組學(xué)技術(shù)在食源性致病菌抗逆機制研究中的應(yīng)用進(jìn)展

何守魁，黎丹紅，施春雷，史賢明

（上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，中美食品安全聯(lián)合研究中心，微生物代謝國家重點實驗室，上海 200240）

食品安全是備受全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問題，食源性致病菌是引發(fā)食品安全問題的主要因素。據(jù)統(tǒng)計，我國平均每6.5 人中就有1 人因食用被食源性致病菌污染的食物而罹患疾病。沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌、致病性大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、單增李斯特菌等都是我國常見的食源性致病菌。對這些食源性致病菌進(jìn)行有效的控制，是保障食品安全的重要途徑。

在食品工業(yè)中，常使用物理殺菌因子和化學(xué)殺菌因子來控制致病菌，從而保障食品安全。然而，這些物理和化學(xué)因子的廣泛使用或不合理使用，已導(dǎo)致食源性致病菌形成抗性，包括低溫抗性、高溫抗性、干燥抗性、消毒劑抗性、有機酸抗性等。此外，有些致病菌（如沙門氏菌）甚至能夠同時抵御復(fù)雜食品基質(zhì)（如蛋清和花生醬）中的多種逆境因子，并引發(fā)食品安全事件。因此，探索致病菌在食品加工與貯藏環(huán)節(jié)常用理化因子脅迫下的存活機制，對于解決抗性菌導(dǎo)致的食品安全問題具有重要意義。

近年來，日益成熟的高通量組學(xué)技術(shù)（如基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等）在食源性致病菌抗逆機制研究方面得到了廣泛應(yīng)用，為抗逆相關(guān)基因、sRNA、蛋白質(zhì)和代謝物的全面發(fā)掘及其互作關(guān)系研究提供了堅實的技術(shù)支撐。例如，目前已通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)挖掘到參與沙門氏菌酸抗性形成的多個調(diào)控蛋白質(zhì)（如Fur、RpoS和OmpR）、結(jié)構(gòu)基因（如、和）和sRNA（如RprA、ArcZ和GcvB），這些抗逆元件有望為新型控菌技術(shù)的開發(fā)提供候選作用靶標(biāo)，最終用于食品的安全生產(chǎn)。

本文結(jié)合課題組前期的研究工作，綜述基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)在食源性致病菌抗逆機制研究中的應(yīng)用進(jìn)展，并對未來的發(fā)展方向進(jìn)行展望，以期將組學(xué)技術(shù)更好地用于相關(guān)基礎(chǔ)研究，同時為食源性致病菌抗性菌株的防控作出重要貢獻(xiàn)。

1 基因組學(xué)技術(shù)在食源性致病菌抗逆機制研究中的應(yīng)用

基因組攜帶了生物體（如食源性致病菌）的絕大多數(shù)遺傳信息，是微生物形成特定表型的本源。因此，全基因測序分析對于揭示食源性致病菌的抗性形成機制尤為重要。一代測序技術(shù)以Sanger雙鏈終止法為代表，二代測序技術(shù)以Roche公司的454技術(shù)、Illumina公司的Solexa/HiSeq技術(shù)和ABI（Applied Biosystems）公司的SOLID（sequencing by oligonucleotide ligation and detection）技術(shù)為代表，三代測序技術(shù)以Pacific BioSciences（PacBio）公司的單分子實時測序技術(shù)（single-molecule real-time sequencing，SMRT）和ONT（Oxford Nanopore Technologies）公司的納米孔測序技術(shù)（Nanopore）為代表。目前，全基因組測序主要依賴于二代和三代測序技術(shù)，這些技術(shù)在食源性致病菌應(yīng)對抗生素、天然產(chǎn)物、高溫等脅迫的抗性形成機制研究方面得到了廣泛應(yīng)用（表1）。

表1 基因組學(xué)技術(shù)在食源性致病菌抗逆機制研究中的應(yīng)用案例Table 1 Application of genomics technology in investigations on stress response mechanisms of foodborne pathogens

1.1 二代測序技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展

二代測序技術(shù)在食源性致病菌耐藥性研究方面得到了廣泛的應(yīng)用。例如，研究者們已借助Illumina的MiSeq/HiSeq測序平臺，發(fā)現(xiàn)了金黃色葡萄球菌的、、、、和這6 個基因與高水平苯唑西林耐藥性的形成相關(guān)，鑒定到副溶血弧菌中存在（Pro165Ser、Gly208Asp）、（Ile313Thr）、（Glu329Ala）和（Asn205Ser）等耐藥基因的突變。

二代測序技術(shù)也被用于探索大腸桿菌、沙門氏菌等重要致病菌抵御天然產(chǎn)物、化學(xué)消毒劑和蛋清等逆境因子的機制。例如，Pereira等發(fā)現(xiàn)苯扎氯銨、雙氯苯雙胍己烷等殺菌劑的連續(xù)使用會導(dǎo)致大腸桿菌耐藥菌株的耐藥泵（、）、孔道蛋白（、）、RNA聚合酶（、）等相關(guān)基因發(fā)生突變。此外，本課題組利用Illumina HiSeq平臺對腸炎沙門氏菌的1 株蛋清抗逆菌株和1 株蛋清敏感菌株進(jìn)行了全基因組測序，鑒定到70 個單核苷酸多態(tài)性位點差異和6 個插入缺失位點差異，這些差異位點涉及的基因主要與細(xì)胞分裂、DNA損傷修復(fù)、氨基酸代謝、三型分泌系統(tǒng)等相關(guān)。

1.2 三代測序技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展

三代測序技術(shù)也可單獨用于食源性致病菌的抗逆機制研究，但目前的應(yīng)用相對較少。例如，Nguyen等利用PacBio RS II平臺對一株耐熱的山夫登堡沙門氏菌ATCC 43845進(jìn)行測序，獲得了其基因組完成圖。該菌的基因組大小為4.92 Mb，GC相對含量為52.2%，共有5 105 個基因。該菌的特色是具有兩個通過基因水平轉(zhuǎn)移而獲得的TLPQC-1和TLPQC-2耐熱基因座，位于一個341.3 kb大小的質(zhì)粒上，這個質(zhì)粒與IncHI2 R478質(zhì)粒相似，但并不攜帶任何耐藥基因。上述結(jié)果為這株典型的耐熱山夫登堡沙門氏菌高溫抗性形成機制的揭示提供了新視角。

1.3 二代與三代測序技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)展

近年來，二代與三代測序技術(shù)常被聯(lián)合用于食源性致病菌的耐藥機制研究，主要研究思路是先對較大批量的菌株進(jìn)行二代測序，然后挑選代表性菌株進(jìn)行三代測序，并整合二代和三代測序數(shù)據(jù)來分析基因組特征。例如，Zheng Zhiwei等利用Illumina HiSeq平臺對攜帶基因的33 株副溶血弧菌和2 株溶藻弧菌進(jìn)行測序，并挑選2 株代表性菌株（Vb0624和Vb1636）進(jìn)行Nanopore測序，發(fā)現(xiàn)這些菌株攜帶的基因上游是ISEcp1插入序列。其中，有32 株菌的基因位于染色體I的相同基因座上，有1 株菌的基因位于SXT/R391家族的新型整合性接合元件上，有1 株菌的基因位于IncP-1型質(zhì)粒上。

同樣借助MiSeq和Nanopore測序技術(shù)，Octavia等發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒攜帶的、或耐藥基因與圣保羅沙門氏菌對第三代頭孢菌素抗性的形成密切相關(guān)；González-Santamarina等發(fā)現(xiàn)多重耐藥的德爾卑沙門氏菌和羅森沙門氏菌普遍攜帶耐藥基因，包括四環(huán)素耐藥基因（如、）、-內(nèi)酰胺耐藥基因（如、）、氯霉素耐藥基因（如、）、磺胺耐藥基因（如、）、喹諾酮耐藥基因（如）等。

本課題組同時采用二代和三代測序技術(shù)對一株分離自雞肉的泛耐藥印第安納沙門氏菌的基因組特征進(jìn)行分析，獲得了較精細(xì)的基因組完成圖。這株菌基因組大小為5.01 Mb，包含4.77 Mb的基因組和0.24 Mb的質(zhì)粒，其典型特點是具有28 個基因組島、5 個沙門氏菌毒力島和27 個耐藥基因（位于IncHI2-IncHI2A質(zhì)粒上）。這些較詳細(xì)的基因組信息為研究細(xì)菌耐藥性形成的分子機制奠定了基礎(chǔ)。

由此可知，在食源性致病菌的抗逆機制研究中，全基因組測序技術(shù)主要用于代表菌株（如抗逆菌）的序列特征分析。二代測序技術(shù)具有高通量、低成本、高精準(zhǔn)度等優(yōu)勢，但其序列讀長限制增加了基因組拼接和后續(xù)數(shù)據(jù)分析的難度。以單分子測序為特點的三代測序技術(shù)雖克服了二代測序中存在的問題，但其測序錯誤率高，而且錯誤率是隨機出現(xiàn)的。因此，將二代與三代測序技術(shù)聯(lián)合使用可提高全基因組測序的準(zhǔn)確度，這已成為基因組學(xué)技術(shù)在食源性致病菌抗逆機制研究中的應(yīng)用趨勢。

2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)在食源性致病菌抗逆機制研究中的應(yīng)用

轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)可從整體水平上研究生物體（如食源性致病菌）在特定狀態(tài)下（如脅迫因子）的基因轉(zhuǎn)錄水平和表達(dá)調(diào)控規(guī)律。轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)主要包括基于雜交方法的基因表達(dá)譜芯片技術(shù)和基于測序方法的RNA-seq技術(shù)等。這些方法在沙門氏菌、單增李斯特菌、阪崎克羅諾桿菌、大腸桿菌O157:H7、空腸彎曲桿菌等致病菌抵御高溫、低溫、消毒劑、食品基質(zhì)等逆境因子研究方面得到了較廣泛的應(yīng)用（表2），為食源性致病菌抗逆機制的深入解析提供了關(guān)鍵的基因和通路。

表2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)在食源性致病菌抗逆機制研究中的應(yīng)用案例Table 2 Application of transcriptomics technology in investigations on stress response mechanisms of foodborne pathogens

2.1 基因表達(dá)譜芯片技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展

基因表達(dá)譜芯片是基于核酸探針雜交的原理來檢測基因的表達(dá)變化情況。目前，該技術(shù)已應(yīng)用于沙門氏菌抵御干燥、次氯酸鈉和高溫等脅迫因子以及單增李斯特菌抵御堿和二氧化氯等脅迫因子的機制研究（表2）。

Li Haiping等以一株干燥抗性強的田納西沙門氏菌和一株干燥抗性弱的鼠傷寒沙門氏菌為研究對象，通過基因表達(dá)譜芯片技術(shù)探索這兩株菌在干燥脅迫下的轉(zhuǎn)錄譜差異，結(jié)果表明，田納西沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌分別有71 個基因（63 個基因表達(dá)上調(diào)、8 個基因表達(dá)下調(diào)）和94 個基因（85 個基因表達(dá)上調(diào)、9 個基因表達(dá)下調(diào)）的表達(dá)在干燥脅迫后發(fā)生顯著變化，主要與脂肪酸、轉(zhuǎn)運子、能量代謝、細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)合成、滲透脅迫等通路相關(guān)。其中，與鼠傷寒沙門氏菌相比，田納西沙門氏菌的鞭毛合成和蛋白質(zhì)合成降低、海藻糖合成增加、應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞膜修飾被激活，表明這些是田納西沙門氏菌形成干燥抗性的策略。

Wang Siyun等利用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)探究沙門氏菌對次氯酸鈉這一重要氧化型消毒劑的應(yīng)答機制，結(jié)果表明，鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌共有209 個基因的表達(dá)在次氯酸鈉脅迫后發(fā)生了顯著變化，這些基因主要與應(yīng)激反應(yīng)、核糖體合成、菌膜形成、能量代謝、半胱氨酸合成和鐵硫簇組裝等相關(guān)。此外，應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的33 個基因（如、）和毒力相關(guān)的19 個基因（如、）在鼠傷寒和腸炎這兩種血清型的沙門氏菌中呈現(xiàn)出不同的表達(dá)模式，說明沙門氏菌可能啟動一些血清型特異的方式來應(yīng)答次氯酸鈉脅迫。

2.2 RNA-seq技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展

RNA-seq技術(shù)主要借助高通量測序的方法來發(fā)掘差異表達(dá)基因。近年來，該技術(shù)在食源性致病菌的抗逆機制研究方面應(yīng)用非常廣泛，包括沙門氏菌應(yīng)答酸、蛋清和花生油的機制探索，單增李斯特菌的菌膜形成機制研究，大腸桿菌O157:H7應(yīng)答低溫、超聲和歐姆加熱的機理解析（表2）。

Hu Shuangfang等通過RNA-seq技術(shù)探索腸炎沙門氏菌對酸脅迫的轉(zhuǎn)錄響應(yīng)機制，發(fā)現(xiàn)酸脅迫導(dǎo)致該菌280 個基因的表達(dá)顯著上調(diào)，274 個基因的表達(dá)顯著下調(diào)。通過分析這些基因參與的生化代謝過程和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，發(fā)現(xiàn)腸炎沙門氏菌主要通過降低能量損耗和蛋白乙?；?，啟動應(yīng)激反應(yīng)和鐵硫簇合成途徑，并維持必要的細(xì)胞過程來應(yīng)對酸脅迫。

曹啟航采用RNA-seq技術(shù)對不同時期的菌膜和浮游狀態(tài)單增李斯特菌進(jìn)行測序，發(fā)掘到1 123 個與菌膜形成相關(guān)的基因，并通過實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)證實了轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的可靠性。京都基因與基因組百科全書（Kyoto Ncyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析結(jié)果進(jìn)一步顯示，差異表達(dá)基因主要與群體感應(yīng)、細(xì)菌分泌、細(xì)菌趨化、鞭毛組裝、磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)等相關(guān)。這些研究結(jié)果為揭示單增李斯特菌菌膜這一重要抗逆態(tài)的形成機制奠定了基礎(chǔ)。

RNA-seq技術(shù)也被用于研究腸炎沙門氏菌在蛋清（含有卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、溶菌酶等抗菌因子）以及花生油（存在干燥和饑餓等脅迫環(huán)境）等食品基質(zhì)中的存活機理。本課題組將RNA-seq技術(shù)用于腸炎沙門氏菌在蛋清逆境脅迫下的轉(zhuǎn)錄組響應(yīng)機制研究，發(fā)現(xiàn)該菌在蛋清中孵育6、12、24 h后，分別有1 200、1 312、1 415 個基因的表達(dá)發(fā)生了顯著變化；其中，表達(dá)顯著上調(diào)的基因主要富集在堿性pH適應(yīng)、滲透脅迫響應(yīng)、鐵吸收、DNA損傷修復(fù)、肽聚糖合成和交聯(lián)、生物素合成等通路，表達(dá)顯著下調(diào)的基因主要富集在翻譯、核苷酸代謝、能量代謝、運動、沙門氏菌毒力島等通路。此外，通過基因功能分析，揭示了包膜脅迫相關(guān)蛋白CpxR可正向調(diào)控基因的表達(dá)來響應(yīng)蛋清逆境的脅迫。在致病菌應(yīng)答花生油的研究中，Deng Xiangyu等借助RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)腸炎沙門氏菌在花生油中干燥和饑餓脅迫等作用下幾乎處于生理休眠狀態(tài)，只有不足5%的基因轉(zhuǎn)錄成RNA。這些基因主要包括、、等熱休克基因，、、等冷休克基因以及、等調(diào)控基因。此外，、、、、、等非編碼RNA的表達(dá)也發(fā)生了顯著變化，表明它們參與了腸炎沙門氏菌在花生油中的抗逆存活。

綜上可知，基因表達(dá)譜芯片技術(shù)和RNA-seq技術(shù)均已被用于食源性致病菌的抗逆機制研究。然而，與基因表達(dá)譜芯片技術(shù)相比，RNA-seq技術(shù)具有多個優(yōu)勢，包括測定細(xì)菌完整轉(zhuǎn)錄組圖譜、發(fā)現(xiàn)新轉(zhuǎn)錄本、獲得基因轉(zhuǎn)錄起始位點等。因此，RNA-seq技術(shù)將成為食源性致病菌抗逆機制研究的主流轉(zhuǎn)錄組測序手段。

3 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在食源性致病菌抗逆機制研究中的應(yīng)用

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)主要用于研究一個生物體（如食源性致病菌）在特定狀態(tài)下（如脅迫因子）的蛋白質(zhì)整體表達(dá)水平和變化規(guī)律。在過去20 年間，雙向電泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）、細(xì)胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標(biāo)記（stable isotope labeling by amino acids in cell culture，SILAC）、蛋白質(zhì)非標(biāo)記定量（label-free）、多維蛋白質(zhì)鑒定（multidimensional protein identification technology，MudPIT）和同位素標(biāo)記相對和絕對定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）等多種蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已被成功用于發(fā)掘食源性致病菌在物理因子（如高溫、低溫）、化學(xué)因子（如酸、鹽、乙醇）和食品基質(zhì)（如蛋清）脅迫下的差異表達(dá)蛋白質(zhì)（表3），為抗性形成機制的揭示提供了必要的候選蛋白質(zhì)。

表3 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在食源性致病菌抗逆機制研究中的應(yīng)用案例Table 3 Application of proteomics technology in investigations on stress response mechanisms of foodborne pathogens

3.1 2-DE技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展

建立于1975年的2-DE技術(shù)是一項經(jīng)典的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，其原理是基于蛋白質(zhì)的等電點和分子質(zhì)量差異來分離蛋白質(zhì)，并可結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)來鑒定差異蛋白質(zhì)。2-DE技術(shù)在單增李斯特菌的低溫適應(yīng)機制、克羅諾桿菌的滲透響應(yīng)機制以及副溶血弧菌的乙醇耐受機制等研究方面得到了應(yīng)用（表3）。

Cacace等借助2-DE技術(shù)開展蛋白質(zhì)組學(xué)研究，并結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrixassisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）鑒定差異蛋白質(zhì)，從而分析單增李斯特菌對低溫的適應(yīng)機制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單增李斯特菌在4 ℃條件下，共有65 個蛋白質(zhì)的表達(dá)發(fā)生顯著變化（57 個蛋白質(zhì)表達(dá)顯著上調(diào)、8 個蛋白質(zhì)表達(dá)顯著下調(diào)），這些蛋白質(zhì)主要與能量代謝、營養(yǎng)物質(zhì)吸收、蛋白質(zhì)合成、氧化應(yīng)激和脂質(zhì)合成等相關(guān)。

Riedel等通過2-DE和MALDI-TOF MS技術(shù)鑒定克羅諾桿菌響應(yīng)滲透脅迫的相關(guān)蛋白質(zhì)。他們分別采用物理干燥和直接添加氯化鈉來營造兩種不同類型的滲透脅迫，并在滲透處理的菌體中鑒定到80 個顯著差異表達(dá)的蛋白點，這些蛋白點對應(yīng)了53 個顯著差異表達(dá)蛋白質(zhì)。表達(dá)顯著上調(diào)的蛋白質(zhì)主要是DNA/RNA穩(wěn)定酶、分子伴侶和氧化應(yīng)激酶，表達(dá)顯著下調(diào)的蛋白質(zhì)主要是鞭毛結(jié)構(gòu)蛋白和細(xì)胞隔膜相關(guān)蛋白。

Chiang等通過2-DE技術(shù)研究副溶血弧菌的乙醇耐受機制，發(fā)現(xiàn)乙醇脅迫導(dǎo)致該菌8 個蛋白質(zhì)的表達(dá)上調(diào)、7 個蛋白質(zhì)的表達(dá)下調(diào)，但是這些蛋白質(zhì)大都未被鑒定。此外，免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)，一個類似于GroEL的蛋白質(zhì)的表達(dá)被乙醇脅迫所誘導(dǎo)，說明該蛋白質(zhì)參與了副溶血弧菌的乙醇脅迫應(yīng)答反應(yīng)。

由此可知，2-DE技術(shù)過去在食源性致病菌的抗逆機制研究中得到了較廣泛的應(yīng)用。然而，由于該方法的靈敏度低、重復(fù)性差、蛋白質(zhì)覆蓋率低，無法對整個基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定和定量。因此，SILAC、Label-free、MudPIT和iTRAQ等定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法應(yīng)運而生。

3.2 SILAC技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展

SILAC技術(shù)是在添加有輕型、中型和重型同位素標(biāo)記的必需氨基酸（如賴氨酸和精氨酸）的培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，使得培養(yǎng)若干代細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)能夠被同位素標(biāo)記，然后將蛋白質(zhì)等量混合并進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。目前，該技術(shù)在食源性致病菌抗逆機制研究中的應(yīng)用相對較少，主要集中于副溶血弧菌低溫脅迫適應(yīng)機制研究。例如，Ma Weixing等利用SILAC技術(shù)分析副溶血弧菌應(yīng)對4 ℃低溫脅迫的蛋白質(zhì)表達(dá)譜變化，共鑒定到1 182 個蛋白質(zhì)，并對其中的601 個蛋白質(zhì)進(jìn)行了定量分析，結(jié)果表明，低溫脅迫導(dǎo)致副溶血弧菌51 個蛋白質(zhì)的表達(dá)顯著上調(diào)，129 個蛋白質(zhì)的表達(dá)顯著下調(diào)。KEGG通路分析結(jié)果顯示，這些差異表達(dá)蛋白質(zhì)主要集中于磷酸戊糖途徑、糖酵解、三羧酸循環(huán)、轉(zhuǎn)錄、翻譯等通路。在后續(xù)的SILAC技術(shù)優(yōu)化過程中，可以重點針對價格昂貴、脫靶率高等問題展開攻關(guān)，從而擴大其在食品安全領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。

3.3 Label-free技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展

Label-free技術(shù)無需同位素標(biāo)記，通過比較質(zhì)譜峰強度或質(zhì)譜分析次數(shù)，測定不同組別樣品中的蛋白質(zhì)表達(dá)差異。目前，Label-free技術(shù)在食源性致病菌抗逆機制研究中的應(yīng)用相對較少，主要用于探究大腸桿菌的熱應(yīng)激反應(yīng)。例如，Tian Xiaojing等利用Label-free技術(shù)探究大腸桿菌O157:H7對歐姆加熱的應(yīng)答反應(yīng)，共鑒定到2 633 個蛋白質(zhì)。其中，高強度（10 V/cm）和低強度（5 V/cm）的歐姆加熱分別導(dǎo)致169 個和84 個蛋白質(zhì)的表達(dá)發(fā)生顯著變化，這些蛋白質(zhì)主要集中于二羧酸代謝、ABC轉(zhuǎn)運、氨基酸合成、甘油磷脂代謝、核糖體代謝等通路。由于Label-free技術(shù)成本較低，并可提高蛋白質(zhì)定量的準(zhǔn)確性和低豐度蛋白質(zhì)的檢測效率，因此在未來研究食源性致病菌的抗逆機制時可以合理選用。

3.4 MudPIT技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展

MudPIT是多維蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)，該技術(shù)先通過特異性的胰蛋白酶消化產(chǎn)生多肽，然后進(jìn)行多維毛細(xì)管液相色譜分離，最后進(jìn)行電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜分析。目前，MudPIT技術(shù)主要用于腸炎沙門氏菌應(yīng)答低溫等離子體脅迫以及單增李斯特菌應(yīng)答乳酸鏈球菌素、氫氧化鈉脅迫方面的研究（表3）。

Miyamoto等利用MudPIT技術(shù)探索單增李斯特菌對乳酸鏈球菌素的應(yīng)答機制，發(fā)現(xiàn)有13 個蛋白質(zhì)的表達(dá)發(fā)生了顯著變化（9 個蛋白質(zhì)表達(dá)顯著上調(diào)、4 個蛋白質(zhì)表達(dá)顯著下調(diào)），以上蛋白質(zhì)主要與代謝過程、氧化應(yīng)答、運動性等相關(guān)。此外，Ritter等借助MudPIT技術(shù)分析腸炎沙門氏菌在低溫等離子體處理下的蛋白質(zhì)表達(dá)譜變化，共在處理組菌體中鑒定到249 個特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)主要與乙二醛酶I、ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)底物結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)錄激活因子、氧化還原酶等相關(guān)。MudPIT技術(shù)可對樣品量較少的蛋白質(zhì)進(jìn)行快速分析，但不能提供蛋白質(zhì)翻譯后修飾的相關(guān)信息，因此可根據(jù)研究目的合理地將該技術(shù)用于食源性致病菌抗逆機制研究。

3.5 iTRAQ技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展

iTRAQ是美國AB SCIEX公司推出的體外同位素標(biāo)記新技術(shù)，采用同位素標(biāo)記多肽的氨基基團(tuán)，并結(jié)合高精度的串聯(lián)質(zhì)譜分析，從而對不同樣品中的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量。該方法靈敏度高、重復(fù)性好，近年來在阪崎克羅諾桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、空腸彎曲桿菌等重要食源性致病菌的抗逆機制研究中得到了較廣泛的應(yīng)用（表3）。

Hu Shuangfang等利用iTRAQ技術(shù)發(fā)掘阪崎克羅諾桿菌應(yīng)對干燥脅迫的相關(guān)蛋白質(zhì)，共鑒定到87 個表達(dá)顯著上調(diào)的蛋白質(zhì)和146 個表達(dá)顯著下調(diào)的蛋白質(zhì)?；虮倔w論（gene ontology，GO）和KEGG分析結(jié)果顯示，滲透脅迫相關(guān)蛋白質(zhì)的合成被干燥脅迫所誘導(dǎo)，而毒力、黏附和鞭毛相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)在干燥脅迫后受到抑制，表明這些通路參與了阪崎克羅諾桿菌干燥抗性的形成。

Thai等以氟喹諾酮誘導(dǎo)的金黃色葡萄球菌耐藥菌株為研究對象，利用iTRAQ技術(shù)發(fā)掘到147 個與耐藥性形成相關(guān)的蛋白質(zhì)，并借助熒光定量PCR實驗確證了蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果的可靠性。String分析結(jié)果進(jìn)一步顯示，代謝途徑、氨酰-tRNA合成和核糖體相關(guān)蛋白質(zhì)的互作關(guān)系密切，暗示了這些通路在金黃色葡萄球菌氟喹諾酮耐藥性形成中可能發(fā)揮重要作用。

本團(tuán)隊將iTRAQ技術(shù)用于腸炎沙門氏菌這一重要食源性致病菌的抗逆機制研究，主要通過該技術(shù)發(fā)掘沙門氏菌抗逆相關(guān)的蛋白質(zhì)，并借助熒光定量PCR技術(shù)和基因敲除技術(shù)鑒定關(guān)鍵抗逆蛋白質(zhì)。例如，He Shoukui等通過iTRAQ技術(shù)發(fā)掘到腸炎沙門氏菌乙醇抗性形成相關(guān)的138 個蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)主要與ABC轉(zhuǎn)運子、代謝、調(diào)控子、核糖體和毒力島等通路相關(guān)。基因功能分析結(jié)果進(jìn)一步表明，ABC轉(zhuǎn)運子途徑的和嘌呤代謝通路的在抗性形成過程中發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用。此外，Qin Xiaojie等將iTRAQ技術(shù)應(yīng)用于腸炎沙門氏菌在蛋清逆境中的存活機制研究，發(fā)現(xiàn)分別有273、284 個和303 個蛋白質(zhì)的表達(dá)在50%、80%和100%蛋清的脅迫下發(fā)生顯著變化，大多數(shù)表達(dá)顯著上調(diào)的蛋白質(zhì)與鐵吸收、氨基酸合成、轉(zhuǎn)運子、調(diào)控子和應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)，大多數(shù)表達(dá)顯著下調(diào)的蛋白質(zhì)與能量代謝、運動和毒力相關(guān)。其中，應(yīng)激反應(yīng)途徑的硫酯酶基因缺失導(dǎo)致腸炎沙門氏菌在蛋清中的存活能力顯著降低，這可能與細(xì)胞膜的破裂和細(xì)胞形態(tài)的改變相關(guān)。

綜上可知，在眾多蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法中，2-DE技術(shù)過去在食源性致病菌的抗逆機制研究中應(yīng)用較多，但該技術(shù)具有靈敏度低、重復(fù)性差、蛋白質(zhì)覆蓋率低等缺點。因此，iTRAQ等定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)目前常用于發(fā)掘食源性致病菌抗逆相關(guān)蛋白質(zhì)。

4 代謝組學(xué)技術(shù)在食源性致病菌抗逆機制研究中的應(yīng)用

代謝組學(xué)技術(shù)是以生物體（如食源性致病菌）的所有代謝物為研究對象，考察分子質(zhì)量小于1 000 Da的小分子在特定狀態(tài)下（如脅迫因子）的含量變化規(guī)律。根據(jù)研究對象的差異，代謝組學(xué)可分為非靶向代謝組學(xué)（分析未知化合物）和靶向代謝組學(xué)（分析已知化合物）。根據(jù)分析手段的不同，代謝組學(xué)可分為氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）代謝組學(xué)和核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）代謝組學(xué)等。這些技術(shù)已在單增李斯特菌、大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等多種致病菌抵御環(huán)境壓力的研究方面取得了一些應(yīng)用（表4），在一定程度上推動了食源性致病菌抗逆機制的探索進(jìn)程。

表4 代謝組學(xué)技術(shù)在食源性致病菌抗逆機制研究中的應(yīng)用案例Table 4 Application of metabolomics technology in investigations on stress response mechanisms of foodborne pathogens

4.1 GC-MS技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展

GC-MS是以離子荷質(zhì)比（電荷-質(zhì)量比）測量為基礎(chǔ)的分析儀器，具有靈敏度高、分辨率高、重現(xiàn)性好、公共數(shù)據(jù)庫定性方便等優(yōu)勢。近年來，GC-MS技術(shù)在食源性致病菌應(yīng)答低溫、酸、鹽、抗生素等多種脅迫因子的研究中得到了應(yīng)用（表4）。例如，Singh等借助GC-MS技術(shù)分析單增李斯特菌對8 ℃低溫脅迫的代謝應(yīng)答響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)64 個代謝物的含量發(fā)生顯著變化（56 個代謝物的含量顯著增加、8 個代謝物的含量顯著降低）。其中，胞內(nèi)氨基酸、糖類、有機酸、多胺和相容性溶質(zhì)等物質(zhì)的含量增加，這些物質(zhì)可抑制冰晶的形成，保護(hù)單增李斯特菌免受低溫的損害。此外，吳芮庭采用GC-MS技術(shù)分析了鼠傷寒沙門氏菌敏感菌株、耐藥質(zhì)粒pHXY0908攜帶菌株、替加環(huán)素耐藥并攜帶pHXY0908菌株的代謝組學(xué)差異，發(fā)現(xiàn)氨基酸代謝、嘧啶代謝和ABC轉(zhuǎn)運是重要的代謝通路，其中氨基酸代謝通路中的-天冬氨酸是關(guān)鍵代謝物，可作為深入研究耐藥機制的切入點。

4.2 NMR技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展

NMR技術(shù)具有制樣簡單、重復(fù)性好、檢測無偏向性等優(yōu)點，可檢測微生物細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的生物化學(xué)變化。目前，NMR技術(shù)在食源性致病菌抗逆方面的應(yīng)用研究主要是由新加坡國立大學(xué)Yang Hongshun博士課題組開展的。該課題組成功利用該技術(shù)探索了大腸桿菌對電解水、乳酸、超聲等脅迫因子的代謝應(yīng)答響應(yīng)（表4）。例如，Liu Qin等利用NMR技術(shù)探索大腸桿菌對電解水的代謝應(yīng)答機制，發(fā)現(xiàn)亞抑菌濃度的電解水導(dǎo)致28 個代謝物（包括氨基酸、核苷酸、有機酸）的含量發(fā)生顯著變化。這些代謝物富集在30 個通路中，其中5 個通路與電解水應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)，分別為氨酰-tRNA生物合成，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成與降解，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，以及精氨酸和脯氨酸代謝。

鑒于GC-MS技術(shù)和NMR技術(shù)在致病菌抗逆機制研究方面的優(yōu)勢，后續(xù)研究可進(jìn)一步拓展這些技術(shù)的應(yīng)用范圍。此外，利用這些技術(shù)發(fā)掘出的關(guān)鍵代謝物，有望作為食源性致病菌抗逆菌株的生物標(biāo)志物，用于抗逆菌株檢測技術(shù)的建立。

5 多組學(xué)技術(shù)聯(lián)合分析在食源性致病菌抗逆機制研究中的應(yīng)用

食源性致病菌在應(yīng)對外界脅迫時，會啟動不同的生理生化代謝系統(tǒng)，以適應(yīng)環(huán)境變化。因此，食源性致病菌抗逆性的形成是多個代謝通路協(xié)調(diào)作用的復(fù)雜調(diào)控過程，僅從基因、sRNA、蛋白質(zhì)或代謝物等層次中的任一方面都無法完整揭示其中的分子機制。多組學(xué)聯(lián)合分析是突破單一組學(xué)研究瓶頸的有效方法，可從轉(zhuǎn)錄到代謝層面反映致病菌變化的全過程，實現(xiàn)不同層次數(shù)據(jù)的整合互補，從而推動食源性致病菌抗逆機制的全面解析。在過去數(shù)年間，多組學(xué)聯(lián)合分析技術(shù)已被用于食源性致病菌的抗逆機制研究，包括金黃色葡萄球菌對細(xì)菌素和單寧的應(yīng)激反應(yīng)、單增李斯特菌的堿耐受反應(yīng)以及空腸彎曲桿菌的酰胺醇類耐藥機制等方面（表5）。

表5 多組學(xué)技術(shù)聯(lián)合分析在食源性致病菌抗逆機制研究中的應(yīng)用案例Table 5 Application of multi-omics technologies in investigations on stress response mechanisms of foodborne pathogens

Du Hechao等應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)探究耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌對亞抑菌濃度細(xì)菌素Plantaricin GZ1-27的應(yīng)激反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)有1 090 個基因和418 個蛋白質(zhì)的表達(dá)發(fā)生顯著變化。其中，75.9%（173/228）的基因在mRNA和蛋白質(zhì)水平上的變化趨勢一致，說明轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)之間的關(guān)聯(lián)性較好。生物信息學(xué)分析結(jié)果進(jìn)一步顯示，在轉(zhuǎn)錄和翻譯層面均發(fā)生顯著變化的基因主要集中在菌膜形成、DNA復(fù)制與損傷修復(fù)、應(yīng)激反應(yīng)、嘌呤代謝和氨基酸代謝等途徑。細(xì)菌素Plantaricin GZ1-27引起的菌膜形成相關(guān)基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)變化，的確導(dǎo)致金黃色葡萄球菌菌膜形成受到抑制，在一定程度上證實了多組學(xué)技術(shù)聯(lián)合分析在食源性致病菌抗逆機制研究方面的應(yīng)用優(yōu)勢。

此外，借助轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)聯(lián)合分析，Liu Miaomiao等揭示了金黃色葡萄球菌耐甲氧西林菌株通過滲透壓、pH值、氨基酸合成與代謝、三羧酸循環(huán)、鐵離子代謝等方面的調(diào)控來應(yīng)答亞抑菌濃度的單寧脅迫，F(xiàn)leury等闡明了金黃色葡萄球菌通過調(diào)控滲透壓穩(wěn)態(tài)、氧化應(yīng)激、金屬離子轉(zhuǎn)運、ATP合成來應(yīng)答高溫脅迫。通過整合基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)，Kim等發(fā)現(xiàn)苯扎氯銨的使用會導(dǎo)致銅綠假單胞菌外排泵基因的過表達(dá)以及基因的突變，從而誘導(dǎo)該菌對多黏菌素B和其他抗生素產(chǎn)生耐藥性。此外，李會通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等3 種組學(xué)技術(shù)聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)空腸彎曲桿菌酰胺醇類耐藥性的形成主要與鞭毛組裝、ABC轉(zhuǎn)運蛋白、核糖體、趨化蛋白相關(guān)。

綜上可知，多組學(xué)技術(shù)聯(lián)合分析比單一組學(xué)分析在食源性致病菌抗逆機制研究方面更具優(yōu)勢。例如，轉(zhuǎn)錄組學(xué)與代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)，可實現(xiàn)差異基因和差異代謝物的共表達(dá)分析，促進(jìn)基因和代謝物變化之間的因果關(guān)系探究，進(jìn)而鎖定關(guān)鍵基因、代謝物和通路，系統(tǒng)解析致病菌的抗逆機制。因此，可將多組學(xué)技術(shù)聯(lián)合分析合理用于抗逆基因、sRNA、蛋白質(zhì)和代謝物的發(fā)掘工作，從而推動食源性致病菌抗逆分子機制的探索進(jìn)程。

6 結(jié) 語

基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等技術(shù)具有通量較高的優(yōu)勢，已在食源性致病菌抗逆機制解析方面得到了較為廣泛的應(yīng)用。綜合目前的文獻(xiàn)報道來看，通過比較外源理化因子施加與不施加條件下食源性致病菌的組學(xué)特征，或者解析抗逆菌株與敏感菌株的組學(xué)特征差異，進(jìn)而對差異基因、sRNA、蛋白質(zhì)和代謝物進(jìn)行GO功能聚類和KEGG代謝通路等方面的生物信息學(xué)分析，是組學(xué)技術(shù)在食源性致病菌抗逆機制研究中的主流研究思路。這些研究結(jié)果顯示，食源性致病菌抗性的形成并不是某個基因、sRNA、蛋白質(zhì)或代謝通路單獨作用的結(jié)果，而是多個基因、sRNA、蛋白質(zhì)和多個代謝物協(xié)調(diào)作用的綜合表現(xiàn)，涉及多個網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控。

在這一研究領(lǐng)域，以后可以重點考慮開展以下方面的工作：1）實現(xiàn)從單一組學(xué)研究到多組學(xué)整合分析的轉(zhuǎn)變，從而更全面更精準(zhǔn)地發(fā)掘關(guān)鍵抗逆元件，并且強化高通量組學(xué)技術(shù)在抗逆基因、sRNA和蛋白質(zhì)功能分析和互作模式構(gòu)建方面的應(yīng)用，從而揭示食源性致病菌抗性形成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和過程機制；2）建立以抗逆基因、抗逆sRNA、抗逆蛋白質(zhì)、抗逆代謝物和關(guān)鍵代謝通路為主體的抗性組數(shù)據(jù)庫，并且推動以這些抗逆元件為靶標(biāo)的新型控菌技術(shù)的建立，從而為保障食品安全和公眾健康作出重要貢獻(xiàn)。