黃玉潔,郝儀銘,2,周夢(mèng)晴,伍梓健,楊玉紅,劉小芳,王保珍,杜 磊,2,*
(1.山東大學(xué)齊魯醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院,山東 濟(jì)南 250012;2.山東大學(xué)附屬濟(jì)南市中心醫(yī)院專科轉(zhuǎn)化研究中心,山東 濟(jì)南 250013;3.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 濟(jì)南 250353;4.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部極地漁業(yè)開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266071)
肝臟作為人體最大的實(shí)質(zhì)器官,具有分泌膽汁、代謝、凝血、解毒和免疫等功能,在維持人體健康生理活動(dòng)中起至關(guān)重要的作用。病毒感染、氧化應(yīng)激、酒精、藥物等多種因素可導(dǎo)致急性肝損傷,嚴(yán)重者甚至發(fā)展為肝衰竭,造成重大健康威脅。因此,尋找新的并且安全有效的肝損傷保護(hù)食品功能因子具有重要意義。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的組成成分,在急性肝損傷的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用。因此,LPS誘導(dǎo)的急性肝損傷動(dòng)物模型常被用來(lái)探尋能有效防治急性肝損傷的干預(yù)措施。
海洋食品富含-3系多不飽和脂肪酸,特別是二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)和二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA),二者具有抗炎、改善糖脂代謝、促進(jìn)視覺(jué)和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等多種生物活性。不同海洋食品中DHA和EPA存在的分子形式不同,南海鳶烏賊()屬于鞘亞綱、槍形目、柔魚科,其生命周期短、生長(zhǎng)率高、繁殖力強(qiáng),是一種極具開(kāi)發(fā)潛力的頭足類海洋漁業(yè)資源。我國(guó)南海海域鳶烏賊資源豐富,其高值化加工利用是當(dāng)前的熱點(diǎn)問(wèn)題。冰島刺參()屬于海參綱、枝手目、瓜參科,是我國(guó)市場(chǎng)上消費(fèi)量較大的低值海參品種。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),南海鳶烏賊卵以及冰島刺參體壁中分別富含磷脂型DHA(DHA-enriched phospholipids,DHA-PL)和磷脂型EPA(EPA-enriched phospholipids,EPA-PL),且其對(duì)高脂飲食所致代謝綜合征具有良好預(yù)防作用。與其他分子形式DHA和EPA相比,DHA-PL和EPA-PL的生物利用率更高,且具有更好的抗氧化穩(wěn)定性。然而,目前鮮見(jiàn)DHA-PL和EPA-PL對(duì)LPS誘導(dǎo)的急性肝損傷影響的報(bào)道。因此,本研究考察DHA-PL和EPA-PL對(duì)LPS所致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用并初步分析其分子機(jī)制,以期為南海鳶烏賊和冰島刺參的高值化利用以及開(kāi)發(fā)具有保肝護(hù)肝功效的新型海洋食品功能因子提供理論依據(jù)。
雄性6 周齡健康C57BL/6J小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2016-0006,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(魯)2020-0022。
南海鳶烏賊和冰島刺參 青島市南山水產(chǎn)市場(chǎng);LPS 美國(guó)Sigma-Aldrich公司;天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)試劑盒 南京建成生物工程有限公司;二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)和動(dòng)物組織RNA提取試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司;小鼠腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β和IL-6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒 美國(guó)R&D Systems公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)試劑盒 日本TaKaRa公司;絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)如細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases 1/2,ERK1/2)、磷酸化ERK1/2(phosphorylated-ERK1/2,p-ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、磷酸化JNK(phosphorylated-JNK,p-JNK)、p38、磷酸化p38(phosphorylated-p38,p-p38)、核因子(nuclear factor,NF)-κB p65、磷酸化NF-κB p65(phosphorylated-NF-κB p65,p-NF-κB p65)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)以及山羊抗兔免疫球蛋白G辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗 美國(guó)Cell Signaling Technology公司。
BSA224S-CW電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;5430R離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司;Bioprep-24R制冷型生物樣品均質(zhì)儀 杭州奧盛儀器有限公司;Excelsior AS全自動(dòng)組織脫水機(jī)、CTM6石蠟封片機(jī)和Gemini AS自動(dòng)玻片染色機(jī) 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;EC 350-1包埋機(jī)和HM 325切片機(jī)德國(guó)Microm公司;LightCycler 480實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng) 瑞士Roche公司;IX70型倒置熒光顯微鏡日本Olympus公司;Infinite M200 Pro多功能酶標(biāo)儀瑞士TECAN公司。
1.3.1 DHA-PL和EPA-PL的制備
參照課題組前期研究方法分別從南海鳶烏賊卵以及冰島刺參體壁中提取、分離和純化DHA-PL和EPA-PL。制備得到的DHA-PL和EPA-PL經(jīng)高效液相色譜法檢測(cè)純度分別為93.7%和92.5%。氣相色譜法分析結(jié)果顯示,DHA-PL中DHA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為38.3%,EPA-PL中EPA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為42.0%。
1.3.2 動(dòng)物模型的建立和處理
32 只雄性6 周齡C57BL/6J小鼠于SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng),溫度(22±2)℃、相對(duì)濕度(50±10)%、12 h/12 h光照循環(huán)。實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由飲食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵照山東大學(xué)公共衛(wèi)生倫理委員會(huì)相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后,按隨機(jī)數(shù)字表法分為4 組,每組8 只:正常對(duì)照組(Control)、模型組(LPS)、DHA-PL干預(yù)組(LPS+DHA-PL)和EPA-PL干預(yù)組(LPS+EPA-PL)?!吨袊?guó)居民膳食營(yíng)養(yǎng)素參考攝入量(2013版)》中將成年人DHA+EPA的宏量營(yíng)養(yǎng)素可接受范圍(acceptable macronutrient distribution ranges,AMDR)定為0.25~2.00 g/d,結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果,DHA-PL和EPA-PL分別制備成脂質(zhì)體并以400 mg/kg劑量連續(xù)給予小鼠灌胃28 d,灌胃體積為10 mL/kg。Control組和LPS組小鼠每天按20 mL/kg灌胃生理鹽水。第29天時(shí),Control組小鼠經(jīng)腹腔注射無(wú)菌生理鹽水,其余小鼠腹腔注射劑量為10 mg/kg的LPS,注射體積為10 mL/kg,建立急性肝損傷模型。6 h后,小鼠摘眼球取血,室溫靜置30 min后,1 000×、4 ℃離心10 min,分離收集血清備用。隨后,小鼠引頸處死,取肝臟并稱質(zhì)量,計(jì)算肝指數(shù)(肝質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量×100%),肝臟保存于-80 ℃進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
1.3.3 血清ALT和AST活力測(cè)定
按對(duì)應(yīng)試劑盒說(shuō)明書測(cè)定小鼠血清ALT和AST活力。
1.3.4 肝組織病理學(xué)檢查
取小鼠相同部位的肝組織置于10%中性福爾馬林溶液固定48 h,經(jīng)脫水、浸蠟、包埋和切片等步驟制成4 μm厚的石蠟切片,蘇木精-伊紅染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠肝組織病理學(xué)變化。
1.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定促炎細(xì)胞因子mRNA相對(duì)表達(dá)水平
利用RNA柱式提取試劑盒提取各組小鼠肝組織中總RNA,檢測(cè)RNA濃度和完整性后取1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。設(shè)計(jì)合成引物并以cDNA作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。以作為內(nèi)參,根據(jù)2計(jì)算基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平。本研究所用引物(表1)委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
表1 本研究所用基因引物序列Table 1 Primer sequences used in this study
1.3.6 小鼠肝臟中促炎細(xì)胞因子含量的測(cè)定
稱取0.1 g小鼠肝組織,按1∶9(/)的比例加入預(yù)冷生理鹽水,在制冷型生物樣品均質(zhì)儀中勻漿,12 000×、4 ℃條件下離心15 min,收集組織勻漿上清液。利用ELISA檢測(cè)試劑盒分別測(cè)定小鼠肝組織上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6含量,并使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)肝組織上清液蛋白質(zhì)量濃度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。
1.3.7 蛋白免疫印跡法檢測(cè)蛋白相對(duì)表達(dá)水平
稱取0.1 g小鼠肝組織,加入含蛋白酶/磷酸酶抑制劑和苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)的RIPA裂解液,在制冷型生物樣品均質(zhì)儀中進(jìn)行組織勻漿,測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品高溫變性后,經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE),濕法轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上。室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h,分別加入p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK、JNK、p-p38、p38、p-NF-κB p65、NF-κB p65和GAPDH一抗(1∶1 000,TBST稀釋),4 ℃孵育12 h,TBST洗滌3 次后,加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h,TBST再次洗滌3 次后,通過(guò)增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(enhanced chemiluminescence,ECL)顯色,采用5200 multi全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像處理系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)進(jìn)行圖像分析,ImageJ軟件進(jìn)行蛋白條帶灰度分析,以GAPDH作為內(nèi)參,分析目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平,蛋白的磷酸化水平以磷酸化蛋白與對(duì)應(yīng)蛋白條帶灰度的比值表征。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,采用Tukey’s事后檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析。當(dāng)<0.05時(shí),表示組間差異顯著。
如表2所示,各組小鼠體質(zhì)量無(wú)顯著性差異(>0.05),但與Control組相比,LPS組小鼠肝臟質(zhì)量和肝指數(shù)極顯著升高(<0.01),但DHA-PL和EPA-PL預(yù)防性干預(yù)可明顯抑制LPS所致小鼠肝質(zhì)量以及肝指數(shù)的增加。
表2 DHA-PL和EPA-PL對(duì)LPS處理后小鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量和肝指數(shù)的影響(n=8)Table 2 Effects of DHA-PL and EPA-PL on body mass, liver mass and hepatic index in LPS-treated mice (n = 8)
ALT和AST是反映肝損傷最敏感的指標(biāo)。如圖1所示,與Control組相比,LPS組小鼠血清ALT和AST活力極顯著升高(<0.01),而DHA-PL和EPA-PL預(yù)防性干預(yù)可有效抑制ALT(<0.01)和AST活力(<0.01、<0.05)的升高。
圖1 DHA-PL和EPA-PL對(duì)LPS處理后小鼠血清ALT(A)和AST(B)活力的影響Fig. 1 Effects of DHA-PL and EPA-PL on serum ALT (A) and AST (B)activities in LPS-treated mice
各組小鼠肝組織蘇木精-伊紅染色結(jié)果如圖2所示,正常小鼠肝組織形態(tài)正常,肝細(xì)胞胞質(zhì)豐富,無(wú)病變、無(wú)壞死、無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn),肝小葉結(jié)構(gòu)清晰完整,肝細(xì)胞索呈放射狀排列。LPS作用6 h后可見(jiàn)小鼠肝組織受損明顯,大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。DHA-PL和EPA-PL預(yù)防性干預(yù)后小鼠肝組織病變較輕,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)不明顯。上述結(jié)果提示,DHA-PL和EPA-PL預(yù)防性干預(yù)可有效保護(hù)LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷。
圖2 DHA-PL和EPA-PL對(duì)LPS處理后小鼠肝組織形態(tài)學(xué)變化的影響(200×)Fig. 2 Effects of DHA-PL and EPA-PL on hepatic histopathology in LPS-treated mice (200 ×)
如圖3所示,與Control組相比,LPS組小鼠肝臟中TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)水平和含量極顯著升高(<0.01);DHA-PL和EPA-PL預(yù)防性干預(yù)可極顯著抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)水平以及含量的增加(<0.01)。
圖3 DHA-PL和EPA-PL對(duì)LPS處理后小鼠肝臟中促炎細(xì)胞因子mRNA相對(duì)表達(dá)水平(A)和含量(B)的影響Fig. 3 Effects of DHA-PL and EPA-PL on mRNA levels (A) and contents (B) of pro-inflammatory cytokines in LPS-treated mice
MAPK和NF-κB信號(hào)通路被認(rèn)為是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵信號(hào)通路。蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與Control組相比,LPS組小鼠肝臟中p-ERK1/2/ERK1/2、p-JNK/JNK、p-p38/p38及p-NF-κB p65/NF-κB p65極顯著上調(diào)(<0.01);DHA-PL和EPA-PL預(yù)防性干預(yù)可有效抑制ERK1/2、JNK、p38以及NF-κB p65蛋白的磷酸化(圖4)。上述結(jié)果提示DHA-PL和EPA-PL可能通過(guò)抑制MAPK和NF-κB信號(hào)通路的激活改善LPS誘導(dǎo)的肝組織炎癥反應(yīng)。
圖4 DHA-PL和EPA-PL對(duì)LPS處理后小鼠肝臟中MAPKs和NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平的影響Fig. 4 Effects of DHA-PL and EPA-PL on protein expression of key factors involved in MAPKs and NF-κB signaling pathways in LPS-treated mice
急性肝損傷是以肝功能迅速惡化為臨床特點(diǎn)的急性綜合征,嚴(yán)重者會(huì)出現(xiàn)肝臟大面積壞死甚至肝衰竭,病死率較高。研究表明,腸道來(lái)源的內(nèi)毒素是造成肝功能損傷的重要因素,在LPS刺激下,肝竇狀隙內(nèi)的枯否細(xì)胞發(fā)生M1型極化,可分泌大量促炎細(xì)胞因子,導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷,并可分泌趨化因子招募中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞進(jìn)入肝臟,進(jìn)一步加重炎癥介導(dǎo)的肝損傷。
南海鳶烏賊卵和冰島刺參體壁富含DHA和EPA,且主要結(jié)合在甘油磷脂的-2位上,磷脂在小腸中被磷脂酶A催化釋放游離型DHA和EPA以及溶血磷脂,溶血磷脂在小腸細(xì)胞中重新合成磷脂,被機(jī)體吸收利用。研究發(fā)現(xiàn),-3系多不飽和脂肪酸和磷脂具有護(hù)肝作用,但鮮見(jiàn)DHA-PL和EPA-PL對(duì)急性肝損傷影響的報(bào)道。因此,本研究通過(guò)腹腔注射LPS模擬急性肝損傷的病理過(guò)程,考察DHA-PL和EPA-PL對(duì)急性肝損傷是否具有保護(hù)作用。當(dāng)肝組織受損時(shí),肝細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被破壞,通透性增加,導(dǎo)致肝細(xì)胞中ALT和AST大量釋放入血,從而使血清中ALT和AST活力升高。通過(guò)比較各組小鼠血清中ALT和AST活力發(fā)現(xiàn),DHA-PL和EPA-PL預(yù)防性干預(yù)可顯著降低LPS暴露引起小鼠血清ALT和AST活力的升高(<0.01、<0.05),提示DHA-PL和EPA-PL能有效緩解LPS誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷。肝組織病理學(xué)結(jié)果顯示,DHA-PL和EPA-PL預(yù)防性干預(yù)可明顯減少LPS誘導(dǎo)的小鼠肝細(xì)胞中炎性細(xì)胞浸潤(rùn),保護(hù)肝組織結(jié)構(gòu)正常。促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6等作為反映炎癥水平的指標(biāo),在急性肝損傷進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),DHA-PL和EPA-PL預(yù)防性干預(yù)可明顯下調(diào)LPS誘導(dǎo)的小鼠肝臟中TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)水平和含量的升高,且其效果相近。上述結(jié)果提示,DHA-PL和EPA-PL可有效降低LPS誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠肝臟的炎癥水平。
MAPKs是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的一類絲、蘇氨酸蛋白激酶,目前研究最廣泛的是ERK1/2、JNK和p38。LPS可激活ERK1/2、JNK和p38,導(dǎo)致核轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)活化后進(jìn)入細(xì)胞核,進(jìn)而促使肝組織中枯否細(xì)胞釋放大量炎癥介質(zhì),誘發(fā)炎癥反應(yīng)。NF-κB是炎癥反應(yīng)中另一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,LPS可誘導(dǎo)其活性亞基p65進(jìn)入細(xì)胞核,促使細(xì)胞內(nèi)TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎細(xì)胞因子大量釋放,隨后進(jìn)一步活化NF-κB,形成炎癥“瀑布效應(yīng)”,加重肝損傷程度。本研究結(jié)果表明,LPS可誘導(dǎo)小鼠肝臟中ERK1/2、JNK、p38以及NF-κB p65磷酸化水平上升,DHA-PL和EPA-PL預(yù)防性干預(yù)可有效降低小鼠肝臟中上述蛋白的磷酸化水平。該結(jié)果提示DHA-PL和EPA-PL可能通過(guò)陰斷MAPK和NF-κB信號(hào)通路的激活進(jìn)而發(fā)揮其對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用。另外,本研究發(fā)現(xiàn)DHA-PL和EPA-PL保護(hù)LPS所致小鼠急性肝損傷的效果大致相同,這或許與雖然DHA對(duì)促炎細(xì)胞因子的抑制作用更加廣泛,但EPA-PL的消化吸收速率慢于DHA-PL,可使動(dòng)物血液中EPA長(zhǎng)時(shí)間維持在較高水平有關(guān)。
綜上,DHA-PL和EPA-PL均可有效保護(hù)LPS所致急性肝損傷,保護(hù)效果接近,且其抗炎保肝作用依賴于其對(duì)MAPK和NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控。本研究結(jié)果為南海鳶烏賊和冰島刺參等水產(chǎn)品的高值化利用以及開(kāi)發(fā)具有保肝護(hù)肝的新型保健食品提供了理論基礎(chǔ)。