一株雛鵝星狀病毒分離鑒定及其致病性分析

劉春朋，王 萱，歐溢泉，鄭釗武，鐘雅靜，馬婷婷，王寶東，付 晶，魏文康

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動物科技學(xué)院，廣州 510225；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物基因研究中心，廣州 510640；3.遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，沈陽 110032）

近年來，鵝養(yǎng)殖數(shù)量快速增加，雛鵝痛風(fēng)與星狀病毒相關(guān)性研究報道日益增多。星狀病毒屬星狀病毒科，是一種非包膜RNA病毒，依據(jù)其基因型可劃分為兩類，分別是哺乳動物星狀病毒屬和禽星狀病毒屬[1-2]，哺乳動物星狀病毒屬主要感染人、牛和羊等，腹瀉是其主要癥狀之一；禽星狀病毒屬包括3個種，分別為禽類1～3型星狀病毒（AAstV1～AAstV3），其中，AAstV1含有火雞1型星狀病毒；AAstV2含有禽1型腎炎病毒和禽2型腎炎病毒；AAstV3含有火雞2型星狀病毒和鴨1型星狀病毒。部分報道的禽星狀病毒株仍未見分類。Donato等依據(jù)現(xiàn)有分類原則和標(biāo)準(zhǔn)，將未經(jīng)分類的禽星狀病毒分為4個種，分別命名為AAstV4～AAstV7。其中，AAstV4包含雞星狀病毒等；AAstV5包含鶴腎炎病毒等；AAstV6包含斑鳩鶴星狀病毒等；AAstV7包含野鶴星狀病毒等[3]。鴨星狀病毒于1965年在英國被首次報道，是禽星狀病毒屬中最早被發(fā)現(xiàn)的病毒，隨后有科學(xué)家通過電子顯微鏡技術(shù)鑒定出一株鴨星狀病毒[4]。2009年，我國某發(fā)病鴨廠首次分離得到鴨星狀病毒[5]。2017年2月，山東、安徽和遼寧等地均爆發(fā)鵝星狀病毒傳染病，主要感染對象為2周齡以內(nèi)雛鵝。臨床解剖發(fā)現(xiàn)，大部分病鵝內(nèi)臟器官表面及關(guān)節(jié)腔內(nèi)附著大量尿酸鹽沉積，伴隨腎臟腫大發(fā)白以及脾臟腫大等病理癥狀，發(fā)病率高達(dá)90%，死亡率達(dá)50%，對養(yǎng)鵝業(yè)造成巨大沖擊[6-7]。孫敏華認(rèn)為鵝星狀病毒是引起雛鵝痛風(fēng)病主要致病病原，自制疫苗免疫存在免疫無效或低效防治情況[8]。為進(jìn)一步了解不同地區(qū)星狀病毒毒株之間遺傳關(guān)系，本研究對廣東清遠(yuǎn)金羽豐國家保種鵝場引發(fā)雛鵝痛風(fēng)病原進(jìn)行分離、鑒定及致病性分析，為雛鵝痛風(fēng)病防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本和實驗動物來源

臨床樣品痛風(fēng)雛鵝由廣東清遠(yuǎn)金羽豐國家保種鵝場提供，雛鵝解剖后可見脾臟腫大，腎臟腫大且發(fā)白，肝臟表面有尿酸鹽沉積。采集尿酸鹽沉積明顯的心臟、肝臟、腎臟和脾臟組織，一部分固定于福爾馬林溶液中用于組織病理學(xué)觀察，一部分于-80℃超低溫冰箱保存，用于PCR鑒定。10日齡健康獅頭鵝鵝胚和1日齡健康雛鵝均由廣東省清遠(yuǎn)金羽豐鵝業(yè)有限公司提供。

1.2 主要試劑耗材

Viral RNA Kit試劑盒（購自美國OMEGA試劑有限公司），PrimeScript RT Master Mix（購自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司），DNA Marker（購自天根生化科技有限公司），2×TaqPCR StarMix（購自北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司），核酸染料、無酶離心管、50×TAE溶液（購自白鯊生物科技-上海橋星貿(mào)易有限公司）。

1.3 主要儀器

生化培養(yǎng)箱、低溫高速離心機(jī)和PCR儀（購自杭州博日生物科技有限公司），電泳儀和組織打磨器（購自德國IKA-WEREGMBH&Co.KG公司），紫外凝膠成像系統(tǒng)（購自上海天能生命科學(xué)有限公司），-80℃超低溫冰箱（購自賽默飛世爾科技公司）。

1.4 病料采集及處理

等量選取病料肝臟、腎臟和脾臟，合計2 g，加無菌PBS溶液研磨制成20%勻漿，勻漿經(jīng)5 000 r·min-1離心10 min后將其置于-80℃超低溫冰箱冷凍20 min，隨后立即解凍，反復(fù)凍融3次，最后將上清液置于-80℃超低溫冰箱保存待用。

固定于福爾馬林溶液中的內(nèi)臟器官（心臟、肝臟、腎臟和脾臟），經(jīng)脫水、透明、包埋、切片等處理后，采用蘇木素伊紅染色法（HE）對其染色，顯微鏡下觀察組織病理變化情況。

1.5 痛風(fēng)雛鵝中病原確定

1.5.1 引物設(shè)計與合成

針對我國鵝群常見病毒性傳染病，檢測痛風(fēng)雛鵝中可能存在的常見病原鵝星狀病毒（GAstV）、鵝呼腸孤病毒（GRV）、鵝腺病毒（EDS），根據(jù)文獻(xiàn)報道設(shè)計相關(guān)特異性引物[9-11]（見表1），送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 引物序列Table 1 Primers sequences

1.5.2 病毒核酸提取

參考文獻(xiàn)[12]方法提取病料中病毒核酸，利用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA，于-20℃冰箱保存。

1.5.3 常見病原PCR擴(kuò)增和序列分析

參照文獻(xiàn)[13]方法，對痛風(fēng)雛鵝中可能存在常見病原進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將星狀病毒PCR陽性產(chǎn)物進(jìn)行雙向測序。測序結(jié)果上傳至GenBank，通過BLAST功能進(jìn)行序列同源性比對。

1.6 痛風(fēng)雛鵝病原分離鑒定

將1.4制備獲得的勻漿經(jīng)0.22μm濾器過濾，并進(jìn)行梯度稀釋，稀釋液終末濃度為勻漿濃度的100、10-1、10-2和10-3，該稀釋液作為攻毒的病毒原液。病毒原液通過絨毛尿囊腔途徑接種于10日齡鵝胚(每個濃度接種6個鵝胚)，每個鵝胚接種0.2 mL，將接種后鵝胚放置于37℃孵化箱培養(yǎng)。每日觀察鵝胚生理狀態(tài)，記錄接種24 h內(nèi)死胚數(shù)量。接種96 h后，無菌條件下收集鵝胚，觀察胚體是否發(fā)生病變，將胚體參考1.4中方法制備上清液，接種到新鵝胚中，觀察鵝胚病理變化、活力及死亡情況。檢測鵝胚中病原并對其進(jìn)行序列分析。

1.7 動物回歸試驗

將24只2日齡體重相近、健康雛鵝隨機(jī)分為對照組和攻毒組，1.6中10-2組尿囊液和10-1組胚液按照2∶1混合作為攻毒原液。對照組肌肉注射2 mL生理鹽水；攻毒1組肌肉注射0.5 mL攻毒原液+1.5 mL生理鹽水；攻毒2組肌肉注射1.0 mL攻毒原液+1.0 mL生理鹽水；攻毒3組肌肉注射1.5 mL攻毒原液+0.5 mL生理鹽水，分組前檢測雛鵝健康性，確保未攜帶星狀病毒。于雛鵝4日齡時進(jìn)行攻毒，攻毒后第2、4、6天采集雛鵝泄殖腔拭子，檢測排毒情況。每日觀察雛鵝生理狀態(tài)并稱重。發(fā)現(xiàn)死亡雛鵝立即剖檢，觀察其內(nèi)臟器官病理變化，采集尿酸鹽沉積嚴(yán)重的肝臟、腎臟和脾臟，一部分固定于福爾馬林溶液中用于組織病理學(xué)觀察，一部分保存于-80℃超低溫冰箱用于星狀病毒PCR鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 痛風(fēng)雛鵝中病原確定

2.1.1 痛風(fēng)雛鵝剖檢

臨床剖檢時發(fā)現(xiàn)痛風(fēng)雛鵝心臟表面有尿酸鹽沉積，肝臟表面有明顯尿酸鹽沉積，腎臟發(fā)白腫大呈現(xiàn)明顯的“花斑腎”示病癥狀、脾臟腫大且有少量出血斑（見圖1）。

圖1 痛風(fēng)雛鵝剖檢Fig.1 Clinical autopsy in gout goslings

2.1.2 痛風(fēng)雛鵝組織病理學(xué)觀察

對采集的痛風(fēng)雛鵝內(nèi)臟器官HE染色后進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。發(fā)現(xiàn)尿酸鹽沉積明顯的器官如腎臟、脾臟、心臟和肝臟均發(fā)生不同程度病變損傷，如圖2所示。腎臟切片觀察可見腎間質(zhì)增生，腎小球界限不明顯，腎小管中有炎性細(xì)胞（見圖A1、A2）；肝臟組織中肝索結(jié)構(gòu)不清，血管周圍有炎癥反應(yīng)灶，且伴有大量胞漿中帶紅染顆粒的異嗜性粒細(xì)胞浸潤（見圖B1、B2）；脾臟組織有少量尿酸鹽結(jié)節(jié)（HE染色為粉紅色），在脾臟實質(zhì)細(xì)胞間有大量紅染顆粒的異嗜性粒細(xì)胞浸潤（見圖C1、C2）；心臟組織中心肌纖維排列紊亂，腫脹，可見少量炎性細(xì)胞（見圖D1、D2）。由此可見雛鵝痛風(fēng)病原可危害腎臟、肝臟、脾臟等主要代謝、解毒和免疫器官，與前人研究結(jié)果相同[14]。

圖2 痛風(fēng)雛鵝組織病理學(xué)觀察Fig.2 Pathological observation in gout goslings tissues

2.1.3 痛風(fēng)雛鵝常見病原檢查結(jié)果

如圖3所示，在痛風(fēng)雛鵝中僅擴(kuò)增出與星狀病毒GAstV預(yù)期長度一致條帶，其余病毒均未擴(kuò)增出預(yù)期條帶。將星狀病毒PCR陽性產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司測序，將測序結(jié)果在GenBank上通過BLAST進(jìn)行序列同源性比對，結(jié)果顯示PCR擴(kuò)增的星狀病毒基因序列片段長度為492 bp，與Gen-Bank中報道鵝源性GAstV基因序列（MT150877.1）同源性高達(dá)99.80%。

圖3 痛風(fēng)雛鵝病原鑒定Fig.3 Pathogen identification in gout goslings

2.2 痛風(fēng)雛鵝病原分離鑒定

2.2.1 鵝胚剖檢結(jié)果

將2.1.3中檢測出星狀病毒陽性樣本加入PBS溶液制成20%濃度勻漿經(jīng)離心收集上清液作為病毒原液，以絨毛尿囊腔途徑接種鵝胚，連續(xù)傳至第2代后，鵝胚未發(fā)生死亡，但出現(xiàn)明顯病理變化，如圖4所示，胚體表面和臟器均出現(xiàn)明顯出血點(diǎn)，腎臟腫大、水腫，絨毛膜尿囊膜增厚等現(xiàn)象。

圖4 攻毒鵝胚病理變化Fig.4 Pathological changes of virus inoculation goose embryo

2.2.2 鵝胚病原檢測

將病毒接種兩代后鵝胚全部處死（去除胚頭）加無菌PBS溶液制成濃度為20%勻漿。對得到的勻漿液進(jìn)行星狀病毒（每組隨機(jī)取2個鵝胚）定性檢測。如圖5所示，10-1和10-2組鵝胚尿囊液和胚液均檢測到星狀病毒，且胚液病毒含量高于尿囊液。因此，選取10-2組尿囊液和10-1組胚液混合液作為動物回歸試驗的攻毒原液。

將圖5中星狀病毒PCR擴(kuò)增陽性產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司測序。測序結(jié)果在GenBank上通過BLAST進(jìn)行序列同源性比對，結(jié)果顯示，各組鵝胚中星狀病毒基因序列片段長度為462 bp，與GenBank中報道鵝源性GAstV基因序列（MT150877.1）同源性高達(dá)99.34%。初步證實該病毒分離株為星狀病毒，命名為GDTF。

圖5 攻毒鵝胚星狀病毒隨機(jī)檢測結(jié)果Fig.5 Random test PCR results of virus inoculation goose embryo for GAstV gene

2.2.3 鵝胚病原序列分析

如圖6所示，本試驗分離得到的鵝源性星狀病毒序列（GDTF）與Zhang等報道我國中部地區(qū)引起痛風(fēng)癥狀的鵝星狀病毒毒株（MW592379）聚成一個分支，說明二者遺傳距離最近，與其他病毒遺傳距離較遠(yuǎn)[15]。由此可見，導(dǎo)致該場雛鵝痛風(fēng)的星狀病毒是鵝源性星狀病毒。

圖6 GDTF與其他有關(guān)雛鵝痛風(fēng)毒株系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree of GDTF and other related gosling gout strains

2.3 動物回歸試驗

2.3.1 雛鵝健康性檢測結(jié)果

攻毒前，對雛鵝進(jìn)行鵝星狀病毒定性檢測，確保雛鵝無星狀病毒污染。如圖7所示，各組雛鵝泄殖腔拭子樣品中未見鵝星狀病擴(kuò)增條帶出現(xiàn)，即雛鵝均未攜帶鵝星狀病毒。

圖7 健康雛鵝星狀病毒PCR檢測Fig.7 Astrovirus PCR detection in healthy goslings

2.3.2 鵝星狀病毒攻毒雛鵝結(jié)果

試驗期間，對照組雛鵝并未出現(xiàn)死亡或發(fā)病跡象，因此肌肉注射2 mL溶液對雛鵝健康無明顯影響；攻毒1組在攻毒第8天出現(xiàn)示病癥狀，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫大、消瘦、食欲不振、羽毛黯淡無光、精神萎靡、排出灰白色糞便等，如圖8所示；攻毒2組在攻毒第5天，出現(xiàn)發(fā)病死亡雛鵝；攻毒3組雛鵝在試驗期間未出現(xiàn)死亡或示病癥狀；攻毒組與對照組雛鵝日增重均差異不顯著。上述結(jié)果說明鵝星狀病毒對雛鵝有致病性。18只攻毒雛鵝中有2只死亡（攻毒2組），死亡率11.11%。

圖8 發(fā)病雛鵝示病癥狀Fig.8 Symptoms of diseased goslings

2.3.3 鵝星狀病毒攻毒雛鵝解剖結(jié)果

剖檢2.3.2中死亡雛鵝發(fā)現(xiàn)，內(nèi)臟器官有廣泛尿酸鹽浸潤（心臟、肝臟、脾臟），腎臟腫大呈明顯“花斑腎”，腸道、肌肉等非實質(zhì)性組織出現(xiàn)尿酸鹽沉積（見圖9）。未死亡雛鵝雖無示病癥狀，但腎腫大，呈“花斑腎”變化。如圖10所示，攻毒雛鵝心臟被沉積的尿酸鹽包裹（見圖10A），肝臟表面也有尿酸鹽沉積（見圖10B），膽囊表面有少量尿酸鹽附著（見圖10C），腎臟腫大（見圖10D），脾臟腫大有白色壞死點(diǎn)（見圖10E），肌胃被尿酸鹽大面積附著（見圖10F）。在攻毒組中隨機(jī)抽取4只雛鵝采樣，參照1.5.3中方法進(jìn)行鵝星狀病毒定性檢測，檢測結(jié)果見圖11。

圖9 鵝星狀病毒攻毒雛鵝解剖結(jié)果Fig.9 Anatomical results of gosling infected with goose astrovirus

圖10 攻毒雛鵝各臟器病變Fig.10 Diseases of various organs in virus inoculation goslings

圖11 攻毒組雛鵝星狀病毒檢測結(jié)果Fig.11 Results of goslings in the virus inoculation group(GAstV)

將本次檢測出星狀病毒PCR陽性產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司測序，測序結(jié)果顯示本次攻毒病死雛鵝星狀病毒基因序列片段長度為462 bp，與報道鵝GAstV基因序列（MT150877.1）同源性高達(dá)98.91%，與鵝場采集病料中鵝星狀病毒基因序列也存在高度同源。

2.3.4 鵝星狀病毒攻毒后雛鵝組織病理學(xué)觀察

將2.3.3中病變嚴(yán)重臟器進(jìn)行HE染色。從圖12中可觀察到雛鵝腎臟、脾臟及肝臟均出現(xiàn)病變，如淋巴細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤，腎臟還可觀察到多核巨噬細(xì)胞，與2.1.2從養(yǎng)殖場取得病料組織病理變化相似。

圖12 雛鵝攻毒后腎臟、肝臟和脾臟組織病理學(xué)變化Fig.12 Histopathological changes in kidney,spleen and liver of experimentally infected goslings

3 討論

王安平等研究結(jié)果表明，病毒感染是導(dǎo)致雛鵝痛風(fēng)最主要因素[16]。本試驗采集具有典型痛風(fēng)癥狀雛鵝病料，從中分離鑒定得到1株鵝星狀病毒，命名為GDTF。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，該病毒分離株與Zhang等[15]報道我國中部地區(qū)流行鵝星狀病毒毒株（MW592379）遺傳距離較近。因此，我國中部和南部地區(qū)發(fā)生、流行的雛鵝痛風(fēng)可能是由同一型星狀病毒感染引起，且該星狀病毒已大范圍傳播。

雛鵝痛風(fēng)對鵝養(yǎng)殖業(yè)危害較大，4～16日齡雛鵝是主要感染對象，日齡越小，發(fā)病率和死亡率越高。該病以關(guān)節(jié)腫脹，心臟、肝臟和腎臟等實質(zhì)性器官出現(xiàn)尿酸鹽沉積為典型癥狀[17-18]。本研究攻毒雛鵝剖檢時也可見內(nèi)臟器官有大量尿酸鹽沉積。目前，普遍認(rèn)為腎臟是鵝星狀病毒的主要靶器官[19]，推測可能是因腎臟排泄功能障礙，導(dǎo)致全身性尿酸鹽沉積。從收集的病料和攻毒雛鵝的病理切片觀察發(fā)現(xiàn)，腎臟、肝臟、脾臟、心臟等器官均發(fā)生不同程度炎癥反應(yīng)。說明鵝星狀病毒對雛鵝具有廣泛組織嗜性，引起器官炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致雛鵝死亡[19]。

付新亮等指出，鵝星狀病毒接種鵝胚后導(dǎo)致鵝胚100%死亡，接種后雛鵝死亡率達(dá)23%[20]。本研究將分離病毒株接種鵝胚后并未死亡，但出現(xiàn)明顯病理變化。將分離病毒株接種于雛鵝，雛鵝死亡率為11.11%，說明該病毒分離株可通過鵝胚傳染至雛鵝，且具有較強(qiáng)致病性。本研究鵝胚與雛鵝死亡率與其他文獻(xiàn)報道有所區(qū)別，可能因病毒劑量、攻毒方法、雛鵝品種以及健康情況等因素存在一定差異。

星狀病毒在我國分布地域廣泛且宿主范圍廣[21-22]，近年來，雛鵝痛風(fēng)發(fā)病率持續(xù)升高，給我國肉鵝養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[23-24]。當(dāng)前，生產(chǎn)中常用“腎腫解毒”類藥物促進(jìn)尿酸排出，短暫緩解癥狀，但對發(fā)病中后期，尤其是當(dāng)全群發(fā)病、出現(xiàn)死亡病例時，藥物治療效果較差[23]。目前關(guān)于雛鵝痛風(fēng)致病機(jī)理尚不明確，缺乏有效商品化疫苗，雛鵝痛風(fēng)防控存在難度。加強(qiáng)雛鵝飼養(yǎng)管理、做好生物安全工作，仍是防控鵝痛風(fēng)重要措施。鵝星狀病毒致病機(jī)制研究和疫苗開發(fā)也是鵝病防控研究工作重點(diǎn)。

4 結(jié)論

本研究成功分離得到一株廣東地區(qū)鵝星狀病毒，該病毒株接種鵝胚和雛鵝后癥狀與自然感染鵝痛風(fēng)癥狀相同，是導(dǎo)致雛鵝痛風(fēng)重要病因之一。為進(jìn)一步研究鵝星狀病毒致病性和致病機(jī)制并開展廣東地區(qū)鵝痛風(fēng)防控研究奠定基礎(chǔ)。