豆芋異黃酮的制備及其對(duì)RIN-m5F細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

鄧 珂，陳 镠，楊良緣，胡 鈺，許光治，張有做，王 艷，倪勤學(xué)

（浙江農(nóng)林大學(xué)食品與健康學(xué)院，浙江 杭州 311300）

隨著人們生活水平的提高，糖尿病的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)不斷增長(zhǎng)，已經(jīng)成為繼心腦血管疾病和癌癥之后的人類第三大疾病，引起廣泛關(guān)注。糖尿病病因多種多樣，其中胰島β細(xì)胞功能紊亂是引發(fā)糖尿病的關(guān)鍵原因。先前大量研究證明，異黃酮類化合物具有抑制胰島β細(xì)胞凋亡、改善胰島素分泌能力、增強(qiáng)胰島β細(xì)胞功能的作用，對(duì)于預(yù)防糖尿病等代謝綜合征有著極其重要的意義。

豆芋（Medik.），豆科土圞兒屬纏繞藤本植物，別名美國(guó)花生、菜豆等。豆芋（指塊莖，下同）產(chǎn)量高、口感好，曾是北美洲主要的糧食作物，也因此被稱為“北美洲最好的野生根莖食品”，在歐美及日本地區(qū)已有廣泛的種植與應(yīng)用。2009年我國(guó)引入豆芋，目前在浙江省杭州、寧波、溫州、金華地區(qū)均有栽培和應(yīng)用。豆芋富含氨基酸、可溶性蛋白、總糖、總黃酮、異黃酮等多種活性成分，這些活性成分具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、降血壓、降血糖等藥理作用。豆芋中異黃酮含量高達(dá)41.59 mg/g，是極佳的異黃酮來(lái)源。異黃酮具有抗氧化、抗癌、類雌激素、改善骨質(zhì)疏松、預(yù)防代謝綜合征等作用。

異黃酮的常見(jiàn)提取方法有浸提法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、超高壓提取法等，其中浸提法提取效率高、成本低，但是有機(jī)溶劑易揮發(fā)，所得異黃酮純度低，故本研究采用加熱回流輔助有機(jī)溶劑浸提，再進(jìn)一步采用有機(jī)溶劑萃取、大孔樹(shù)脂富集異黃酮。大孔樹(shù)脂吸附力較強(qiáng)、穩(wěn)定性好、方便快捷、可重復(fù)利用、成本低，被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的分離純化，大豆、葛根異黃酮經(jīng)大孔樹(shù)脂富集后，其異黃酮含量顯著提高，抗氧化活性、-葡萄糖苷酶抑制能力顯著增加。

本實(shí)驗(yàn)在豆芋醇提物和乙酸乙酯萃取物的基礎(chǔ)上探究豆芋異黃酮大孔樹(shù)脂富集工藝，并對(duì)富集得到的異黃酮進(jìn)行抗氧化活性、-葡萄糖苷酶抑制能力、RIN-m5F細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用進(jìn)行分析，以期為后續(xù)開(kāi)發(fā)功能性食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、材料與試劑

大鼠胰島素瘤細(xì)胞RIN-m5F購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院昆明細(xì)胞庫(kù)。

豆芋于2019年9月采自浙江農(nóng)林大學(xué)平山實(shí)驗(yàn)基地。

大孔樹(shù)脂D101、DM130、NKA-9、AB-8、HPD100、HPD450 上海摩速科學(xué)器材有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）、2,2’-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、硫辛酸（-lipoic acid，-LA）、染料木苷 上海阿拉丁化學(xué)試劑有限公司；-葡萄糖苷酶、4-硝基苯基---吡喃葡萄糖苷（-nitrophenyl---galactopyranoside，PNPG）、過(guò)氧化氫 美國(guó)Sigma公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、RPMI 1640培養(yǎng)基、0.25%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）胰酶、雙抗（青霉素、鏈霉素）、噻唑藍(lán)（methylthiazol tetrazolium，MTT）美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RV 3eco旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國(guó)艾卡儀器有限公司；UV-5500紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；Multiskan spectrum全波段酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；VIYEE倒置生物顯微鏡 天津微儀光學(xué)儀器有限公司；CO培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 異黃酮質(zhì)量濃度測(cè)定

異黃酮質(zhì)量濃度測(cè)定參考文獻(xiàn)[24]，采用紫外分光光度法測(cè)定510 nm波長(zhǎng)處樣品溶液吸光度。以染料木苷作為標(biāo)準(zhǔn)品，以染料木苷質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程＝0.100 1-0.020 7（＝0.999 5）。

1.3.2 豆芋異黃酮富集工藝

1.3.2.1 豆芋異黃酮的制備流程

豆芋采收后依次進(jìn)行清洗、晾干、切片、60 ℃烘箱干燥、粉碎，然后過(guò)80 目篩得到豆芋粉備用。

乙醇熱回流提?。喝《褂蠓郯凑樟弦罕?∶20（/）加入體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液提取2 h；提取溫度80 ℃。抽濾后將濾液40 ℃減壓濃縮至浸膏狀，得到豆芋醇提物（記為A），得率10.09%（占豆芋干基）、異黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)7.43%。

乙酸乙酯萃?。簩溶于等體積去離子水，然后按照體積比1∶1采用乙酸乙酯萃取3 次，合并乙酸乙酯層，40 ℃減壓濃縮至浸膏狀，得乙酸乙酯萃取物（記為A），得率1.46%（占豆芋干基）、異黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)21.19%。

1.3.2.2 大孔樹(shù)脂預(yù)處理

分別取6 種干燥的大孔樹(shù)脂5 g，用體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇溶液浸泡24 h，使樹(shù)脂充分溶脹，蒸餾水洗至無(wú)醇味且沖洗液無(wú)白色渾濁；再用1 mol/L HCl溶液浸泡24 h，蒸餾水洗至中性；最后用1 mol/L氫氧化鈉溶液浸泡24 h，蒸餾水洗至中性，備用。

1.3.2.3 大孔樹(shù)脂型號(hào)的選擇

取1.3.2.2節(jié)預(yù)處理后的大孔樹(shù)脂置于100 mL具塞錐形瓶中，稱4.01 g A，加純水溶解，配制為1 L 4.01 mg/mL的A上樣液，各取50 mL加入到預(yù)處理樹(shù)脂中，密塞，于25 ℃恒溫振蕩24 h。靜置后測(cè)定溶液中異黃酮的質(zhì)量濃度，按照公式（1）計(jì)算不同型號(hào)樹(shù)脂對(duì)異黃酮的吸附率。80 mL（4 倍柱體積）蒸餾水洗滌樹(shù)脂后，加入50 mL 80%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇溶液，密塞，于25 ℃恒溫振蕩24 h，測(cè)定溶液中異黃酮的質(zhì)量濃度，按照公式（2）計(jì)算不同型號(hào)的樹(shù)脂對(duì)異黃酮的解吸率。綜合選取吸附率和解吸率較高的大孔樹(shù)脂進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

式中：為吸附前樣品溶液豆芋異黃酮質(zhì)量濃度/（mg/mL）；為吸附后樣品溶液中異黃酮質(zhì)量濃度/（mg/mL）；為解吸后樣品溶液中異黃酮質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.2.4 最佳上樣質(zhì)量濃度的確定

稱取5 g D101型大孔樹(shù)脂按照1.3.2.2節(jié)方法預(yù)處理后濕法裝柱（11 mm×400 mm）。用蒸餾水分別配制20 mL不同質(zhì)量濃度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL）的A溶液，分別以1 mL/min的流速上柱吸附，收集流出溶液并測(cè)定異黃酮質(zhì)量濃度，并根據(jù)公式（1）計(jì)算吸附率，吸附率較高時(shí)對(duì)應(yīng)的上樣質(zhì)量濃度即為最佳上樣質(zhì)量濃度。

1.3.2.5 最佳洗脫劑體積分?jǐn)?shù)的確定

根據(jù)已確定的最佳上樣質(zhì)量濃度，以1 mL/min的流速上柱吸附，然后用80 mL（4 倍柱體積）蒸餾水洗滌。分別加入80 mL體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液并測(cè)定異黃酮質(zhì)量濃度，根據(jù)公式（2）計(jì)算解吸率，解吸率較高時(shí)對(duì)應(yīng)的洗脫劑體積分?jǐn)?shù)即為最佳洗脫劑體積分?jǐn)?shù)。

1.3.2.6 最佳洗脫體積的確定

根據(jù)已確定的最佳上樣質(zhì)量濃度，以1 mL/min的流速上柱吸附，然后用80 mL蒸餾水洗滌。分別加入20、40、60、80、100、120 mL最佳體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液并測(cè)定異黃酮質(zhì)量濃度，根據(jù)公式（2）計(jì)算解吸率，解吸率較高時(shí)對(duì)應(yīng)的洗脫體積即為最佳洗脫體積。

1.3.2.7 最佳洗脫劑pH值的確定

根據(jù)已確定的最佳上樣質(zhì)量濃度，以1 mL/min的流速上柱吸附，然后用80 mL蒸餾水洗滌。以1 mol/L HCl溶液、1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)洗脫劑pH值分別為5、6、7、8、9，分別取80 mL不同pH值洗脫劑進(jìn)行洗脫，收集洗脫液并測(cè)定異黃酮質(zhì)量濃度，根據(jù)公式（2）計(jì)算解吸率，解吸率較高時(shí)對(duì)應(yīng)的洗脫劑pH值即為最佳洗脫劑pH值。

根據(jù)以上大孔樹(shù)脂富集工藝得豆芋異黃酮（記為AI-3），45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無(wú)乙醇，冷凍干燥備用。測(cè)定AI-3中異黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.3 抗氧化活性測(cè)定

1.3.3.1 DPPH自由基清除能力

DPPH自由基清除能力測(cè)定參考文獻(xiàn)[26]并稍作修改。實(shí)驗(yàn)組：2 mL不同質(zhì)量濃度的A（100、200、500、1 000、1 500 μg/mL）、A（50、100、200、300、600 μg/mL）、AI-3（20、40、60、80、100 μg/mL）溶液分別與2 mL DPPH試劑（0.1 mmol/L）混合；對(duì)照組：2 mL樣品溶液與2 mL無(wú)水乙醇混合；空白對(duì)照組：2 mL無(wú)水乙醇與2 mL DPPH（0.1 mmol/L）試劑混合，避光反應(yīng)30 min。以VC（質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.0、2.5、3.0 μg/mL）為陽(yáng)性對(duì)照，于517 nm下測(cè)定吸光度值。并按公式（3）計(jì)算DPPH自由基清除率。采用SPSS軟件的回歸分析計(jì)算不同樣品對(duì)DPPH自由基的半抑制質(zhì)量濃度（half maximal inhibitory concentration，IC）。

式中：為空白對(duì)照組吸光度；為實(shí)驗(yàn)組吸光度；為對(duì)照組吸光度。

1.3.3.2 ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力

參考文獻(xiàn)[26]的方法略有改動(dòng)。實(shí)驗(yàn)組：0.1 mL不同質(zhì)量濃度的A（200、500、1 000、1 500、2 000 μg/mL）、A（100、200、400、800、1 200 μg/mL）、AI-3溶液（40、80、150、200、300 μg/mL）分別與3.9 mL ABTS陽(yáng)離子自由基工作液混合；對(duì)照組：0.1 mL不同質(zhì)量濃度的A、A、AI-3溶液分別與3.9 mL無(wú)水乙醇混合；空白對(duì)照組：0.1 mL無(wú)水乙醇與3.9 mL ABTS工作液混合，避光靜置7 min；以VC溶液（質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL）為陽(yáng)性對(duì)照，于734 nm下測(cè)定吸光度，按照公式（4）計(jì)算ABTS陽(yáng)離子自由基清除率。采用SPSS軟件的回歸分析計(jì)算不同樣品對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的IC。

式中：為空白對(duì)照組吸光度；為實(shí)驗(yàn)組吸光度；為對(duì)照組吸光度。

1.3.3.3 鐵離子還原抗氧化能力

參考趙建等的方法略有改動(dòng)。硫酸亞鐵標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：分別取0.1 mL不同濃度（0.07、0.14、0.28、0.42、0.56、0.70、0.84 mmol/L）的硫酸亞鐵溶液，加入0.3 mL去離子水和3.0 mL鐵離子還原抗氧化能力（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）工作液（300 mmol/L乙酸鈉溶液、10 mmol/L TPTZ溶液、20 mmol/L三氯化鐵溶液按體積比10∶1∶1配制），室溫避光反應(yīng)50 min，以等體積去離子水作為空白對(duì)照，測(cè)定593 nm波長(zhǎng)處吸光度，以硫酸亞鐵濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別取0.4 mL的200 μg/mL A、100 μg/mL A、40 μg/mL AI-3溶液與3.0 mL FRAP工作液反應(yīng)，以等體積VC溶液（10 μg/mL）為陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)定各組FRAP。

1.3.4-葡萄糖苷酶抑制作用測(cè)定

參考劉慧娟等的方法并加以改進(jìn)。實(shí)驗(yàn)組：100 μL不同質(zhì)量濃度的A（1、2、8、10、15 mg/mL）、A（0.5、1.0、2.0、5.0、8.0 mg/mL）、AI-3（0.5、1.0、2.0、5.0、8.0 mg/mL）溶液分別與100 μL-葡萄糖苷酶（0.01 mg/mL）混合，37 ℃反應(yīng)10 min，加入100 μL 2.5 mmol/L PNPG溶液，37 ℃反應(yīng)10 min，加入5 mL NaCO（0.1 mol/L）終止反應(yīng)，測(cè)定405 nm波長(zhǎng)處吸光度；空白組：以等體積去離子水代替樣品溶液，步驟同實(shí)驗(yàn)組；對(duì)照組：PBS（1×、pH 7.4，后同）代替酶液，步驟同實(shí)驗(yàn)組。以阿卡波糖（質(zhì)量濃度為0.02、0.05、0.1、0.2、1.0 mg/mL）為陽(yáng)性對(duì)照組，按照公式（5）計(jì)算-葡萄糖苷酶活力抑制率。

式中：為實(shí)驗(yàn)組吸光度；為對(duì)照組吸光度；為空白組吸光度。

1.3.5 細(xì)胞培養(yǎng)

參考文獻(xiàn)[29]的方法培養(yǎng)細(xì)胞。RIN-m5F細(xì)胞于含10%（體積分?jǐn)?shù)）FBS、1%（體積分?jǐn)?shù)）雙抗（0.1 U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素）的RPMI 1640培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基）中，37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。傳代2～3 次后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度1.0×10個(gè)/mL，備用。

1.3.6 氧化應(yīng)激模型的建立及樣品毒性實(shí)驗(yàn)

取1.3.5節(jié)細(xì)胞接種于96 孔板，每孔100 μL，于37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h，吸棄上清液，用PBS清洗細(xì)胞，然后建立氧化應(yīng)激模型。氧化應(yīng)激模型組：每孔加入100 μL含不同終作用濃度（10、25、50、100、150、200、300 μmol/L）HO的完全培養(yǎng)基，空白對(duì)照組加入等體積的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，參考文獻(xiàn)[29]采用MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率，選擇適當(dāng)?shù)腍O終作用濃度建立氧化應(yīng)激模型。

用完全培養(yǎng)基配制不同質(zhì)量濃度的A、A、AI-3培養(yǎng)基。取1.3.5節(jié)細(xì)胞接種于96 孔板，每孔100 μL，于37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h，吸棄上清液，用PBS清洗細(xì)胞，然后分組進(jìn)行樣品毒理性實(shí)驗(yàn)。A處理組：每孔加入100 μL不同終質(zhì)量濃度（25、50、100、200、400、800、1 600 μg/mL）A培養(yǎng)基；A處理組：每孔加入100 μL不同終質(zhì)量濃度（25、50、100、200、400、800 μg/mL）A培養(yǎng)基；AI-3處理組：每孔加入100 μL不同終質(zhì)量濃度（25、50、100、200、300、400 μg/mL）AI-3培養(yǎng)基；空白對(duì)照組加入同等體積的完全培養(yǎng)基；于37 ℃孵育24 h。每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，參考文獻(xiàn)[29]采用MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率，確定A、A、AI-3的安全作用質(zhì)量濃度范圍。

1.3.7 樣品處理及分組

用完全培養(yǎng)基配制不同質(zhì)量濃度的A、A、AI-3、-LA培養(yǎng)基。取1.3.5節(jié)細(xì)胞接種于96 孔板，每孔100 μL，于37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h，吸棄上清液，用PBS清洗細(xì)胞，然后進(jìn)行分組處理?？瞻讓?duì)照組（每孔加入100 μL培養(yǎng)基）、HO損傷組（每孔加入100 μL培養(yǎng)基）、陽(yáng)性對(duì)照組（每孔加入100 μL終濃度50 μmol/L-LA培養(yǎng)基）、A處理組（每孔分別加入100 μL終質(zhì)量濃度25、50、100、200、400、800 μg/mL A培養(yǎng)基）、A處理組（每孔分別加入100 μL終質(zhì)量濃度25、50、100、200、400 μg/mL A培養(yǎng)基）、AI-3處理組（每孔分別加入100 μL終質(zhì)量濃度25、50、100、200、300 μg/mL AI-3培養(yǎng)基）于37 ℃培養(yǎng)24 h。然后各樣品處理組、陽(yáng)性對(duì)照組、HO損傷組分別按照100 μL/孔加入含終濃度150 μmol/L HO的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)1 h，吸棄上清液，將細(xì)胞用PBS清洗2 次。每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔。參考文獻(xiàn)[29]采用MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率，分析A、A、AI-3對(duì)RIN-m5F細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)平行，結(jié)果均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，并采用Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，＜0.05為差異顯著，＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹(shù)脂富集豆芋異黃酮工藝的優(yōu)化

2.1.1 樹(shù)脂型號(hào)的篩選

由圖1A可知，6 種大孔樹(shù)脂中，D101和AB-8這兩種型號(hào)的吸附率高于其他4 種樹(shù)脂；而D101和DM130的解吸率優(yōu)于其他4 種樹(shù)脂。D101在吸附和解吸方面均優(yōu)于其他5 種大孔樹(shù)脂，因此選擇D101樹(shù)脂富集豆芋異黃酮。

2.1.2 樣品質(zhì)量濃度對(duì)吸附率的影響

如圖1B所示，樣品質(zhì)量濃度增大時(shí)，吸附率亦隨之逐漸增大；當(dāng)質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL時(shí)，吸附率達(dá)到最大值（83.48%）；樹(shù)脂吸附狀態(tài)達(dá)到飽和，繼續(xù)增大樣品質(zhì)量濃度，吸附率則逐漸下降。故最佳上樣質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL。

2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸作用的影響

如圖1C所示，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，解吸率也逐漸增加；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%時(shí)，解吸率達(dá)到最大值（80.61%）；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)持續(xù)增加，解吸率開(kāi)始下降，最后趨于平緩。這可能與洗脫劑極性有關(guān)，極性偏大或偏小都不利于異黃酮的洗脫，故最佳洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%。

2.1.4 洗脫體積對(duì)解吸作用的影響

由圖1D可知，采用體積分?jǐn)?shù)80%乙醇溶液、流速1.0 mL/min洗脫，解吸率隨洗脫體積增大呈先上升后下降的趨勢(shì)。在洗脫體積為80 mL時(shí)，解吸率達(dá)到最大值（84.63%）。當(dāng)洗脫體積為120 mL時(shí)，流出液基本無(wú)色，說(shuō)明吸附在D101樹(shù)脂上的異黃酮類物質(zhì)基本已被洗脫，故最佳洗脫體積為80 mL（4 倍柱體積）。

2.1.5 洗脫劑pH值對(duì)解吸作用的影響

由圖1E可知，pH＜6時(shí)，解吸率隨著pH值升高而逐漸增大；當(dāng)pH 6時(shí)，解吸率達(dá)到最大值（80.14%）；繼續(xù)增加pH值，吸附率逐漸下降。故最佳洗脫劑pH值為6。pH值過(guò)高或過(guò)低都不利于黃酮類化合物的吸附和解吸，這是因?yàn)辄S酮類化合物存在形式隨著pH值的改變而改變，或形成鹽，或分子失去羥基上的H以負(fù)離子形式存在，2 種存在方式都不利于大孔樹(shù)脂的吸附。

圖1 大孔樹(shù)脂富集豆芋異黃酮工藝優(yōu)化Fig. 1 Optimization of enrichment process of isoflavones from the tuber of A. americana Medik. using macroporous resin

經(jīng)優(yōu)化的大孔樹(shù)脂富集工藝得豆芋異黃酮（AI-3），得率0.44%（占豆芋干基），異黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50.83%。

2.2 AI-3抗氧化活性及α-葡萄糖苷酶抑制作用

A、A及AI-3的抗氧化活性（對(duì)DPPH自由基、ABTS陽(yáng)離子自由基的IC和FRAP）及-葡萄糖苷酶抑制能力結(jié)果見(jiàn)表1。不同評(píng)價(jià)指標(biāo)中A、A及AI-3的抗氧化能力趨勢(shì)一致，由大到小依次為：AI-3＞A＞A。醇提物經(jīng)過(guò)乙酸乙酯萃取、D101大孔樹(shù)脂富集后抗氧化能力顯著增加（＜0.05），這是因?yàn)楦患^(guò)程中過(guò)濾掉許多雜質(zhì)，活性物質(zhì)異黃酮的質(zhì)量濃度增加，故抗氧化能力顯著增加。A、A對(duì)DPPH自由基的IC分別是AI-3（19.51 μg/mL）的16.98、3.08 倍，追風(fēng)七總異黃酮對(duì)DPPH自由基的IC（57.4 μg/mL）是AI-3的2.94 倍；A、A對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的IC分別是AI-3（3.40 μg/mL）的7.31、2.31 倍；說(shuō)明AI-3的自由基清除效果基本接近于VC。AI-3的FRAP為387.83 μmol/mg，分別是A、A的9.3、1.71 倍。

表1 AI-3抗氧化活性及α-葡萄糖苷酶抑制能力Table 1 Antioxidant and α-glucosidase inhibitory activities of AI-3

A、A對(duì)-葡萄糖苷酶活力的IC分別是AI-3（235.974 μg/mL）的5.01、1.80 倍，葛根提取物對(duì)-葡萄糖苷酶活力的IC（3.7 g/L）是AI-3的15.68 倍。

2.3 AI-3對(duì)RIN-m5F細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

2.3.1 氧化應(yīng)激模型的建立

大量研究采用HO誘導(dǎo)胰島細(xì)胞損傷，建立胰島細(xì)胞氧化應(yīng)激模型。氧化應(yīng)激對(duì)胰島細(xì)胞造成損傷，導(dǎo)致糖尿病發(fā)生。如圖2所示，50～300 μmol/L HO損傷細(xì)胞1 h，細(xì)胞存活率顯著下降（＜0.05）。150、200 μmol/L HO細(xì)胞凋亡率接近50%，結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果和細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，本研究選用150 μmol/L HO處理細(xì)胞1 h建立RIN-m5F細(xì)胞氧化應(yīng)激模型。

圖2 H2O2對(duì)RIN-m5F細(xì)胞存活率的影響Fig. 2 Effect of H2O2 on the survival rate of RIN-m5F cells

2.3.2 AI-3對(duì)RIN-m5F細(xì)胞增殖活力的影響

如圖3所示，0～800 μg/mL A處理24 h后RIN-m5F細(xì)胞存活率與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（＞0.05），而1 600 μg/mL A處理24 h后RIN-m5F細(xì)胞存活率（81.58%）顯著低于對(duì)照組（＜0.05），表明在0～800 μg/mL為A的安全作用質(zhì)量濃度。而A、AI-3分別在0～400、0～300 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)RIN-m5F細(xì)胞存活率與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（＞0.05），表明A、AI-3的安全作用質(zhì)量濃度分別為0～400、0～300 μg/mL。

圖3 RIN-m5F細(xì)胞增殖活力變化Fig. 3 Changes in proliferation activity of RIN-m5fF cells

2.3.3 AI-3對(duì)RIN-m5F細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

如圖4所示，A在安全作用質(zhì)量濃度（0～800 μg/mL）范圍內(nèi)對(duì)RIN-m5F細(xì)胞存活率的影響同HO損傷組無(wú)顯著差異（＞0.05）；200～400 μg/mL A對(duì)RIN-m5F細(xì)胞存活率的影響同HO損傷組差異極顯著（＜0.01）；25～300 μg/mL AI-3組細(xì)胞存活率均極顯著高于HO損傷組（＜0.01），當(dāng)AI-3達(dá)到安全作用質(zhì)量濃度上限（300 μg/mL）時(shí)，細(xì)胞存活率達(dá)到最大，為84.19%，高于陽(yáng)性對(duì)照組。

圖4 AI-3對(duì)RIN-m5F細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用Fig. 4 Protective effect of AI-3 against oxidative damage to RIN-m5F cells

3 討 論

大分子糖類在-葡萄糖苷酶作用下被分解成單糖，利于機(jī)體吸收，繼而導(dǎo)致體內(nèi)高血糖，機(jī)體長(zhǎng)時(shí)間維持高血糖水平會(huì)引發(fā)糖尿病等一系列代謝綜合征。抑制-葡萄糖苷酶活性，延緩碳水化合物的消化和吸收，降低餐后血糖水平，可以改善餐后高血糖和高胰島素血癥。胰島β細(xì)胞容易受到氧化應(yīng)激，繼而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、胰島素分泌功能降低、胰島β細(xì)胞功能紊亂。研究表明，I型糖尿病診斷初期，胰島β細(xì)胞量急劇減少70%～80%，并伴隨著嚴(yán)重的代謝失調(diào)；II型糖尿病中，β細(xì)胞損傷達(dá)25%～50%，因此，抑制-葡萄糖苷酶活性、保護(hù)胰島β細(xì)胞功能是防治糖尿病的根本。黃酮類化合物可通過(guò)抑制胰島β細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)胰島素分泌發(fā)揮降血糖作用，具有降血糖活性的黃酮類化合物主要集中于黃酮醇類、黃酮類、花青素類、二氫黃酮類、異黃酮類、黃烷-3-醇類等。

本研究采用大孔樹(shù)脂優(yōu)化豆芋異黃酮富集工藝，通過(guò)優(yōu)化樹(shù)脂型號(hào)、上樣質(zhì)量濃度、洗脫劑pH值、乙醇體積分?jǐn)?shù)及洗脫體積5 個(gè)單因素條件，得到最佳富集工藝：采用D101樹(shù)脂、上樣質(zhì)量濃度1.5 mg/mL、體積分?jǐn)?shù)80%乙醇溶液（pH 6）洗脫、洗脫體積80 mL（4 倍柱體積），異黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50.83%。AI-3對(duì)DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基具有顯著的清除能力（IC分別為19.51、3.40 μg/mL），接近于VC，并對(duì)鐵離子表現(xiàn)出了較強(qiáng)的還原能力，說(shuō)明AI-3的體外抗氧化能力較強(qiáng)。AI-3對(duì)-葡萄糖苷酶活力亦有較強(qiáng)的抑制能力（IC為235.97 μg/mL）。

氧化應(yīng)激與代謝綜合征如高脂血癥、糖尿病、高血壓等疾病的發(fā)生和發(fā)展緊密相關(guān)，因此本研究采用HO誘導(dǎo)RIN-m5F細(xì)胞損傷建立氧化應(yīng)激模型。RIN-m5F細(xì)胞受到HO損傷，產(chǎn)生大量的活性氧，細(xì)胞自身對(duì)這些氧化物的清除能力不夠，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞大量凋亡。本研究從預(yù)防β細(xì)胞凋亡入手，探究豆芋異黃酮AI-3對(duì)RIN-m5F細(xì)胞存活率的影響，同時(shí)在氧化損傷前進(jìn)行AI-3干預(yù)，研究AI-3對(duì)HO誘導(dǎo)RIN-m5F細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。結(jié)果表明，25～300 μg/mL的AI-3對(duì)RIN-m5F細(xì)胞無(wú)毒性，且可極顯著提高氧化損傷RIN-m5F細(xì)胞存活率（＜0.01），當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)300 μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率達(dá)84.19%，高于陽(yáng)性對(duì)照組。本實(shí)驗(yàn)只探討了豆芋異黃酮AI-3對(duì)氧化損傷RIN-m5F細(xì)胞存活率的影響，后續(xù)還需繼續(xù)探究AI-3對(duì)RIN-m5F細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用機(jī)制。

綜上所述，在優(yōu)化條件下D101大孔樹(shù)脂可有效富集豆芋異黃酮，所得組分AI-3具有較強(qiáng)的抗氧化活性、-葡萄糖苷酶抑制作用及RIN-m5F細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用。研究結(jié)果可為開(kāi)發(fā)預(yù)防糖尿病等代謝綜合征功能性食品提供理論依據(jù)。