(yàn)，細(xì)胞全蛋白Input組和IP組檢測(cè)到FLCN和FNIP1；以FNIP1抗體進(jìn)行Co-IP實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞全蛋白Input組和IP組檢測(cè)到AMPK和FLCN。Co-IP結(jié)果顯示AMPK與FLCN和FNIP1之間有特異性結(jié)合，證明AMPK與FLCN和FNIP1有相互作用。

圖2 SDS電泳結(jié)果Fig.2 Result of SDS electrophoresis

圖3 IP組為AMPK和FNIP1時(shí)檢測(cè)AMPK、FLCN、FNIP1蛋白Fig.3 AMPK,FLCN and FNIP1 proteins were detected when THE IP group was AMPK and FNIP1

2.3 FLCN干擾對(duì)AMPK/mTOR信號(hào)通路的影響

為進(jìn)一步驗(yàn)證FLCN對(duì)AMPK的調(diào)節(jié)作用，將試驗(yàn)分為陰性對(duì)照組（NC）、FLCN干擾組（KD）、添加AMPK激活劑組（AICAR）、FLCN干擾同時(shí)添加AMPK激活劑組（AICAR-siFLCN）、添加AMPK抑制劑組（Compound C）、FLCN干擾同時(shí)添加AMPK抑制劑組（Compound C-siFLCN）。常規(guī)轉(zhuǎn)染48 h后，更換培養(yǎng)基，分別加入AMPK激活劑阿卡地新（Acadesine，AICAR）和抑制劑化合物C（Compound C），培養(yǎng)后收集蛋白樣品。Western blot檢測(cè)FLCN、AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、CyclinD1和β-酪蛋白（CSN2）的表達(dá)。如圖4所示，當(dāng)沉默F(xiàn)LCN，AMPK、p-AMPK表達(dá)升高，F(xiàn)LCN、mTOR、p-mTOR、CyclinD1和CSN2表達(dá)降低。說(shuō)明FLCN負(fù)調(diào)控AMPK，正調(diào)控mTOR，促進(jìn)細(xì)胞增值殖和乳蛋白合成。在沉默F(xiàn)LCN的同時(shí)，添加AMPK激活劑結(jié)果顯示，AMPK、p-AMPK表達(dá)升高，F(xiàn)LCN、mTOR、p-mTOR、CyclinD1和CSN2表達(dá)降低。在沉默F(xiàn)LCN的同時(shí)，添加AMPK抑制劑結(jié)果顯示，F(xiàn)LCN、AMPK、p-AMPK表達(dá)升高，p-mTOR表達(dá)降低。綜上，F(xiàn)LCN負(fù)調(diào)控AMPK，正調(diào)控mTOR，AMPK正調(diào)控FLCN。

圖4 FLCN干擾分別與AICAR和Compound C共同處理時(shí)相關(guān)蛋白表達(dá)及灰度掃描分析Fig.4 Related protein expression and gray scan analysis when FLCN interference was co-processed with AICAR and Compound C

2.4 FLCN過(guò)表達(dá)對(duì)AMPK/mTOR信號(hào)通路的影響

試驗(yàn)分為空載體組（EV）、FLCN過(guò)表達(dá)組（FLCN OE）、添加AMPK激活劑組（AICAR-EV）、FLCN過(guò)表達(dá)同時(shí)添加AMPK激活劑組（AICAROE）、添加AMPK抑制劑組（Compound C-EV）、FLCN過(guò)表達(dá)同時(shí)添加AMPK抑制劑組（Compound C-OE）。常規(guī)轉(zhuǎn)染48h后，更換培養(yǎng)基，加入AMPK激活劑（AICAR）和抑制劑（Compound C），收集蛋白樣品。Western blot檢測(cè)FLCN、AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、CyclinD1和CSN2變化情況。如圖所示，當(dāng)FLCN過(guò)表達(dá)時(shí)，與對(duì)照組相比，AMPK、p-AMPK表達(dá)降低，F(xiàn)LCN、mTOR、p-mTOR、CyclinD1和CSN2表達(dá)升高。當(dāng)加入AMPK激活劑時(shí)，F(xiàn)LCN、AMPK、p-AMPK表達(dá)升高，p-mTOR表達(dá)降低。當(dāng)加入AMPK抑制劑時(shí)，F(xiàn)LCN、AMPK、p-AMPK表達(dá)降低，p-mTOR表達(dá)升高。根據(jù)FLCN過(guò)表達(dá)及FLCN過(guò)表達(dá)與AMPK激活抑制劑聯(lián)合處理結(jié)果，可得出FLCN負(fù)調(diào)控AMPK，正調(diào)控mTOR，AMPK正調(diào)控FLCN，負(fù)調(diào)控mTOR。AMPK與FLCN形成負(fù)反饋關(guān)系。

2.5 FLCN-AMPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)乳腺上皮細(xì)胞的能量代謝

無(wú)糖處理培養(yǎng)后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。Western blot檢測(cè)AMPK和FLCN蛋白表達(dá)。與對(duì)照組相比，無(wú)糖組培養(yǎng)后AMPK和FLCN蛋白表達(dá)量顯著增加。試驗(yàn)分為空白對(duì)照組（Blank）和無(wú)糖處理組（Glucose free）。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到瓶底70%～80%時(shí)，更換無(wú)糖培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，收集細(xì)胞樣本。Western blot檢測(cè)FLCN、AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、CyclinD1、p-ACC和CSN2。與對(duì)照組相比，經(jīng)過(guò)無(wú)糖處理后，F(xiàn)LCN、AMPK、p-AMPK蛋白表達(dá)顯著升高，mTOR、pmTOR、CyclinD1、CSN2和p-ACC表達(dá)降低。

圖5 FLCN過(guò)表達(dá)分別與AICAR和Compound C共同處理時(shí)相關(guān)蛋白表達(dá)及灰度掃描分析Fig.5 Expression of related proteins and gray scan analysis when FLCN overexpression was co-processed with AICAR and Compound C

圖6 無(wú)糖處理后乳蛋白合成和細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)及灰度分析Fig.6 Milk protein synthesis and expression of cell proliferation-related proteins and gray scale analysis after glucose-free treatment

3 討論

FLCN分子質(zhì)量為64 ku，編碼579個(gè)氨基酸，具有腫瘤抑制功能。FLCN在不同物種中均為高度保守蛋白。目前已知FLCN參與多種代謝途徑和細(xì)胞過(guò)程的調(diào)控，并在腎臟、乳腺等組織中表達(dá)[15]。但目前FLCN在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中研究較少。

免疫熒光結(jié)果顯示FLCN在乳腺上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。Laviolette等研究表明FLCN在溶酶體表達(dá)[16]與本試驗(yàn)結(jié)果一致。本試驗(yàn)結(jié)果還表明，F(xiàn)LCN在青春期和泌乳期高表達(dá)，干奶期低表達(dá)。哺乳動(dòng)物乳腺呈動(dòng)態(tài)性變化，主要過(guò)程包括青春期、妊娠期、泌乳期和干奶期。青春期，乳腺組織發(fā)育和代謝緩慢，主要由不規(guī)則脂肪和結(jié)締組織構(gòu)成。泌乳期時(shí)，上皮細(xì)胞開(kāi)始增殖和分化，合成乳糖和乳脂所需酶開(kāi)始出現(xiàn)；泌乳開(kāi)始后，光鏡下可見(jiàn)小葉內(nèi)充滿含乳汁的腺泡，小葉內(nèi)導(dǎo)管較明顯。FLCN在青春期和泌乳期高表達(dá)說(shuō)明其功能可能與乳腺組織發(fā)育及泌乳相關(guān)。

為進(jìn)一步探討FLCN在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中作用，本研究通過(guò)免疫共沉淀試驗(yàn)檢測(cè)與FLCN相互作用的蛋白，結(jié)果顯示AMPK抗體沉淀產(chǎn)物中檢測(cè)到FNIP1和FLCN，F(xiàn)NIP1抗體沉淀產(chǎn)物中檢測(cè)到AMPK和FLCN。這與Baba等研究發(fā)現(xiàn)FLCN及其結(jié)合蛋白FNIP1與AMPK相互作用[6]，Reyes等研究發(fā)現(xiàn)FNIP1與AMPK存在相互作用[17]結(jié)果相同，表明FLCN、FNIP1和AMPK存在相互作用。FLCN可能是通過(guò)AMPK信號(hào)通路在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中發(fā)揮作用。

為明確FLCN在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中作用，采用沉默和過(guò)表達(dá)FLCN，同時(shí)添加AMPK激活劑和抑制劑，結(jié)果表明AMPK激活時(shí)，F(xiàn)LCN蛋白表達(dá)升高，mTOR、p-mTOR、Cyclin D1和CSN2表達(dá)降低。AMPK活性抑制時(shí)結(jié)果則相反。研究結(jié)果表明AMPK正調(diào)控FLCN表達(dá)，負(fù)調(diào)節(jié)mTOR表達(dá)及活性，抑制細(xì)胞增殖和乳蛋白合成。結(jié)合前人研究結(jié)果FLCN過(guò)表達(dá)抑制AMPK表達(dá)及磷酸化，AMPK激活反而促進(jìn)FLCN表達(dá)，表明AMPK與FLCN形成負(fù)反饋?zhàn)饔谩ingras等研究表明AMPK信號(hào)是FLCN的正調(diào)控因子[18]，與本研究結(jié)果一致?；蚋蓴_和過(guò)表達(dá)試驗(yàn)表明FLCN是mTOR、cyclin D1、caspase3、CSN2信號(hào)通路的正調(diào)控因子，同時(shí)也受AMPK正調(diào)控，與之前報(bào)道一致[19]。AMPK激活劑和抑制劑在FLCN干擾和過(guò)表達(dá)時(shí)刺激AMPK的表達(dá)水平，本試驗(yàn)結(jié)果表明AMPK正調(diào)控FLCN表達(dá)，F(xiàn)LCN抑制AMPK表達(dá)。說(shuō)明FLCN參與AMPK和mTOR信號(hào)通路，在細(xì)胞能量調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，促進(jìn)乳蛋白表達(dá)。mTOR是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖途徑關(guān)鍵信號(hào)通路，在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可通過(guò)mTOR信號(hào)通路調(diào)節(jié)乳蛋白合成。Li等研究表明，沉默F(xiàn)LCN降低mTOR水平表達(dá)[20]，Hartman等研究表明，沉默F(xiàn)LCN導(dǎo)致mTORC1的活性標(biāo)志蛋白核糖體蛋白S6K磷酸化水平降低[21]，這些結(jié)果表明FLCN正調(diào)控mTOR信號(hào)通路，與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致。但Wada等研究表明，沉默F(xiàn)LCN導(dǎo)致小鼠胚胎mTORC1活性升高[22]，與本試驗(yàn)結(jié)果相反。推測(cè)原因?yàn)榧?xì)胞類(lèi)型和實(shí)驗(yàn)條件等因素，或是沉默F(xiàn)LCN初期，mTOR被抑制，隨之被其他因素影響而激活mTOR，后續(xù)仍需試驗(yàn)證實(shí)。

為進(jìn)一步闡明FLCN在乳腺上皮細(xì)胞中能量代謝調(diào)節(jié)作用，分別將奶牛乳腺上皮細(xì)胞在正常和無(wú)糖條件下培養(yǎng)。無(wú)糖處理后FLCN、AMPK和p-AMPK表達(dá)升高，mTOR、p-mTOR CyclinD1、CSN2和p-ACC表達(dá)降低。AMPK是哺乳動(dòng)物細(xì)胞重要的能量感受器，當(dāng)細(xì)胞能量供應(yīng)不足時(shí)，AMPK信號(hào)通路被激活。結(jié)果表明，無(wú)糖處理后激活A(yù)MPK信號(hào)通路，抑制mTOR信號(hào)通路，細(xì)胞周期蛋白和乳蛋白合成被抑制。結(jié)果表明，當(dāng)細(xì)胞經(jīng)無(wú)糖處理能量缺乏時(shí)，細(xì)胞能量感受器AMPK被激活，同時(shí)FLCN表達(dá)升高調(diào)節(jié)AMPK活性，用于維持細(xì)胞存活。Baba等研究結(jié)果表明，F(xiàn)LCN參與mTOR信號(hào)通路和細(xì)胞能量代謝調(diào)控[6]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)LCN參與奶牛乳腺上皮細(xì)胞的能量代謝調(diào)節(jié)，F(xiàn)LCN充當(dāng)mTOR功能的正調(diào)節(jié)子和AMPK功能的負(fù)調(diào)節(jié)子參與細(xì)胞內(nèi)能量代謝。FLCN和AMPK之間存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)，保證細(xì)胞內(nèi)能量代謝穩(wěn)定調(diào)節(jié)，維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。

綜上所述，本試驗(yàn)表明AMPK是FLCN正調(diào)控因子，F(xiàn)LCN被鑒定為AMPK負(fù)調(diào)控因子。Schmidt等在線蟲(chóng)研究中，F(xiàn)LCN缺失導(dǎo)致AMPK結(jié)構(gòu)性激活，增加自噬以及增加能量和代謝應(yīng)激的激活[23]。FLCN與AMPK之間存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)，這對(duì)于維持細(xì)胞代謝穩(wěn)定以及內(nèi)環(huán)境至關(guān)重要。本研究首次證明FLCN通過(guò)AMPK-mTOR信號(hào)軸參與乳腺上皮細(xì)胞能量代謝調(diào)控，明確FLCN在乳腺發(fā)育中作用，為人工改善乳品質(zhì)、提高乳產(chǎn)量提供理論基礎(chǔ)。