菜心酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因家族的鑒定及表達(dá)分析

馮獻(xiàn)君， 吳英華， 史 艷， 侯雷平， 李梅蘭

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西太谷 030801)

菜心(L. ssp.var.Tsen et Lee)別稱菜薹，是十字花科蕓薹屬白菜亞種中的一個(gè)變種，在華南地區(qū)廣泛栽培，而在我國北方地區(qū)屬稀有蔬菜。近年來，隨著社會(huì)發(fā)展和人員的流動(dòng)，菜心的栽培范圍逐漸擴(kuò)大，栽培區(qū)域逐漸北移。菜心以幼嫩的薹莖和花蕾為可食用部位，而花薹的發(fā)育決定其產(chǎn)量和品質(zhì)。目前關(guān)于花薹營養(yǎng)物質(zhì)積累方面的研究較少，主要集中在花薹形成的調(diào)控機(jī)制中。蔗糖、葡萄糖和果糖等可溶性糖是菜心花薹中重要的營養(yǎng)物質(zhì)，其中葡萄糖和果糖在菜心的甜度及口感方面起重要作用，它們?cè)谡崽寝D(zhuǎn)化酶的水解作用下進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成己糖磷酸酯參與細(xì)胞代謝，因此蔗糖轉(zhuǎn)化酶在調(diào)節(jié)菜心各個(gè)器官的營養(yǎng)品質(zhì)形成(尤其是糖的累積利用)中是必不可少的。

植物通過光合作用固定碳源，產(chǎn)生植物生長發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì)，并從源器官運(yùn)輸?shù)綆炱鞴僦?，而蔗糖是主要的產(chǎn)物之一。蔗糖在降解過程中的關(guān)鍵酶是蔗糖轉(zhuǎn)化酶和蔗糖合成酶，其中蔗糖轉(zhuǎn)化酶的作用不可逆。Barratt等研究表明，蔗糖轉(zhuǎn)化酶在植物生長發(fā)育和初級(jí)氮代謝中至關(guān)重要。根據(jù)亞細(xì)胞定位將蔗糖轉(zhuǎn)化酶分為細(xì)胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶(CWINV)、液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶(VINV)和細(xì)胞質(zhì)蔗糖轉(zhuǎn)化酶；根據(jù)最適pH值又可分為酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶和中性蔗糖轉(zhuǎn)化酶。前二者屬于酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶，后者屬于中性蔗糖轉(zhuǎn)化酶。中性轉(zhuǎn)化酶活性較低且不穩(wěn)定，酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶屬于-呋喃果糖苷酶，是糖基水解酶家族 32(GH32)的成員之一，其在植物生長發(fā)育及蔗糖代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

近年來，酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶已在玉米、擬南芥、番茄等植物中廣泛研究，蔗糖轉(zhuǎn)化酶在菜心中的相關(guān)研究較少。因此，本研究對(duì)菜心酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因家族成員進(jìn)行鑒定，從理化性質(zhì)、染色體定位、系統(tǒng)進(jìn)化樹、蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)以及保守基序進(jìn)行分析，以期為進(jìn)一步探索菜心酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶的多樣性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn)

本試驗(yàn)于2021年7月在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2 菜心酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因家族鑒定及蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析

先從擬南芥信息資源網(wǎng)站(TAIR)(http：//www. Arabidopsis. Org)找到擬南芥中已鑒定的8個(gè)酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶家族基因及氨基酸序列，再根據(jù)筆者所在實(shí)驗(yàn)室已有的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)并結(jié)合大白菜全基因組數(shù)據(jù)庫(BRAD)進(jìn)行同源搜索，初步篩選得到菜心蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因家族成員。通過NCBI-CDD數(shù)據(jù)庫分別對(duì)所有基因序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域檢查，刪除不完整序列，最終獲得菜心酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因。利用相同的方法分別鑒定得到13個(gè)甘藍(lán)、9個(gè)水稻、8個(gè)黃瓜的酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因。對(duì)篩選得到的菜心酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶家族蛋白質(zhì)序列，使用在線軟件ExPASy(http：//www.expasy.org/)進(jìn)行理化性質(zhì)的分析。

1.3 基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

使用MEGA 7.0軟件對(duì)菜心、擬南芥、甘藍(lán)、水稻和黃瓜酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶家族蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。利用在線軟件iTOL(http：//itol.embl.de/)修飾美化進(jìn)化樹。

1.4 基因染色體定位

菜心酸性轉(zhuǎn)化酶基因染色體定位圖使用在線工具M(jìn)G2C(http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/)繪制。

1.5 蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及亞細(xì)胞定位

菜心酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶家族蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)使用在線軟件SOPMA(http：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html)進(jìn)行。亞細(xì)胞定位通過在線工具CELLO(http：//cello.life.ntcu.edu.te/)進(jìn)行。

1.6 基因家族結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)保守基序分析

菜心酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因結(jié)構(gòu)的分析使用在線軟件GSDS(http：//gsds.gao-lab.org/index.php)進(jìn)行。使用在線軟件MEME(https：//meme-suite.org/meme/tools/meme)和TBtools軟件繪制蛋白質(zhì)保守基序圖。

1.7 酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因表達(dá)分析

根據(jù)菜心不同器官的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶家族基因在各個(gè)器官中的表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 菜心酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因的染色體定位分析

為了探討菜心酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因在染色體上的分布，使用在線軟件MG2C信息可視化網(wǎng)站分析，可知菜心的13個(gè)酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因分布在A01、A03、A04、A05、A06、A09和A10號(hào)染色體上(圖1)。這13個(gè)酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因不均勻地分布在7條染色體上。其中定位在A09號(hào)染色體上的基因最多，有3個(gè)。A01和A10號(hào)染色體上定位的基因最少，均為1個(gè)，其余4條染色體上均定位到2個(gè)基因。

2.2 菜心酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

為了進(jìn)一步探究菜心酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因的進(jìn)化關(guān)系，使用MEGA 7.0軟件選用甘藍(lán)、水稻、黃瓜和擬南芥的酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶家族基因?yàn)閰⒖夹蛄袠?gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果(圖2)顯示51個(gè)蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因分為2類，分別為液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因()、細(xì)胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因()。其中擬南芥有2個(gè)液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因，6個(gè)細(xì)胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因；菜心有4個(gè)VINV，9個(gè)CWINV；甘藍(lán)有3個(gè)VINV，10個(gè)CWINV；水稻有6個(gè)CWINV，3個(gè)VINV；黃瓜僅有1個(gè)VINV。從系統(tǒng)發(fā)育樹中可以看出擬南芥已知的酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因及其對(duì)應(yīng)的菜心基因均聚在一個(gè)分支上，說明它們的進(jìn)化關(guān)系較近，結(jié)構(gòu)和功能相似或相同。

2.3 菜心酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因家族蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)

通過對(duì)菜心酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因家族蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)分析，發(fā)現(xiàn)其氨基酸數(shù)量、分子量、等電點(diǎn)、原子總數(shù)、不穩(wěn)定系數(shù)、脂肪系數(shù)及親水性均不一(表1)。菜心酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因家族成員編碼的氨基酸殘基為418～800個(gè)，其中大部分都集中在500～650個(gè)之間。分子量為47.49～90.38 ku，與氨基酸數(shù)量變化趨勢(shì)一致。等電點(diǎn)(pI)為4.96～9.19，其中液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因家族蛋白的pI均小于7.5，說明液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因家族蛋白均屬于酸性蛋白。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的不穩(wěn)定系數(shù)大于40時(shí)，容易降解。菜心酸性轉(zhuǎn)化酶家族蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)只有1個(gè)大于40，其余均小于40，為穩(wěn)定蛋白。脂肪系數(shù)在69.19～82.31之間。親水性均為負(fù)值，說明所有蛋白質(zhì)都是親水性蛋白。

2.4 菜心酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因家族蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及亞細(xì)胞定位分析

菜心酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因家族蛋白質(zhì)是由 α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無規(guī)則卷曲構(gòu)成(表2)，主要為無規(guī)則卷曲和延伸鏈。各蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)均表現(xiàn)為無規(guī)則卷曲>延伸鏈>α-螺旋>β-轉(zhuǎn)角。無規(guī)則卷曲占比在49.90%～56.75%之間，α-螺旋占比在12.75%～19.94%之間，延伸鏈占比在21.25%～28.80%之間，β-轉(zhuǎn)角占比在4.60%～6.46%之間(表2)。

表1 菜心酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因家族蛋白質(zhì)理化性質(zhì)

表2 菜心酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶家族蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及亞細(xì)胞定位分析

菜心酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因家族蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果(表2)表明，液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因家族蛋白和細(xì)胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因家族蛋白質(zhì)定位于細(xì)胞壁、周質(zhì)及外膜上，推測(cè)菜心酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因家族蛋白在這3個(gè)地方發(fā)揮作用。

2.5 菜心酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶家族基因的結(jié)構(gòu)分析

參考大白菜基因組數(shù)據(jù)庫得到菜心蔗糖轉(zhuǎn)化酶蛋白質(zhì)序列對(duì)應(yīng)的基因序列及蛋白質(zhì)編碼區(qū)(CDS)序列，并確定了其內(nèi)含子和外顯子的組成，構(gòu)建了菜心酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶家族基因的基因結(jié)構(gòu)(圖3)，圖中黃色為菜心酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因的CDS。從圖3可以看出，菜心酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶家族基因所含的CDS為3～9個(gè)，其中含有6、7個(gè)CDS的基因均有4個(gè)。含有9個(gè)CDS，和含有5個(gè)CDS，含有4個(gè)CDS，僅含有3個(gè)CDS。CDS數(shù)量有差異，表明菜心酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因結(jié)構(gòu)存在多樣性。

2.6 菜心酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因家族蛋白質(zhì)的保守基序分析

為了進(jìn)一步研究菜心酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因家族蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征及蛋白多樣性，使用在線軟件MEME對(duì)菜心酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因家族蛋白保守基序進(jìn)行分析，確定了10個(gè)保守基序(motif1～motif10)類型。由圖4可知，13個(gè)菜心酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因家族蛋白質(zhì)均含有motif 1、motif 2、motif 4、motif 5、motif 8和motif 10。有8個(gè)蛋白質(zhì)含有所有的保守基序，說明菜心酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因家族蛋白保守性較高。、和不含有motif 9，和不含有motif 6，不含有motif 3、motif 6 和motif 7。4個(gè)液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因家族蛋白中有3個(gè)均含有10個(gè)保守基序，9個(gè)細(xì)胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因家族蛋白中有5個(gè)均含有10個(gè)保守基序，表明液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因家族蛋白的保守性要高于細(xì)胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因家族蛋白。成員的保守基序排布不同，構(gòu)成了蛋白質(zhì)的多樣性。

2.7 酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶家族基因表達(dá)模式分析

利用菜心不同器官轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶家族基因在葉片、薹莖和花蕾中的表達(dá)特征，結(jié)果(圖5)表明，13個(gè)基因均至少在1個(gè)器官中表達(dá)，其中有10個(gè)基因在各個(gè)組織中均有表達(dá)，和在薹莖中有很高的表達(dá)量，在花蕾中有很高的表達(dá)量，說明這些基因在菜心薹莖和花蕾營養(yǎng)物質(zhì)積累中具有重要作用。此外，部分基因在不同部位中存在特異性表達(dá)，如和在花蕾中特異性表達(dá)。

3 討論與結(jié)論

近年來，眾多的研究表明，酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶在植物生長發(fā)育、營養(yǎng)物質(zhì)分配及表達(dá)調(diào)控方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，進(jìn)而提高植物的產(chǎn)量及品質(zhì)，這為人們研究植物中酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因奠定了基礎(chǔ)。植物中糖的代謝和積累與其產(chǎn)量和品質(zhì)密切相關(guān)，蔗糖是高等植物光合作用的主要產(chǎn)物之一。本研究通過對(duì)比擬南芥酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因家族，在菜心中鑒定出13個(gè)酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因家族成員，數(shù)量上與擬南芥、番茄相近。

通過生物信息學(xué)分析軟件對(duì)菜心酸性轉(zhuǎn)化酶家族基因進(jìn)行理化性質(zhì)分析，發(fā)現(xiàn)13個(gè)菜心酸性轉(zhuǎn)化酶基因家族蛋白質(zhì)成員的氨基酸數(shù)量為418～800個(gè)，其中的為418個(gè)，少于其他的基因。酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因家族蛋白的氨基酸數(shù)量有很大差異，主要是由于外顯子和內(nèi)含子數(shù)量不同導(dǎo)致的，植物中該基因的典型結(jié)構(gòu)包括7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子。因此、這2個(gè)細(xì)胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因蛋白氨基酸數(shù)量少是由于有4個(gè)外顯子，有3個(gè)外顯子。與其他酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶差異明顯，說明CWINV4()和CWINV5()存在外顯子丟失情況。從酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因家族蛋白序列的保守基序來看，大部分基因中都包含10個(gè)保守基序且排序一致，說明菜心酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因家族蛋白質(zhì)具有高度保守性。通過分析酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因家族蛋白的理化性質(zhì)發(fā)現(xiàn)液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶的等電點(diǎn)低于細(xì)胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶。相關(guān)研究表明，高等植物中低等電點(diǎn)的酶為液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶，高等電點(diǎn)的酶為細(xì)胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶，且分別定位到液泡和細(xì)胞壁，本研究中通過亞細(xì)胞定位將菜心酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因家族蛋白質(zhì)定位在細(xì)胞壁、外膜和周質(zhì)上，表明這些基因在細(xì)胞壁、外膜和周質(zhì)中發(fā)揮作用。

本研究利用擬南芥8個(gè)酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶家族基因作為參考序列，根據(jù)筆者所在課題組已有的菜心轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)合大白菜全基因組數(shù)據(jù)庫對(duì)菜心所有酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶家族基因進(jìn)行鑒定，識(shí)別出了13個(gè)菜心酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因家族成員，它們的氨基酸數(shù)量大部分為500～650個(gè)，分子量變化與氨基酸數(shù)量變化趨勢(shì)一致。其蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)無規(guī)則卷曲所占比例最高。13個(gè)基因中有8個(gè)基因均含有10個(gè)保守基序。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，這些基因分為2類，其中菜心細(xì)胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因()9個(gè)，液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因()4個(gè)，它們不均勻地分布在7條染色體上，其家族中大部分基因均含有6個(gè)或7個(gè)外顯子。13個(gè)酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因在菜心薹莖和花蕾中高表達(dá)的成員較多。這些結(jié)果有助于理解酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因在菜心蔗糖代謝調(diào)控中的作用，同時(shí)也為探究酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因多樣性提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。