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    稗18-WJJ-Ec種群對(duì)五氟磺草胺的靶標(biāo)抗性機(jī)制

    2022-10-28 01:21:10黃啟超顧瓊楠褚世海陳安安李儒海孫正祥
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年19期
    關(guān)鍵詞:五氟磺草胺拷貝靶標(biāo)

    黃啟超, 顧瓊楠, 褚世海, 陳安安, 李 林, 李儒海, 孫正祥

    (1.長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院,湖北荊州 434025; 2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保土肥研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華中作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)作物重大病蟲草害防控湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北武漢 430064)

    稗屬(Beauv.)雜草是我國稻田惡性雜草之一,嚴(yán)重制約了我國水稻產(chǎn)量。目前,針對(duì)稻田稗屬雜草主要以化學(xué)防治為主,國內(nèi)用于防治稻田稗屬雜草的除草劑主要有五氟磺草胺、乙草胺、丁草胺、丙草胺、二氯喹啉酸、雙草醚、氰氟草酯等,其中三唑并嘧啶磺酰胺類的五氟磺草胺是目前較常用的除稗劑。五氟磺草胺是乙酰乳酸合成酶(ALS)抑制劑,由美國陶氏益農(nóng)公司研發(fā),于2008年進(jìn)入我國市場,因其良好的除稗草效果而得到廣泛推廣使用。近年來,由于五氟磺草胺的長期單一使用導(dǎo)致多地稗草對(duì)其產(chǎn)生抗性,其中以湖北省稗草高水平抗性比例最高。2018年,馬國蘭等對(duì)我國7省共70個(gè)地區(qū)的稻田稗屬雜草進(jìn)行了五氟磺草胺抗性檢測,結(jié)果表明50%地區(qū)稗屬雜草對(duì)五氟磺草胺達(dá)到了高抗水平,47.1%地區(qū)稗屬雜草對(duì)五氟磺草胺達(dá)到了中抗水平,抵抗水平稗屬雜草地區(qū)只有2.9%,所有地區(qū)均無敏感稗屬種群;其中,湖北、安徽、寧夏和黑龍江等4個(gè)省份的高水平抗性稗屬種群發(fā)生情況最為嚴(yán)重。

    雜草抗性機(jī)制主要包括靶標(biāo)抗性機(jī)制和非靶標(biāo)抗性機(jī)制,靶標(biāo)抗性機(jī)制一般與相關(guān)靶標(biāo)基因突變或過量表達(dá)有關(guān),靶標(biāo)基因的突變?cè)斐上嚓P(guān)靶標(biāo)蛋白3D結(jié)構(gòu)或者電化學(xué)性質(zhì)改變,導(dǎo)致靶標(biāo)酶與除草劑親和度降低,而靶標(biāo)基因過量表達(dá)導(dǎo)致靶標(biāo)酶含量提高,從而補(bǔ)償除草劑的抑制;非靶標(biāo)抗性的作用機(jī)制主要包括雜草對(duì)除草劑的解毒代謝增強(qiáng)、滲透減弱、吸收減少、傳導(dǎo)變緩及屏蔽作用等。目前已報(bào)道的雜草ALS抗性突變位點(diǎn)有9個(gè),其中已報(bào)道的稗屬雜草ALS氨基酸序列抗性突變位點(diǎn)有Ala-122、Pro-197、Ala-205、Phe-206、Asp-376和Trp-574等,這6個(gè)位點(diǎn)的突變均使得稗屬雜草對(duì)ALS抑制劑類除草劑產(chǎn)生了抗性。例如,F(xiàn)ang等發(fā)現(xiàn)稗(-)Ala-122-Val和Ala-205-Gly等2種靶標(biāo)位點(diǎn)突變生物型均對(duì)五氟磺草胺產(chǎn)生了抗性,且2個(gè)突變型稗ALS離體活性均高于敏感種群。此外,F(xiàn)ang等還發(fā)現(xiàn)了抗五氟磺草胺稗ALS氨基酸序列Phe-206-Leu突變型,且該突變位點(diǎn)是1處新的ALS突變位點(diǎn)。Yang等在研究稗對(duì)五氟磺草胺和氰氟草酯的抗性機(jī)制中發(fā)現(xiàn),稗Trp-574-Leu突變生物型對(duì)五氟磺草胺的抗性指數(shù)為65.84倍。Liu等發(fā)現(xiàn)了水稗()ALS2氨基酸序列拷貝Pro-197-Ser突變型,且該突變型水稗對(duì)部分ALS抑制劑產(chǎn)生了交互抗性,同時(shí)ALS離體活性比敏感種群高13.7倍。此外,2021年,L?bmann等首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了稗ALS氨基酸序列中376位天門冬氨酸(Asp)突變成了谷氨酸(Glu)。Dalazen等在研究咪唑乙煙酸對(duì)稗降解增強(qiáng)相關(guān)基因差異表達(dá)的影響中發(fā)現(xiàn),抗咪唑乙煙酸稗生物型細(xì)胞色素P450酶和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因表達(dá)量均高于敏感種群,但基因表達(dá)量與敏感種群差異不顯著,可能由非靶標(biāo)抗性機(jī)制主導(dǎo)。

    關(guān)于湖北省稗種群對(duì)五氟磺草胺靶標(biāo)抗性機(jī)制的研究鮮有報(bào)道,目前僅在湖北省荊州市公安縣發(fā)現(xiàn)ALS氨基酸序列Trp-574-Leu突變型稗。本研究擬通過測定稗18-WJJ-Ec種群對(duì)五氟磺草胺的敏感性及抗性機(jī)制,明確稗18-WJJ-Ec種群的抗性水平及靶標(biāo)抗性機(jī)制,以期為湖北省稻田抗性稗的防除治理提供理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 供試材料

    供試植物:抗性稗于2018年9月采自湖北省武漢市江夏區(qū)金水試驗(yàn)農(nóng)場水稻田;敏感型稗18-NJ種子由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所李永豐課題組提供。

    供試藥劑和試劑主要有25 g/L五氟磺草胺乳油[陶氏益農(nóng)農(nóng)業(yè)科技(江蘇)有限公司]、97.1%五氟磺草胺原藥(安徽星宇化工有限公司)、焦磷酸硫胺素(TPP,北京索萊寶科技有限公司)、黃素腺嘌呤二核苷酸鈉鹽(FAD,上海麥克林生化科技有限公司)、1-萘酚(上海麥克林生化科技有限公司)、肌酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、乙偶姻(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、NuClean Plant Genomic DNA Kit(江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司)、Cycle-Pure Kit(美國Omega Bio-Tek公司);TR251-50小量RNA提取試劑盒(北京天漠科技開發(fā)有限公司)、iTAPTM Universal SYBR? Green Supermix(美國Bio-Rad Laboratories公司)、5× All-In-One MasterMix(加拿大Applied Biological Materials Inc公司)、Zero Background pTOPO-TA(北京艾德萊生物科技有限公司)、Trans 5α Chemically Competent Cell(上海唯地生物技術(shù)有限公司)、Phanta? Max Super-Fidelity DNA Polymerase(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)。

    儀器設(shè)備主要有Optima XPN-100超高速冷凍離心機(jī)(美國Beckman Coulter公司)、東勝ETC811 PCR 擴(kuò)增儀(北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司)、 Eppendorf Centrifuge 5810R冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf 公司)、Bio-rad CFX Connect熒光定時(shí)定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)、Biotek Epoch酶標(biāo)儀(美國Biotek公司)、LAC-400-N人工氣候箱(上海龍躍儀器設(shè)備有限公司)。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 劑量反應(yīng)曲線測定 參照NY/T 1155.4—2006農(nóng)藥室內(nèi)生物測定試驗(yàn)準(zhǔn)則,將抗性稗18-WJJ-Ec種群和敏感稗18-NJ種群種子浸泡在100 mg/L赤霉酸溶液中,并于27 ℃光照培養(yǎng)箱中催芽24 h,然后分別播種在直徑15 cm塑料盆(含4/5基質(zhì)土)中,每盆50粒,均勻覆土1 cm,置于溫室內(nèi)培養(yǎng),培養(yǎng)條件為白天溫度 (27±5) ℃,夜間溫度(20±5) ℃,相對(duì)濕度(75±5)%,自然光培養(yǎng)。稗2~3葉期時(shí),每盆保留長勢一致植株20株,待稗3葉1心時(shí)期,對(duì)抗性稗18-WJJ-Ec種群莖葉噴施4、8、16、32、64、128、256、512 g a.i./hm共8個(gè)濃度的五氟磺草胺,敏感稗 18-NJ 種群莖葉噴施五氟磺草胺濃度梯度為0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00、32.00 g a.i./hm,以清水處理作為對(duì)照,每個(gè)處理4個(gè)重復(fù),施藥21 d后測量每盆稗地上部分鮮質(zhì)量。

    1.2.2 稗基因序列測定 將稗18-WJJ-Ec種群和18-NJ種群種子分別播種在10 cm×10 cm×10 cm的塑料方盒中,于28 ℃,光暗1 ∶1,3 000 lx人工氣候箱中培養(yǎng)至3葉1心期,以五氟磺草胺田間推薦劑量高量30 g a.i/hm莖葉噴施處理稗18-WJJ-Ec種群,稗18-NJ種群不處理,14 d后取存活稗幼嫩組織,采用NuClean Plant Genomic DNA Kit提取稗總DNA,每個(gè)種群提取10棵稗單株總DNA。根據(jù)NCBI登錄的稗基因序列,采用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)稗基因全長擴(kuò)增引物序列(上游引物:5′-G T C A T C G C C A A C C A C C T C T T C C-3′,下游引物:5′-C T G C C A T C A C C A T C C A G G A T C-3′)。PCR反應(yīng)體系:DNA模板1 μL;2×Phanta Max Buffer 12.5 μL;dNTP Mix 0.5 μL;Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 0.5 μL;10 μmol/L上、下游引物各1 μL;dd HO補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性1 min,63 ℃ 退火50 s,72 ℃延伸2 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳鑒定后,用Cycle-Pure Kit(Omega Bio-Tek公司)進(jìn)行產(chǎn)物純化回收,回收產(chǎn)物經(jīng)過連接、轉(zhuǎn)化、克隆至pTOPO Vector,37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h后,每個(gè)DNA樣本挑取10個(gè)單克隆菌株培養(yǎng)擴(kuò)繁,新鮮菌液經(jīng)PCR擴(kuò)增及凝膠電泳鑒定后送至湖北武漢擎科生物科技有限公司進(jìn)行雙向測序拼接。所測序列結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì)驗(yàn)證后,用DNAMAN6.0軟件進(jìn)行比對(duì)分析。

    1.2.3 稗ALS活性測定 采用Yu等的方法進(jìn)行測定,按“1.2.2”節(jié)方法培養(yǎng)稗至3葉1心期,每個(gè)種群取幼嫩葉片3.0 g,液氮下研磨成細(xì)粉,準(zhǔn)確稱量2.0 g細(xì)粉轉(zhuǎn)入離心管中,加入16 mL酶提取液(含10 mmol/L丙酮酸鈉,0.5 mmol/L MgCl,0.5 mmol/L TPP,10 μmol/L FAD的0.1 mol/L pH值為 7.5的磷酸緩沖液),混勻后冰上放置10 min,用2層尼龍網(wǎng)紗布過濾,濾液于27 000、4 ℃下離心20 min,將上清液轉(zhuǎn)入新離心管中,緩慢加入硫酸銨晶體(每1 mL粗酶液加0.313 g硫酸銨晶體),緩慢攪拌20 min,于27 000、4 ℃下離心 20 min,棄上清液,沉淀加入4.5 mL酶反應(yīng)液(含200 mmol/L丙酮酸鈉,20 mmol/L MgCl,2 mmol/L TPP,20 μmol/L FAD的0.05 mol/L pH值為 7.5的磷酸緩沖液)充分溶解得到粗酶液,并置于冰上備用。于1.5 mL離心管中,分別加入100 μL上述粗酶液和100 μL以 0.05 mol/L pH值7.5磷酸緩沖液配制的五氟磺草胺溶液(濃度梯度為0.01、0.10、1.00、10.00、100.00、1 000.00 μmol/L),充分混勻后37 ℃水浴暗反應(yīng)1 h,加入8 μL 6 mol/L HSO,60 ℃水浴脫羧15 min終止反應(yīng),然后加入5.5% 1-萘酚(以2.5 mol/L NaOH配制)和0.55%肌酸各190 μL,60 ℃水浴顯色15 min,冰浴1 min后低速離心,取200 μL上清液加入96孔酶標(biāo)板中,測定值,以100 μL磷酸緩沖液代替五氟磺草胺作為空白對(duì)照,以提前加入8 μL 6 mol/L HSO的酶液作為背景對(duì)照。試驗(yàn)生物學(xué)重復(fù)2次,技術(shù)重復(fù)3次。以乙偶姻制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,將反應(yīng)液值換算成乙偶姻含量,計(jì)算五氟磺草胺對(duì)各種群稗離體ALS抑制中濃度(ED),并計(jì)算抗性指數(shù)()。

    1.2.4 稗基因表達(dá)量測定 按“1.2.2”節(jié)方法培養(yǎng)稗至3葉1心期,以五氟磺草胺田間推薦劑量低劑量15 g a.i./hm莖葉噴霧處理,采用TRIZOL法,用TR251-50小量RNA提取試劑盒提取施藥前和施藥后1、3、5、7 d稗單株總RNA,用 5× All-In-One RT Master Mix反轉(zhuǎn)錄成cDNA后,采用Bio-rad CFX Connect熒光定時(shí)定量PCR儀進(jìn)行稗基因相對(duì)表達(dá)量測定,以稗基因?yàn)槟0逶O(shè)計(jì)RT-qPCR擴(kuò)增引物(上游引物QALS-F:5′-A T C C G C A T T G A G A A C C T C C-3′,下游引物 QALS-R:5′-T C T T C T T G A T T G C T G C A C G T-3′),以肌動(dòng)蛋白Actin作為內(nèi)參基因(上游引物ACT-F:5′-C A C A C T G G T G T C A T G G T A G G-3′,下游引物ACT-R:5′-A G A A A G T G T G A T G C C A G A T-3′),采用2-ΔΔ法以敏感稗18-NJ種群未用藥處理組作為對(duì)照組,分析計(jì)算稗基因相對(duì)表達(dá)量,試驗(yàn)生物學(xué)重復(fù)2次,技術(shù)重復(fù)3次。

    1.3 數(shù)據(jù)處理

    所有數(shù)據(jù)經(jīng)Excel處理后,采用SigmaPlot 14.0軟件Logistic模型計(jì)算五氟磺草胺對(duì)各稗種群的抑制中濃度(ED),擬合方程如式(1):

    (1)

    式中:表示除草劑劑量;為藥劑處理與空白對(duì)照百分比;為斜率;為劑量反應(yīng)下限;為劑量反應(yīng)上限。

    抗性指數(shù)按公式(2)計(jì)算:

    (2)

    式中:為抗性指數(shù);為抗性生物型的抑制中濃度;為敏感生物型的抑制中濃度。

    抗性水平分級(jí)標(biāo)準(zhǔn):敏感:≤2;低抗:2<≤6;中抗:6<≤12;高抗:12<。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 劑量反應(yīng)曲線測定

    試驗(yàn)結(jié)果表明,五氟磺草胺對(duì)稗18-WJJ-Ec種群的抑制中濃度為20.54 g a.i./hm,對(duì)18-NJ的抑制中濃度為0.48 g a.i./hm,抗性稗18-WJJ-Ec種群相對(duì)敏感稗18-NJ種群的抗性指數(shù)達(dá)到42.79倍,屬于高抗水平(表1、圖1)。

    2.2 稗ALS基因序列測定

    通過BLAST對(duì)稗基因序列與GenBank收錄的稗基因不同拷貝序列(登錄號(hào)::KY071206.1;:KY071207.1;:KY071208.1)進(jìn)行比對(duì),相似度均在99%以上,擴(kuò)增所得基因序列全部是稗基因序列。通過DNAMAN6.0軟件將稗18-NJ種群各單株基因序列不同拷貝(、、)翻譯成氨基酸后,與GenBank收錄的敏感稗ALS氨基酸序列對(duì)應(yīng)拷貝進(jìn)行比對(duì),未發(fā)現(xiàn)氨基酸位點(diǎn)突變。然后將抗五氟磺草胺稗18-WJJ-Ec種群各單株基因不同拷貝序列(、、)翻譯成氨基酸后,與敏感稗18-NJ種群對(duì)應(yīng)ALS氨基酸序列拷貝進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)1處已報(bào)道過的氨基酸突變位點(diǎn),稗18-WJJ-Ec種群的 ALS氨基酸序列574位(以擬南芥ALS氨基酸序列編號(hào)為模板)密碼子由TGG突變成了TTG,所編碼的氨基酸由色氨酸(Trp)突變成了亮氨酸(Leu),且在稗18-WJJ-Ec種群ALS氨基酸序列的不同拷貝上均發(fā)現(xiàn) Trp-574-Leu突變位點(diǎn)(圖2)。此外,稗18-WJJ-Ec種群ALS氨基酸Trp-574-Leu突變主要發(fā)生在稗基因序列拷貝上,稗基因序列發(fā)生Trp-574-Leu突變頻率為87.50%,而和基因序列拷貝發(fā)生Trp-574-Leu突變頻率分別為5.88%、8.57%,結(jié)果表明稗18-WJJ-Ec種群對(duì)五氟磺草胺的抗性是由靶標(biāo)位點(diǎn)突變引起的。

    表1 稗對(duì)五氟磺草胺的敏感性

    2.3 稗ALS活性測定

    根據(jù)乙偶姻濃度梯度以及對(duì)應(yīng)的吸光度,計(jì)算出乙偶姻的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3),線性擬合較好,可以將稗離體ALS活性吸光度換算成乙偶姻濃度,然后計(jì)算出五氟磺草胺對(duì)稗離體ALS的抑制中濃度。結(jié)果表明,在離體條件下,未用五氟磺草胺處理前,抗五氟磺草胺稗18-WJJ-Ec種群的ALS濃度(乙偶姻生成量)為32.82 μmol/L,而敏感稗 18-NJ種群的ALS濃度為19.83 μmol/L,稗18-WJJ-Ec種群的ALS濃度明顯高于敏感稗18-NJ種群。五氟磺草胺對(duì)抗性稗18-WJJ-Ec種群離體ALS的抑制中濃度(ED)為11.09 μmol/L,對(duì)敏感稗18-NJ種群離體ALS的抑制中濃度為 1.24 μmol/L,稗18-WJJ-Ec種群相對(duì)敏感稗 18-NJ種群的抗性指數(shù)為8.28倍(表2、圖4),表明稗18-WJJ-Ec種群ALS含量高于稗18-NJ種群,且離體ALS對(duì)五氟磺草胺的敏感性降低,靶標(biāo)酶濃度及活性的增加參與了稗18-WJJ-Ec種群對(duì)五氟磺草胺的抗性機(jī)制。

    表2 五氟磺草胺對(duì)稗離體ALS的抑制中濃度

    2.4 稗ALS基因表達(dá)量測定

    通過RT-qPCR熒光定量反應(yīng),用2-ΔΔ法以敏感稗18-NJ種群未用藥處理組作為對(duì)照組計(jì)算分析各種群稗基因相對(duì)表達(dá)量,結(jié)果表明,經(jīng)五氟磺草胺處理后,稗18-WJJ-Ec和18-NJ種群的基因表達(dá)量均呈先升高后降低趨勢。藥劑處理前,稗18-WJJ-Ec種群基因表達(dá)量是敏感稗18-NJ種群的1.58倍,基因表達(dá)量極顯著高于18-NJ種群。藥劑處理1 d后,稗18-WJJ-Ec和18-NJ 種群基因表達(dá)量均達(dá)到各自最大值,分別是對(duì)照的8.72倍和4.75倍,且稗18-WJJ-Ec種群基因表達(dá)量極顯著高于敏感稗18-NJ種群,從處理3 d開始,稗18-WJJ-Ec種群基因表達(dá)量顯著低于敏感稗18-NJ種群,結(jié)果表明稗18-WJJ-Ec種群存在靶標(biāo)酶基因過量表達(dá)機(jī)制(圖5)。

    3 結(jié)論與討論

    由于五氟磺草胺作用位點(diǎn)單一,加上農(nóng)戶長期反復(fù)單一使用,以及施用方法不當(dāng)?shù)纫蛩?,使得抗五氟磺草胺稗屬雜草的發(fā)生情況日益嚴(yán)重。本研究結(jié)果表明稗18-WJJ-Ec種群是18-NJ種群抗性指數(shù)的42.79倍,屬于高抗水平,該結(jié)論與馬國蘭等的研究結(jié)果相似。

    靶標(biāo)位點(diǎn)突變是雜草對(duì)除草劑產(chǎn)生抗性的直接原因,不同突變位點(diǎn)使得雜草對(duì)不同作用機(jī)制的除草劑產(chǎn)生抗性。本研究中,稗18-WJJ-Ec種群 ALS氨基酸序列574位Trp突變成了Leu,導(dǎo)致稗18-WJJ-Ec種群對(duì)五氟磺草胺產(chǎn)生了抗性。Trp-574-Leu是雜草常見的基因突變方式,目前有關(guān)稗ALS氨基酸序列Trp-574-Leu突變生物型已有較多研究報(bào)道,其他稗屬雜草有關(guān)ALS氨基酸序列Trp-574-Leu突變生物型的報(bào)道較少,目前報(bào)道的有水田稗()和水稗等。此外,稗作為六倍體植物,其基因序列存在3個(gè)不同的拷貝,即、和,研究表明和基因拷貝是所有物種的同源基因,而稗屬雜草則是多了基因拷貝。稗屬雜草的3個(gè)基因拷貝均參與了雜草的靶標(biāo)抗性進(jìn)化,而稗屬雜草對(duì)除草劑抗性的高低,可能與靶標(biāo)基因不同拷貝發(fā)生抗性位點(diǎn)突變頻率有關(guān)。本研究結(jié)果表明,稗18-WJJ-Ec種群ALS氨基酸Trp-574-Leu突變主要發(fā)生在基因序列拷貝上。而Trp-574-Leu突變位點(diǎn)發(fā)生在稗基因不同序列拷貝上,是否會(huì)影響稗對(duì)五氟磺草胺的抗性,有待進(jìn)一步研究確認(rèn)。

    雜草抗藥性的產(chǎn)生,也可能由靶標(biāo)酶基因表達(dá)量上調(diào)所介導(dǎo),而在發(fā)生靶標(biāo)抗性突變位點(diǎn)的雜草生物型中,靶標(biāo)酶基因過量表達(dá)現(xiàn)象鮮有報(bào)道,此外有研究表明抗性種群靶標(biāo)酶基因表達(dá)量也可能低于敏感種群。本研究結(jié)果表明,稗18-WJJ-Ec種群存在靶標(biāo)酶基因過量表達(dá)機(jī)制,該結(jié)論與Yu等研究結(jié)果相似。靶標(biāo)酶基因過量表達(dá)導(dǎo)致雜草靶標(biāo)酶含量提高,從而對(duì)除草劑產(chǎn)生抗性,同時(shí)靶標(biāo)酶活性的增強(qiáng),也會(huì)提高雜草的抗藥性。本研究結(jié)果表明,稗18-WJJ-Ec種群ALS含量提高,與本研究中靶標(biāo)酶基因過量表達(dá)結(jié)果相符,此外,稗18-WJJ-Ec種群離體ALS對(duì)五氟磺草胺的敏感性降低,表明該種群ALS活性增強(qiáng),該結(jié)論與Yu等的研究結(jié)果一致。

    為了確定稗18-WJJ-Ec種群是否還存在非靶標(biāo)抗性機(jī)制以及對(duì)其他相同作用機(jī)制或不同作用機(jī)制除草劑的抗性情況,后續(xù)可以開展對(duì)稗18-WJJ-Ec種群非靶標(biāo)抗性機(jī)制以及交互抗性和多抗性的相關(guān)探究。此外,稗對(duì)五氟磺草胺的抗性高低,可能與抗性突變位點(diǎn)由稗基因不同拷貝攜帶有關(guān),后續(xù)可以篩選出稗不同拷貝Trp-574-Leu純合突變生物型,研究其相關(guān)抗性機(jī)制,同時(shí)探究稗對(duì)五氟磺草胺抗性的高低是否與基因不同拷貝的表達(dá)量以及稗基因不同拷貝攜帶Trp-574-Leu突變位點(diǎn)有關(guān)。

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