不同白粉病抗性甜瓜材料葉片組織病理學及接種后ROS代謝相關酶基因表達分析

高 鵬，徐 楠，張曼琳，劉 泰，丁 卓，崔浩楠，張?zhí)┓?/p>

（1.農業(yè)農村部東北地區(qū)園藝作物生物學與種質創(chuàng)制重點實驗室，哈爾濱 150030；2.東北農業(yè)大學園藝園林學院，哈爾濱 150030；3.河北科技師范學院園藝科技學院，河北 昌黎 066600）

甜瓜（Cucumis meloL.）為葫蘆科甜瓜屬一年生草本作物，種植規(guī)模較大[1]。白粉病為植物生長階段普遍發(fā)生的真菌病害，在露地以及溫室條件下廣泛發(fā)生，造成產品品質與產量降低。甜瓜白粉病發(fā)病時葉片表面產生大量白色斑粉，嚴重時全株遍布白粉，影響葉片光合能力，產生生產抑制，造成植株減產，甚至絕產[2]。目前，世界范圍內致使白粉病發(fā)生的主要是二孢白粉菌（Golovinomyces cichoracearumL.，Gc）和單囊殼白粉菌（Podosphaera xanthii，Px）[3]，分別分化出2個和11個生理小種，我國以單囊殼白粉菌1號和2F生理小種為主[4]。白粉菌侵染植物時，先由植物表皮侵入植物體內，然后分生孢子萌發(fā)芽管和吸器在表皮細胞定植進而在細胞間隙產生大量菌絲。因此，植物組織形態(tài)結構在與病原菌對抗過程中具有關鍵作用[5]。張詠梅等研究證實，在白粉菌侵染苜蓿后，不同抗性苜蓿材料柵欄細胞及葉肉細胞均發(fā)生一定程度形態(tài)改變，抗病苜蓿材料在被白粉菌侵染后，柵欄細胞排列逐漸松散且形狀由原來的長圓形變?yōu)閳A形[6]。王方等研究證實，在炭疽病侵染棗樹葉片后，抗病性強品種上表皮和柵欄組織厚度大，對炭疽病抗性也越強[7]。不同抗性苦瓜材料葉片結構研究發(fā)現，野生抗病苦瓜材料在茸毛數量及氣孔密度上均低于感病栽培材料，但在結構緊密度上卻高于高感栽培材料[8]。李敏等研究證實，柑桔在潰瘍病菌脅迫下，抗性與葉片下表皮氣孔存在顯著差異，4份柑桔材料氣孔密度與抗性呈正相關，此結構可在早期有效篩選柑桔是否抗?jié)儾9]。植物被病原菌侵染后，超氧化物歧化酶（Superoxide dimutase，SOD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）、過氧化物酶（Peroxidase，POD）等酶類可高效去除活性氧物質（Reactive oxygen species，ROS）[10]?？菸【{迫下南瓜材料中CAT、POD、SOD活性均出現上升或下降情況，南瓜抗性與早期SOD和POD活性呈正相關[11]。郭艷紅等研究證實，月季被黑斑病侵染后，抗病月季材料與感病月季材料中SOD和POD活性均出現上升情況，接菌后抗病月季中SOD和POD活性一直處于較高水平，說明高水平SOD和POD活性更有利于抵抗病原菌[12]。

本研究分析抗感甜瓜材料葉片組織結構、表皮細胞、氣孔等方面差異；利用考馬斯亮藍和DAB染色方法觀察葉片上白粉病菌形成和H2O2累積；測定甜瓜白粉菌侵染后葉片中與ROS產生相關的CAT、SOD和POD基因表達量，闡明不同白粉病抗性甜瓜葉片組織結構、ROS積累差異。

1 材料與方法

1.1 甜瓜材料與病原菌準備

供試甜瓜材料由東北農業(yè)大學園藝園林學院西甜瓜分子遺傳育種研究室提供。根據實驗室前期抗感性試驗結果，選擇抗病材料M4-125和M4-118與感病材料M4-116和M1-101。供試材料均為純合自交系，且M1-101為薄皮甜瓜，其余均為厚皮甜瓜。供試材料種植于東北農業(yè)大學設施園藝工程中心，每份材料種植5株，3次重復；本研究試驗病菌P.xanthii的1號生理小種的采集純化也在此處完成。試驗過程中溫度22～27℃，濕度60%～70%，采取雙蔓整枝方式對甜瓜材料作田間管理。

1.2 甜瓜材料病菌接種與抗性分級

在供試甜瓜未感病葉片上均勻噴灑濃度為1×106孢子懸浮液，14 d調查發(fā)病情況，每份材料重復5次。發(fā)病情況參考馬鴻艷等[13]標準并統(tǒng)計病情指數（DI），每株取3片真葉用于統(tǒng)計分析，生物學重復3次?？剐裕≧esistance，R）程度分為高抗、中抗、中感、高感四類，相對抗病指數為0～30、30～60、60～90和90以上。

1.3 甜瓜葉片組織結構觀察

1.3.1 甜瓜葉片細胞特征觀察

取長勢良好甜瓜未感病且葉面積一致葉片用于石蠟切片觀察，具體操作參考楊捷頻方法[14]。通過操作物鏡微尺（ZX-CX40M）測定葉片上表皮細胞厚度（Upper epidermal cell thickness，UCT）、下表皮細胞厚度（Lower epidermal cells thickness，LCT）、柵欄組織厚度（Palisade tissue thickness，PT）、海綿組織厚度（Spongy tissue thickness，ST）和葉片厚度（Leaf thickness，LT），15次重復。計算結構緊密度（CTR）=（PT/LT）×100%、疏松度（SR）=（ST/LT）×100%。

1.3.2 甜瓜葉片表皮結構觀察

利用東北農業(yè)大學公共基礎教學實驗中心一樓試驗室掃描電鏡觀察并拍攝未感病甜瓜葉片表皮細胞及氣孔形態(tài)；具體操作參考Graham等方法[15]。表皮細胞緊密度（EC）=視野總表皮細胞個數/視野總面積（mm2）×100%。

1.4 甜瓜葉片接菌后考馬斯亮藍染色和DAB染色觀察

利用光學顯微鏡（ZX-CX40M）（10×40倍）觀察白粉菌侵染后從0 h開始截止72 h，間隔24 h，共4個時間點，記錄甜瓜葉片染色情況。具體操作參考饒維橋等[16]和Daudi等[17]方法。

1.5 甜瓜葉片接菌后指標測定

根據試劑盒（ELISA，武漢）說明書測定H2O2含量、CAT、SOD和POD活性。從0 h開始截止72 h，間隔24 h，共4個時間點，生物學重復和技術重復均3次。

1.6 ROS代謝相關酶（CAT、SOD、POD）基因表達量測定

利用試劑盒（Toyobo，東京）作熒光定量PCR，確定接種白粉菌后4個時間點活性氧（ROS）代謝相關酶基因表達情況，生物學與技術重復均3次。

1.7 數據分析與處理

采用Microsoft Excel 2010、GraphPad Prism 8.0和SPSS 25.0作數據分析與處理。

2 結果與分析

2.1 不同甜瓜抗性分級及白粉菌侵染過程觀察

通過在溫室中對2份抗病材料與2份感病材料開展白粉病接種鑒定，其DI如表1所示，其中M4-116、M1-101、M4-118、M4-125對應DI分別為90.75、73.58、42.56、25.33，對應白粉病抗性分別為HS、MS、MR、HR?？共『透胁〔牧吓c前期抗感性試驗選育情況一致。

表1 不同甜瓜品系白粉菌侵染后抗感鑒定分析Table 1 Identification and analysis of resistance to powdery mildew infection in different melon strains

如圖1所示，感病材料M4-116和M4-101在白粉菌侵染后0 h，分生孢子未萌發(fā)吸器和菌絲；24 h后可觀察到吸器與菌絲出現；48 h觀察到萌發(fā)管出現分支，菌絲不斷增加并向周圍擴散；當受白粉菌侵染后72 h大量分生孢子梗出現?？共〔牧螹4-118和M4-125受白粉菌侵染0 h后與感病材料情況相同，白粉菌侵染24 h后出現分生孢子萌發(fā)但未發(fā)展產生初級菌絲。相比感病材料存在差異，M4-118在白粉菌侵染后48～72 h分生孢子菌絲發(fā)育被限制，未觀察到萌發(fā)管分支產生，也未見菌絲大規(guī)模擴散（見圖1K-L），抗病材料M4-125遭受白粉菌侵染后48 h，菌絲逐漸向周圍擴散，白粉菌侵染72 h后菌絲生長情況較為緩慢，未觀察到分生孢子梗出現（見圖1O-P）。

圖1 不同抗性甜瓜品系白粉菌絲發(fā)育特征Fig.1 Characteristics of mycelia development of melon strains with different resistance

2.2 甜瓜品系葉片縱切面結構特征

石蠟切片觀察結果如圖2所示，可觀察到在抗病與感病材料中，葉片上表皮和下表皮細胞均呈現單層結構，且在每份甜瓜材料中細胞排列情況不同。與2份感病材料相比，可看出抗病材料M4-125與M4-118上下表皮細胞整齊程度較感病材料M4-116和M1-101差，但柵欄組織整齊度和清晰度優(yōu)于感病材料M4-116和M1-101，且在海綿組織中也觀察到同樣現象。

圖2 甜瓜品系葉片縱切面結構特征Fig.2 Characteristics of longitudinal section structure of melon strains leaf

如表2所示，對4份材料分析可知感病材料M1-101上表皮、海綿組織、葉片厚度高于其他3份材料，且與抗病材料M4-125和M4-118上表皮、海綿組織、葉片厚度相比差異顯著。感病材料M1-101葉片柵欄組織厚度最高，且與抗病材料M4-118存在顯著差異。2份抗病甜瓜材料與2份感病甜瓜材料CTR及SR統(tǒng)計分析表明，抗病材料M4-125和M4-118葉片結構致密，緊密度高；而感病材料M4-116和M1-101葉片結構較為松散，其SR也顯著高于抗病材料M4-125和M4-118。

表2 甜瓜品系葉片結構之間顯著性差異Table 2 Significant differences in leaf structure among melon strains

2.3 甜瓜品系表皮細胞緊密度與氣孔分析

分析2份抗病材料和2份感病材料葉片EC可知（見表3），葉片EC最大的是抗病材料M4-118，其緊密程度為19.20±1.74；其次是抗病材料M4-125，緊密程度為16.73±1.62。且2份抗病材料葉片EC顯著高于感病材料M4-116和M1-101。根據掃描電鏡觀察（見圖3），可發(fā)現抗感材料氣孔形態(tài)均為長橢圓形。由表3可知，在氣孔數量方面感病材料M4-116與抗病材料差異顯著；同時感病材料在氣孔長度上與抗病材料相比也存在顯著差異。

圖3 甜瓜品系表皮細胞與氣孔形態(tài)Fig.3 Morphology of epidermal cells and stoma in melonstrains

表3 不同甜瓜品系氣孔數量與氣孔長度分析Table 3 Analysis of stoma number and stoma length in different melon strains

2.4 甜瓜品系對白粉病抗性與葉片結構之間相關關系

選擇2份抗病材料與2份感病材料作白粉病抗性與葉片結構之間相關關系分析，根據表4可知，與甜瓜白粉病抗性之間存在極顯著相關，分別為CTR、SR及EC，相關性分別是正相關、負相關和正相關，相關系數分別為0.844、-0.927和0.973。

表4 甜瓜品系對白粉病抗性與葉片結構之間相關關系Table 4 Correlation between leaf structure and powdery mildew resistance of melon strians

2.5 不同白粉病抗性甜瓜品系葉片H2O2含量及酶活性測定

利用DAB染色觀察白粉菌侵染抗感甜瓜后葉片活性氧迸發(fā)情況，記錄葉片中H2O2變化過程。根據圖4可知，高感材料M4-116、中感材料M4-101和中抗材料M4-118在接菌后48和72 h可檢測到細胞中少量H2O2存在。而高抗材料M4-125葉片細胞在白粉菌侵染后0～24 h并未檢測到H2O2，侵染后48～72 h，在細胞中檢測到較多H2O2。

圖4 白粉病菌侵染后甜瓜品系葉片中H2O2變化過程Fig.4 Changes of H2O2 in melon strains leaves after powdery mildew infection

采集白粉菌脅迫后4個時期甜瓜葉片，根據圖5A可知H2O2變化情況，高感材料M4-116、中感材料M4-101以及中抗材料M4-118遭受白粉菌脅迫后H2O2變化情況無顯著差異；而高抗材料M4-125遭受白粉菌脅迫后，H2O2含量在48 h有明顯上升趨勢且72 h時下降；H2O2測定和DAB染色結果表明白粉菌脅迫后48 h存在大量H2O2。根據圖5B可知，白粉菌侵染后24 h中抗材料M4-118的CAT活性上升，其他3份材料均顯著下降，且高抗材料M4-125降低程度小于感病材料；接種后72 h，高抗材料M4-125的CAT活性在4份甜瓜材料中最低。根據圖5C可知，2份抗病甜瓜材料被白粉菌侵染后SOD活性呈逐漸上升趨勢，但在接菌后4個時間點上升和下降情況并不一致。白粉菌脅迫下高感材料M4-116和中感材料M1-101的SOD活性變化較為復雜且無規(guī)律可循，但侵染后48～72 h活性均出現降低。根據圖5D可知，白粉菌侵染后4份甜瓜材料POD活性持續(xù)上升，且感病材料在白粉菌侵染后0～48 h，POD活性水平始終大于2份抗病材料，但不同抗病材料之間抗性與POD活性在4個時間點變化不同。

圖5 4份甜瓜品系白粉菌侵染后H2O2、CAT、SOD和POD活性變化Fig.5 Changes of H2O2,CAT,SOD and POD activities in four melon strains infected with powdery mildew

2.6 白粉菌侵染后甜瓜活性氧代謝相關基因表達

本試驗利用熒光定量PCR技術測定高抗材料M4-125和高感材料M4-116在白粉菌侵染后4個時間點CAT、SOD、POD基因表達量。從本實驗室甜瓜抗白粉病轉錄組研究成果中（NCBI登錄號：SRX2442184和SRX2442273），篩選出對白粉病有明顯響應活性氧代謝相關基因。分別為CAT基因MELO3C026532、MELO3C017024、MELO3C014643，SOD基 因MELO3C014007、MELO3C020487和POD基 因MELO3C014655、MELO3C018672。由 圖6可知，白粉菌侵染后3個CAT基因在高抗材料M4-125中表達量均出現明顯升高趨勢；而在高感材料M4-116中MELO3C017024基因在接菌24 h后表現明顯下降趨勢，其他兩個基因表達量并未明顯下降。由圖6可知，白粉菌侵染后48 h在高抗材料M4-125中MELO3C014007和MELO3C020487基因表達量均出現明顯增加趨勢，但MELO3C020487在72 h表達量略下降；而MELO3C014007和MELO3C020487基因在高感材料M4-116接菌后0～48 h，表達量未表現升高或降低，但在48～72 h基因MELO3C020487表達量顯著上調。由圖6可知，2個POD基因在白粉菌侵染后表達量變化在高抗材料M4-125中也有所區(qū)別，其中MELO3C014-655基因表達量出現明顯升高趨勢，而MELO3C018672基因在白粉菌侵染48 h后表達量才開始逐漸上升，且在72 h時表達量又出現下降趨勢，在高感材料M4-116中ME-LO3C014655基因表達量呈先升高后降低，而MELO3C018672基因表達量并未出現明顯上升或下降。

圖6 白粉菌侵染后甜瓜活性氧代謝相關基因表達Fig.6 Expression of genes related to ROS metabolism in melon after powdery mildew infection

3 討論

陳夕軍等研究證實，在黃瓜抵御白粉菌侵染過程中，黃瓜葉細胞是否整齊以及細胞壁薄厚程度均在此過程中發(fā)揮重要作用[18]。張詠梅研究發(fā)現，慶陽苜蓿整齊緊實的柵欄組織，細胞致密的海綿組織在抵御病原菌侵入時發(fā)揮積極作用[6]。田麗波等研究證實，抗白粉病苦瓜品系葉結構緊密度較高，柵欄及海綿組織相比于感病苦瓜品系更密實，且苦瓜對白粉病抗性與葉片厚度及上下表皮厚度存在相關性[8]，上述研究成果均證實葉片結構緊密性、結構松散程度與植株抗病性密切相關，在植株抵御病原菌入侵過程中發(fā)揮重要功能。本研究掃描電鏡結果表明，2份抗病材料柵欄組織與海綿組織清晰度高于2份感病材料；2份感病材料葉片緊密程度顯著低于2份抗病材料，疏松程度則反之，與前人研究成果相同[6,8,18]。4份甜瓜材料葉片、上下表皮差異不顯著，推測是與本試驗所用材料葉片結構有關。

本研究中不同甜瓜品系葉片表面氣孔數量和長度存在差異，與不同獼猴桃品系葉片研究結果一致[19]。通過石蠟切片可知，2份抗病材料葉片表皮細胞排列不規(guī)則且單位面積表皮細胞數高于2份感病材料。本研究分析表皮細胞緊密度相關性發(fā)現，該結構與抗性之間呈正相關。因此，表皮細胞結構緊密程度在抑制白粉菌對甜瓜侵染過程中發(fā)揮關鍵作用。

ROS作為一種信號分子，含量過高致使植株細胞出現膜脂過氧化，影響膜結構和功能[20]。本試驗表明，不同甜瓜材料對白粉病菌脅迫響應存在區(qū)別。研究表明，CAT、POD和SOD在植物抵御病害侵染過程中發(fā)揮重要作用[21-22]。陳亮等研究發(fā)現西瓜在被枯萎病菌侵染后，CAT活性呈現先升后降的趨勢[23]，與本研究中抗材料M4-118 CAT活性變化一致。

一般情況下，生物脅迫導致植物POD活性升高，如瓠瓜[24]、小麥[25]、豌豆[26]等，且POD活性隨抗病能力增強而升高，本研究4份材料POD活性在白粉菌入侵過程中均顯著升高，但POD活性變化與抗性并無相關性。本研究4份材料在白粉菌脅迫72 h后，SOD活性均上升，這與趙衛(wèi)星等在病毒病侵染西瓜葉片的研究中結論相符[27]。但高抗材料M4-125的H2O2活性在白粉菌侵染后0～48 h逐步遞增，結合染色觀察及SOD酶活性變化，推測H2O2過量加速被感染葉細胞死亡從而抵御白粉病菌脅迫。綜上所述，CAT、POD和SOD不同酶在抵御白粉菌入侵過程中發(fā)生反應，且該反應協(xié)同發(fā)生導致。

高抗材料M4-125的CAT與SOD基因表達量0～48 h呈升高趨勢，推測是因病菌脅迫導致植物葉片活性氧快速產生，引起表達量上升，這與郭靜在蔓枯病侵染甜瓜研究中結論一致[28]。祁靜靜等研究證實，CsKat01在感病柑橘中表達量與CAT活性呈正相關，H2O2含量呈負相關；推測CsKat01影響CAT活性及H2O2含量，從而決定柑橘是否抗病[29]。本研究高抗材料M4-125在接種白粉菌后48 h，POD基因表達量上升，推測高抗材料在白粉菌侵染后，固有防御系統(tǒng)被激活。曹璐璐研究證實，荔枝在霜疫霉脅迫下部分POD基因在抗病性強材料中表達量低，且在中抗和中感材料中均為部分被誘導表達[30]。

本研究表明，抗感材料由于自身調控抗性基因不同，導致有關酶活性存在差異，造成ROS相關基因表達不一致。

4 結論

a.分析CTR、SR以及EC與白粉病抗性相關性發(fā)現，這3個方面均與白粉病抗性呈顯著相關。

b.通過測定2份抗病材料與2份感病材料在白粉菌侵染后4個時間點CAT、SOD、POD活性變化，表明甜瓜抗病材料葉片受白粉病侵染時SOD、POD活性均呈顯著升高變化，但CAT活性卻降低，說明POD、SOD活性升高與CAT活性降低有利于甜瓜抵御白粉菌入侵。

c.高抗材料M4-125中ROS代謝相關酶基因對白粉菌具有一致的響應，即在白粉菌侵染后表達量顯著上調。